Laccase-Mediator System som använder en naturlig mediator som ett vitmedel för avfärgning av melanin Del 1

Abstrakt: I denna studie utvecklades ett laccase-mediator system (LMS) som använder en naturlig mediator som ett blekningsmedel för melaninavfärgning. Sju naturliga mediatorer användes för att ersätta syntetiska mediatorer och framgångsrikt övervinna den låga redoxpotentialen hos laccas och begränsad tillgång för melanin till det aktiva stället för laccas. Melaninavfärgningsaktiviteten hos laccaser från Trametes versicolor (lacT) och Myceliophthora thermophila (lacM) förbättrades signifikant med användning av naturliga mediatorer inklusive acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon, som visade låg cytotoxicitet. Metoxi- och ketongrupperna av naturliga mediatorer spelar en viktig roll vid avfärgning av melanin. Specificitetskonstanterna för lacT och lacM för melaninavfärgning ökade med 247 respektive 334 när acetosyringon användes som mediator. LMS som använder spets och acetosyringon kan också avfärga melaninet som finns i cellulosahydrogelfilmen, vilket efterliknar hudtillståndet. Dessutom kunde LMS avfärga inte bara syntetiska eumelaninanaloger framställda genom oxidation av tyrosin utan också naturligt melanin producerat av melanomceller.

Enligt relevanta studier,cistancheär en vanlig ört som är känd som "mirakelörten som förlänger livet". Dess huvudkomponent ärcistanosid, som har olika effekter som t.exantioxidant, antiinflammatorisk, ochfrämjande av immunförsvaret. Mekanismen mellan cistanche ochblekning av hudenligger i cistanches antioxidanteffektglykosider. Melanini mänsklig hud produceras genom oxidation av tyrosin katalyserad avtyrosinas, och oxidationsreaktionen kräver deltagande av syre, så de syrefria radikalerna i kroppen blir en viktig faktor som påverkar melaninproduktionen. Cistanche innehållercistanosid, som är en antioxidant och kan minska genereringen av fria radikaler i kroppen, alltsåhämmar melaninproduktionen.

Klicka på Rou Cong Rong fördelar för blekning

För mer information:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Introduktion

Laccaser (EC 1.10.3.2, bensendiol: dioxygenoxidoreduktaser) är multikopparproteiner som katalyserar oxidationen av olika fenoliska och icke-fenoliska föreningar via en radikalkatalyserad reaktionsmekanism genom reduktion av molekylärt syre [1,2]. Laccaser har använts som biokatalysatorer för biologiska nedbrytningsprocesser, såsom bioremediering av färgämnen [3,4], läkemedel [5,6], herbicider [7] och delignifiering [8-10]. Laccaser har också använts för att katalysera polymerisationen av färgämnesprekursorer och organiska föreningar [11]. I synnerhet deras attraktiva egenskaper, såsom låg substratspecificitet, användningen av syre som den slutliga elektronacceptorn, genereringen av vatten som en biprodukt och ingen efterfrågan (eller ingen produktion) av peroxider, gör dem intressanta inom bioteknologiska och miljöfält [1,11,12].

Fyra kopparjoner på det aktiva stället är involverade i den katalytiska aktiviteten av laccas. "Blå" koppar (T1-ställe) oxiderar substratet, och det trinukleära kopparklustret (T2/T3) tar emot elektronerna från T1-stället för att reducera det molekylära syret [1,12,13]. Särskilt redoxpotentialen för T1-stället Cu anses vara en viktig faktor för att bestämma den katalytiska förmågan hos laccaser [14]. Laccaser har en relativt låg redoxpotential (0,4–0,8 V) jämfört med ligninolytiska peroxidaser (över 1 V) såsom manganperoxidas och ligninperoxidas. Laccaser kan inte direkt oxidera icke-fenoliska substrat med en redoxpotential över 1,3 V [13,14]. Därför, för att övervinna begränsningarna hos laccas, laccas-mediator system (LMS) som använder små molekylära föreningar, såsom 2,20 -azinobis(3- etylbenstiazolin-6-sulfonat) (ABTS), { {24}}hydroxibensotriazol (HOBt), fiolsyra (VLA), N-hydroxiftalimid (HPI), N-hydroxiacetanilid (NHA) och TEMPO, som fungerar som redoxmediatorer, har föreslagits [15–17].

