Studie på de mikrobiella enzymerna som producerats under kombinerad bakteriell jäsning och deras biologiska aktiviteter ⅲ

Kapitel 3 Studie om antioxidantaktiviteten hos enzymer

 

Många mänskliga sjukdomar har visat sig vara relaterade tillaktivt syre och fria radikalertill exempelinflammation, arterioskleros,åldrande, diabetes, cancerosv.Överdrivna fria radikalerI kroppen kan det orsaka protein denaturering, cellskador och död och till och med patologiska förändringar i kroppen. Därför letar många studier hemma och utomlands efter livsmedel som är rika på naturliga antioxidantingredienser för att förhindra och reglera sjukdomar orsakade av fria radikaler genom kost. Idag, med de ökande levnadsstandarden, flyttar människor gradvis sitt fokus till sina egna kroppar, så att fler och fler hälsoprodukter dyker upp i en oändlig ström. Det är dock inte lätt att vara riktigt användbar. Enzymer är en typ av mat som kan göras själv i människors liv. Kostnaden är inte särskilt hög och det finns många fördelar.
Mikrobiella enzymer har en mängd olika hälsofunktioner såsom antibakteriella och antiinflammatoriska, främjande av metabolism, förbättring av immunitet, blekning och anti-aging, avgiftning och anti-cancer. För närvarande finns det relativt få studier på antioxidantegenskaperna hos mikrobiella enzymer hemma och utomlands, så vi planerar att bedriva djupgående forskning om dem. Detta dokument tar Apple -enzym som forskningsobjekt och använder det totala fenolinnehållet och minskar kraften, DPPH · Fri radikal, · OH FRI RADICAL, Superoxide Free Radical och ABTS Free Radical Scavenging Ability som bestämning indexerar att genomföra en omfattande och systematisk undersökning av Apple -enzym efter jäsning i 3 månader. Kompositionen och innehållet i antioxidantaktiva ingredienser studerades och dess antioxidantaktivitet förstås.

Nya örter Cistanche med mycket mer antioxidationskraft än bakteriefermentering

Stödjande tjänst för Wecistanche den största cistanche-exportören i Kina:
E -post: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Material och metoder

3.1.1 Material

(1) Experimentella material
Tvätta färska äpplen med sterilt vatten under sterila förhållanden, torka dem naturligt i ett sterilt operationsbord, skala dem och skiva dem för senare användning. Tillsätt vitt socker och äpplen i en steriliserad glasburk i ett massförhållande av 1: 1. Aktivera de bakterier som krävs för experimentet och ympla dem i enzymet enligt det optimala schemat (detta operationssteg utelämnas i kontrollgruppen), försegla det och placera det på en sval och torr plats. Efter 3 månaders jäsning av rumstemperatur, ta ett prov för att erhålla hela enzymvätskan som innehåller massa och filtrera den. Ta supernatanten som det experimentella provet och centrifugera provet vid 10000 rpm i 15 minuter i en höghastighetscentrifug innan du bestämmer relevant data. Det är värt att notera att alla våra operationer genomförs under sterila förhållanden i processen att göra enzymer för att undvika onödig förorening.

(2) Huvudinstrument
Spektrofotometer: v -1100, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory;
Konstant temperaturvattenbad: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Andra instrument är desamma som 2.1.3.

3.1.2 Metoder

(1) Bestämning av totalt fenolinnehåll [53]
① Förberedelse av standardkurva:
Väg dig exakt {{0}}. 123 g gallinsyra, lös den i en liten mängd destillerat vatten och överför den till en 5 0 0 ml volymkolv för att göra volymen. Take 8 clean 1{{10}} mL volumetric flasks, add 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, and 1.4 mL of gallic acid standard solution, respectively, dilute to the mark with distilled water, add 1 mL of Folin reagent and 2 mL of 20% NaCO3 to each, heat in a boiling water bath for 1 Min, sval och utspädd till 20 ml och placera vid rumstemperatur under 30 minuter. Använd en spektrofotometer för att mäta absorbansen A vid en våglängd av 650 nm och rita en standardkurva med absorbans A som den horisontella axeln och provkoncentrationen som den vertikala axeln. ② Upptäckt
Add distilled water to 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL sample solutions to 46mL, then add 1mL of Folin-phenol reagent, mix evenly, react for 3min, then add 3mL of 20% NaCO3, shake in a 25 degree constant temperature water bath for 2h, use distilled water as blank control, and measure its absorbance A at a wavelength of 760nm with a Spektrofotometer. Det totala fenolinnehållet uttrycks som gallinsyraekvivalenter, och det totala fenolinnehållet beräknas enligt standardkurvanekvationen.