Dessa mediatorer tillåter oxidation av skrymmande föreningar via olika oxidationsvägar. Laccas-ABTS-systemet oxiderar substrat genom att generera en katjonisk ABTS-radikal via en elektronöverföringsmekanism (ET). LMS med HOBt, VLA, HPI eller NHA producerar nitroxylradikaler via väteatomöverföringsmekanismen (HAT) [1,12,17]. Vidare reagerar mediatorer som TEMPO och dess analoger via joniska vägar för att generera oxoammoniumjoner [1,12,18]. Användningen av dessa mediatorer kan oxidera ett brett spektrum av föreningar i olika tillämpningar, såsom färgämnesnedbrytning [3,4], läkemedelsnedbrytning [5,6] och ligninnedbrytning [8-10]. Ändå har tillämpningarna av syntetiska mediatorer inom industriella områden varit begränsade på grund av deras potentiella toxicitet, höga kostnader och enzyminaktiveringseffekt. Nyligen har lignin-härledda fenolmolekyler som naturliga mediatorer (t.ex. syringaldehyd, acetosyringon, vanillin, acetovanillon, metylvanillat, ferulsyra, sinapinsyra, p-kumarsyra, etc.) studerats för att ersätta syntetiska mediatorer [1,12] . Fördelarna med naturliga mediatorer är låg kostnad och låg toxicitet eftersom de erhålls från naturliga och förnybara källor [19].

Melanin är en grupp naturliga pigment som produceras genom melanogenes genom oxidativ polymerisation av tyrosin av melanocyter. Naturligt melanin kan delas in i fem kategorier av eumelanin, pheomelanin, alla melanin, pheomelanin och neuromelanin [20]. Nyligen har olika medicinska och elektrokemiska tillämpningar som använder melanin eller melaninprekursorer studerats [20,21]. Människans hudfärg bestäms mestadels av närvaron av melanin. Inom den kosmetiska industrin har direkt depigmentering av melanin med hjälp av enzymer föreslagits för utveckling av hudblekande medel. Flera peroxidaser har studerats för att avfärga melanin. Woo et al. visade att syntetiskt melanin kan avfärgas direkt av ligninperoxidas från P. chrysosporium [22]. Keneko- och Mohorˇciˇc-grupperna rapporterade också den enzymatiska avfärgningen av melanin av manganperoxidas isolerat från svampar (Sporotrichum pruinose och Phlebia radiata) [23,24]. Kim et al. rapporterade att råa enzymblandningar innehållande manganperoxidas, ligninperoxidas och lackas visade melanin depigmenteringsaktivitet [25]. När peroxidaser avfärgar melanin, kräver de väteperoxid (H2O2) som en kofaktor som kan irritera huden. Således, för att minska användningen av H2O2, introducerades glukosoxidas eller laccas i enzymkombinationssystemet [26,27]. Laccaser kan avfärga melanin utan användning av väteperoxid. Khammuang och Sarnthima rapporterade att laccas från Lentinus polycarpous Lév visade melaninavfärgningsaktivitet med hjälp av ABTS, vanillin och vaniljsyra som mediatorer [28].

2. Material och metoder

2.1. Material

2.2. Melaninavfärgning av LMS

Den mättade melaninlösningen (1,4 mg/ml) framställdes genom upplösning av 3 mg syntetiskt melanin i 1,3 ml 10 mM NaOH. Lösningen centrifugerades vid 85 00 rpm i 5 minuter för att avlägsna olöst melanin, och supernatanten späddes med 0.1 M citronsyrafosfatbuffert (pH 3, 4, 5, 5,5, 6 eller 7) och används som en substratlösning för LMS. Koncentrationen av melanin i substratlösningen var 63 µg/ml och spektrofotometriskt bekräftad vid 475 nm. 0,8 mL melaninsubstratlösning blandades med 0,1 mL mediatorlösning (0–1 mM) i ett 1,5 mL Eppendorf-rör. Melaninavfärgningsreaktionen initierades genom att tillsätta 0,1 ml laccaslösning (15,8 µg (0,6 U) lacT eller 19,2 µg (1,8 U) lacM) till en blandning av melanin och mediatorn vid 25 ◦C i ett skakvattenbad vid 120 rpm . Efter reaktionen centrifugerades reaktionsblandningen och absorbansen av supernatanten mättes vid 475 nm. Avfärgningsutbytet (procent) beräknades med hjälp av följande ekvation:

Avfärgning ( procent ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Kinetisk studie av melaninavfärgning av LMS

2.4. Cytotoxicitet hos naturliga mediatorer

B16F10 melanomcellinjen (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) användes för att bestämma cytotoxiciteten hos naturliga mediatorer för LMS. En neutral röd (NR) analys utfördes för att mäta cytotoxiciteten hos mediatorerna [29]. NR mäter livsdugligheten hos levande celllysosomer. Melanomceller med en koncentration av 3 × 104 celler fördelades i varje brunn i en 96-brunnsplatta. Efter 24 timmars odling behandlades cellerna med naturliga mediatorer (1, 2, 5, 10, 22 och 46 mM). Efter ytterligare odling i 2 dagar behandlades cellerna med 50 µg/ml NR-lösning upplöst i DMEM och inkuberades i 3 timmar. Efter avlägsnande av supernatanten genom sug användes en NR-desorberingslösning (1 procent isättika, 49 procent etanol och 50 procent destillerat vatten) för färgextraktion. Efter extraktionsprocessen mättes förändringen i absorbans vid 540 nm.

2.5. Beredning och avfärgning av melanin/cellulosahydrogelfilmen

För att mäta avfärgningsaktiviteten hos LMS för melanin/cellulosafilmen skars den preparerade hydrogelfilmen till ett 1 x 2 cm ark. Hydrogelfilmen nedsänktes i 4 ml 0.1 M citronsyrafosfatbuffert (pH 5,5); därefter sattes 0,5 mL 1 mM acetosyringon och 0,5 mL spetslösning (2,5 U) till bufferten. Avfärgningsreaktionen utfördes i ett vattenbad med skakning vid 120 pm och 25 ◦C under 3 timmar. Efter reaktionen tvättades filmen med destillerat vatten och fästes på insidan av kyvetten för att mäta förändringen i spektrat i intervallet 400–800 nm med hjälp av en UV/Vis-spektrofotometer. Kontrollreaktioner utan lacM eller mediatorer utfördes också under samma betingelser. Frisättningen av melaninet från filmen eller färgförändringen av melanin/cellulosafilmen detekterades inte under reaktionsbetingelserna. Dessutom registrerades förändringen i färgparametrar (L*, a* och b*-värden) för melanin/cellulosafilmen efter avfärgningsreaktionen med LMS med användning av en kolorimeter (KONICA MI NOLTA, Tokyo, Japan). Värdena ∆L (metrisk ljushetsskillnad), ∆E (total färgskillnad), YI (gulhetsindex) och WI (vithetsindex) erhölls med hjälp av följande ekvationer [30–32]:

2.6. Beredning av naturligt melanin

Naturligt melanin erhölls från B16F10 melanomceller. Cellerna behandlades med alfa-melanocytstimulerande hormon för att producera melanin. Efter 4 dagars inkubation fångades cellerna med användning av trypsin-EDTA och sonikerades i 10 minuter. Supernatanten erhölls genom centrifugering vid 8000 rpm under 10 min och justerades sedan till pH 1,5 med användning av 6 M HCl. Lösningen kokades vid 100 ◦C i 4 timmar för att hydrolysera de kvarvarande proteinfraktionerna. Lösningen innehållande naturligt melanin tvättades med aceton, följt av kloroform och etanol, och tvättades sedan med avjoniserat vatten för att eliminera rester, såsom celler, mediakomponenter och proteinfraktioner [33,34]. Alla tvättprocesser utfördes mer än två gånger. Slutligen erhölls naturligt melanin genom frystorkning och användes som ett substrat för LMS.

3. Resultat och diskussion

3.1. Effekten av medlare på melaninavfärgning av LMS

Effekten av olika mediatorer på melaninavfärgningsreaktionen med LMS undersöktes med användning av två laccaser från T. versicolor (lacT) och M. thermophila (lacM) (Figur 1).När lacT användes utan mediator för melaninavfärgning var avfärgningsutbytet endast 1 procent efter 5 timmars reaktion. När HOBt användes som en mediator för lacT, ökades avfärgningsutbytet något till 2 procent efter 5 timmars reaktion. Användningen av olika syntetiska mediatorer, såsom HOBt, ABTS, VLA och TEMPO, i den laccaskatalyserade oxidationen av fenoliska eller icke-fenoliska föreningar förbättrade reaktionshastigheterna signifikant [10,15]. När åtkomsten av målföreningar till det aktiva stället för laccas begränsas av deras steriska hinder, kan mediatorradikaler som bildas av laccas effektivt oxidera målföreningarna genom elektronöverförings- eller väteatomöverföringsmekanismen [12]. HOBt är en av de mest använda syntetiska mediatorerna i LMS på grund av dess höga redoxpotential (1,1 V) [6]. HOBt är dock inte en bra kosmetisk ingrediens på grund av dess potentiella celltoxicitet och förmåga att inaktivera laccas. Således valde vi sju naturliga mediatorer, acetosyringon, syringaldehyd, p-kumarsyra, vanillin, vaniljsyra, vanillylalkohol och acetovanillon, för melaninavfärgningsreaktionen med LMS. Intressant nog fungerar alla naturliga mediatorer som mer effektiva mediatorer än HOBt för melaninavfärgning på grund av brist. När acetosyringon, syringaldehyd och p-kumarsyra användes var avfärgningsutbytena 28 procent, 22 procent respektive 18 procent efter 5 timmars reaktion. Dessa resultat visar användbarheten av naturliga mediatorer för melaninavfärgningsreaktionen av LMS. Mediatorerna i LMS oxideras till mediatorradikaler av laccase, och mediatorradikalerna inducerar oxidation och avfärgning av melanin. När brist användes utan mediator för melaninavfärgning under en tillräcklig reaktionstid, som kunde nå jämviktstillståndet, var avfärgningsutbytet 7 procent efter 24 timmars reaktion. De naturliga mediatorerna, förutom vaniljsyra, fungerar som mer effektiva mediatorer än HOBt för melaninavfärgning med lacT efter 24 timmars reaktion. Avfärgningsutbytet efter 24 timmars reaktion med användning av vaniljsyra som mediator var lägre än efter 5 timmars reaktion. Detta kan orsakas av den låga stabiliteten hos den oxiderade radikalformen av vaniljsyra. När acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon användes var avfärgningsutbytet 34 procent, 30 procent respektive 31 procent efter en 24 timmars reaktion. p-kumarsyra var mer effektiv för att öka den initiala reaktionshastigheten än acetovanillon, medan acetovanillon inducerade ett högre avfärgningsutbyte vid jämviktstillståndet än p-kumarsyra.

Effekten av mediatorn på avfärgningsreaktionen med LMS med användning av lacM var också mycket lik den som erhölls av LMS med användning av lacT. När spets användes utan mediator för melaninavfärgning var avfärgningsutbytet endast 2 procent efter 5 timmars reaktion. HOBt som mediator för lacM ökade inte avfärgningsutbytet under 5 timmars reaktionen. Alla naturliga mediatorer, förutom p-kumarsyra och vanillin, fungerade som effektiva mediatorer av melaninavfärgning med lacM. När acetosyringon och syringaldehyd användes var avfärgningsutbytena 25 procent respektive 22 procent efter 5 timmars reaktion. p-kumarsyra och vanillin användes som effektiva mediatorer för var och en, men de kunde inte effektivt öka avfärgningshastigheten i LMS med spets. Detta kan orsakas av den lägre substratspecificiteten hos lacM för p-kumarsyra och vanillin. Avfärgningsutbytena efter 24 timmars reaktion av lacM med p-kumarsyra och vanillin liknade de som erhölls med lacT. Detta indikerar att de oxiderade formerna av p-kumarsyra och vanillin effektivt kan avfärga melanin, även om deras oxidationshastighet av lacM var mycket lägre än den med lacT. När lacM utan mediator användes för melaninavfärgning under en tillräcklig reaktionstid var avfärgningsutbytet 5 procent efter 24 timmars reaktion. De naturliga mediatorerna, förutom vaniljsyra, fungerar också som mer effektiva mediatorer än HOBt för melaninavfärgning med lacM efter 24 timmars reaktion. När acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon användes som mediatorer för lacM, var avfärgningsutbytena 34 procent, 28 procent respektive 31 procent efter 24 timmars reaktion. När vaniljsyra användes som mediator för både lacT och lacM, visade den det lägsta avfärgningsutbytet. Detta kan orsakas av den låga stabiliteten hos den oxiderade radikalformen av vaniljsyra. Khammuang och Sarnthima rapporterade att vanillin och vaniljsyra kunde användas som mediatorer för melaninavfärgning med laccas från Lentinus polycarpous [28]. De visade dock mycket lägre avfärgningsaktivitet för melanin än acetosyringon när de användes som mediatorer för lacT och spets.