(2) reduktionsanalys [54]
Add 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL of sample to 2.5mL of phosphate buffer with a concentration of 0.2mol/L and a pH value of 6.6, then add 2.5mL of potassium ferricyanide (w/v) with a mass concentration of 1%, and react at 50 examen i 30 minuter. Tillsätt sedan 2,5 ml triklorättiksyra (vikt/volym) med en masskoncentration på 10%och centrifug vid 3000 rpm under 10 minuter i en höghastighetscentrifug. Omedelbart efter att ha tagit ut, ta 2,5 ml supernatant i en volymetrisk kolv, tillsätt 2,5 ml destillerat vatten och 0,5 ml järnklorid (vikt/volym) med en masskoncentration av 0,1%. Använd destillerat vatten som en tom kontroll och mät absorbansen A vid en våglängd av 700Nm med en spektrofotometer. Styrkan i att minska kraften kan bedömas utifrån absorbansvärdet. Ju högre absorbansvärde, desto starkare är minskande kraft.

 

(3) Bestämning av superoxidanjonfri radikal rensningseffekt [55]

Ta 4,5 ml 0. 0 5 mol/l pH 8,2 Tris-HCl-buffert och förvärm den i ett 25 graders vattenbad för 2 0 min. Tillsätt 1 ml enzymprovlösning med koncentrationer av 10%, 20%, 30%, 40%och 50%och 0,4 ml 25 mmol/L pyrogallolllösning respektive. Blanda väl och reagera i ett 25 graders vattenbad i 5 minuter. Tillsätt 1,0 ml 8 mol/L HCl för att avsluta reaktionen. Använd TRIS-HCL-buffert som referens och använd en spektrofotometer för att mäta absorbansen A vid en våglängd av 299 nm för att beräkna rensningshastigheten. För den tomma kontrollgruppen användes 1 ml lösningsmedel istället för prov. O 2- rensningshastigheten beräknades enligt formel 3.1: o 2- rensningshastighet (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1) där: a1 är absorbansen av det tomma röret; A2 är provets absorbans.

(4) Bestämning av rensningseffekt på hydroxylradikaler [56]

100μL, 200μL, 300μL, 400μL, 500μL sample solution was added with water to 2mL, then added to 1.4mL of hydrogen peroxide with a molar mass concentration of 6mmol/L, then added with 0.6mL of sodium salicylate with a molar mass concentration of 20mmol/L and 2mL of ferrous sulfate with a molar mass concentration of 1,5 mmol/L, och upphettas i ett konstant temperaturvattenbad vid 37 grader för 1 timme. Justera till noll med destillerat vatten och mät absorbansen A vid en våglängd av 562 nm med användning av en spektrofotometer. Utför 3 replikat för varje behandling. Beräkna den hydroxylradikala rensningshastigheten enligt formel 3.2: Hydroxylradikal rensningshastighet (%)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.2) där: A1 är den genomsnittliga absorbansen för det tomma; A2 är den genomsnittliga absorbansen för provlösningen. (5) Bestämning av DPPH -fria radikala rensningseffekt [57]

Nya örter Cistanche med mycket mer antioxidationskraft än bakteriefermentering

 

Pipett 2 ml enzymprovlösning med koncentrationer av 1 0%, 20%, 30%, 40%och 50%i en 10 ml volymetrisk kolv, tillsätt sedan 2 ml 80%DPPH -etanolvillig lösning till den volymetriska kolven. Den molära masskoncentrationen är 2 × 10-4 mol/l. Låt den stå vid rumstemperatur i 30 minuter efter blandning. Med hjälp av 80% etanollösning som referens, mät absorbansen av provet vid en våglängd av 517 nm, som registreras som A1. Blanda 2 ml DPPH -lösning och 2 ml etanollösning med en masskoncentration av 80% och mät deras absorbans vid samma våglängd, som registreras som A0. Blanda 2 ml enzymlösning och 2 ml etanollösning med en masskoncentration av 80% och mät deras absorbans vid samma våglängd, som registreras som A2. Beräkna DPPH -fria radikala rensningshastighet enligt formel 3.3:
DPPH Free Radical Scavenging Rate (%) {{0}} [1- (A 1- a2)/a {{16}] × 100 (3.3) där: a1 är absorbansen av 2 ml dpph 80% ethanol aqueous -lösning och 2 ml ENZ ENZ ENZ ENZE; A2 är absorbansen av en blandad lösning av 2 ml enzymlösning och 2 ml 80% etanol genom masskoncentration; A0 är absorbansen av en blandad lösning av 2 ml DPPH -lösning och 2 ml 80% etanol genom masskoncentration.