Dessa resultat indikerar att naturliga mediatorer är mer effektiva för melaninavfärgning med LMS än HOBt. HOBt har ansetts vara en effektiv syntetisk mediator för laccas på grund av dess höga redoxpotential och den katalytiska rollen för N OH-gruppen av HOBt [5]. Effektiviteten hos mediatorer för att oxidera målsubstrat är starkt beroende av förmågan att bilda stabila radikaler såväl som det steriska hindret orsakat av skrymmande alkylsubstituenter snarare än redoxpotentialen hos mediatorerna [19,35]. Den låga stabiliteten hos den oxiderade mellanprodukten av HOBt har bestämts genom cyklisk voltammetri [6]. Därför kan det låga avfärgningsutbytet av LMS med användning av HOBt orsakas av den låga stabiliteten hos HOBt under reaktionsbetingelserna för laccas. Även om redoxpotentialen för syringaldehyd var lägre än den för HOBt, visade syringaldehyd relativt högre stabilitet än HOBt [6].

Som visas i figur 2 har de naturliga mediatorerna som används i detta arbete olika substituenter (t.ex. hydroxyl, metoxi, karboxyl, keton eller aldehyd) i olika positioner på bensenringen [12,19]. Mediatorer med två metoxigrupper (acetosyringon och syringaldehyd) visade högre avfärgningshastigheter än de med en metoxigrupp. Avfärgningshastigheten som erhölls med p-kumarsyra utan metoxigrupp var beroende av typen av laccas. P-kumarsyran med lacT visade en högre avfärgningshastighet än de med en metoxigrupp, medan p-kumarsyra med lacM visade den lägsta avfärgningshastigheten i 5 timmars reaktionen. Fillat et al. visade också liknande resultat för avfärgning av flexografiska bläck av svamplaccaser med naturliga mediatorer [36]. De fenoliska naturliga mediatorerna (acetosyringon, metylspruta och syringaldehyd) med två metoxisubstituenter i ringen oxiderades av laccas snabbare än p-kumarsyra utan metoxigrupp. Detta indikerar att metoxigrupper spelar en viktigare roll som elektrondonatorer än dubbelbindningen i den laterala kedjan av p-kumarsyra. När mediatorerna med en metoxigrupp jämfördes ökade avfärgningsutbytet i följande ordning: acetovanillon > vanillin > vanillylalkohol > vaniljsyra. Acetovanillon, som har en ketongrupp, visade en högre avfärgningshastighet och ett högre utbyte än mediatorerna med aldehyd-, hydroxyl- och karboxylgrupper. Acetosyringon med en ketongrupp visade också en högre avfärgningshastighet och högre utbyte än syringaldehyd med en aldehydgrupp.

I följande experiment valdes acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon, som visade hög melaninavfärgningsförmåga, som mediatorer för LMS för att avfärga melanin. Effekten av mediatorn på avfärgningsreaktionen av LMS undersöktes över tiden (Figur S1). Avfärgningsreaktionen med användning av lacT med acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon resulterade i 21 procent, 18 procent respektive 1 procent avfärgningsutbyten efter 1 timmes reaktion. Avfärgningsreaktionen med användning av lacM med acetosyringon och syringaldehyd resulterade i 19 procent respektive 18 procent avfärgningsutbyten efter 1 timmes reaktion. Båda laccaserna visade liknande reaktionsprofiler när samma mediator användes. Acetosyringon och syringaldehyd ökade signifikant avfärgningshastigheten under den initiala reaktionen. Dessa resultat visar att acetosyringon och syringaldehyd innehållande dimetoxigrupper var mer effektiva för att öka den initiala hastigheten för avfärgning av LMS än acetovanillon innehållande en metoxigrupp. Fillat et al. rapporterade också att metoxigrupperna i ringstrukturerna hos mediatorer fungerar som acceleratorer för oxidation av substrat [36]. Å andra sidan var avfärgningsutbytet efter 24 timmars reaktion med acetovanillon liknande det med syringaldehyd, även om acetovanillon måttligt ökade reaktionshastigheten.

För mer information: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501