(6) ABTS Free Radical Scavenging -förmåga [58]
Tillsätt en viss mängd kaliumsulfat till 7 mmol/L ABTS -lösning tills den slutliga koncentrationen av den blandade lösningen är 2,45 mmol/L. Placera den blandade lösningen på en sval och torr plats vid rumstemperatur i 12 till 16 timmar. 1 ul, 3 ul, 5 ul, 7 ul och 9 ul provlösning kompletterades till 10 ul med 5 mmol/l pH7.4 fosfatbuffert, och blandades sedan jämnt med 10 ml av ovanstående kaliumsulfat och ABTS blandad lösning och tillåtet att reagera vid en reaktionstemperatur av 30 grader och en reaktionstid på 5MIN. Noll med destillerat vatten och mät absorbansen A vid en våglängd av 734Nm med användning av en spektrofotometer. Beräkna ABTS Free Radical Scavenging Rate enligt formel 3.4:
ABTS Free Radical Scavenging Rate (%)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.4) där: A1 är absorbansen för den tomma kontrollgruppen; A2 är absorbansen för den experimentella gruppen

 

3.2 Resultat och analys

3.2.1 Totalt fenolinnehåll

(1) Standardkurva
Standardkurvan för det totala fenolinnehållet ritades med koncentrationen av gallinsyra som den horisontella axeln och absorbansvärdet A som den vertikala axeln, såsom visas i figur 3.1.

 

Fig.3.1 Standardkurvan för totalt fenolinnehåll

Från Fig.3.1 kan vi se att standardkurvanekvationen är y =11. 375x +0. 2593 (x är provkoncentrationen, y är absorbansen), r 2=0. 9981.

(2) Bestämning av prover

Resultaten av den totala fenolinnehållsbestämningen av Apple -enzymer i kontrollgruppen och experimentgruppen vid olika koncentrationer visas i Fig.3.2.

 

 

 

Fig.3.2 Kurvan för totalt fenolinnehåll

Såsom visas i Fig.3.2 har Apple -enzymerna i både kontrollgruppen och den experimentella gruppen högt totalt fenolinnehåll, och båda ökar med ökningen av mängden tillagd provlösning. I samma koncentrationsgradient ökade det totala fenolinnehållet i Apple -enzymet i kontrollgruppen från 0. 673 mg till 2,8 0 7 mg, och det totala fenolinnehållet i experimentgruppen ökade från 0,961 mg till 4,185 mg. Det totala fenolinnehållet i den experimentella gruppen är mycket högre än för kontrollgruppen, och den uppåtgående trenden är mer uppenbar. Enligt det totala fenolinnehållet är den totala antioxidantaktiviteten för den experimentella gruppen större än kontrollgruppen.

 

3.2.2 Minska kraften

Resultaten av att reducera kraftbestämning av Apple -enzymer i kontrollgruppen och experimentgruppen i olika koncentrationer visas i figur 3.3.

 

Såsom visas i figur 3.3 liknar den förändrade trenden att minska kraften hos äppelenzymer den förändrade trenden för det totala fenolinnehållet. Den minskande kraften hos den experimentella gruppen är högre än för kontrollgruppen, och om det är den experimentella gruppen eller kontrollgruppen, inom koncentrationsområdet som presenteras i experimentet, visar den reducerande kraften en ökande trend med ökningen av mängden provlösning. De experimentella uppgifterna bekräftade också att när det gäller att minska kraften är antioxidantaktiviteten hos experimentgruppen större än kontrollgruppen.

 

 

3.2.3 Superoxidanjonfri radikal rensningsförmåga

Resultaten av superoxidanjonfritt radikal rensningsförmåga hos äppelenzymer i kontrollgruppen och experimentgruppen i olika koncentrationer visas i figur 3.4.

Som visas i figur 3.4 finns det en stor skillnad i superoxidanjonens fria radikala rensningsförmåga mellan experimentgruppen och kontrollgruppen. Inom koncentrationsområdet som presenteras i experimentet förändras den superoxidanjonfria radikala rensningsförmågan hos den experimentella gruppen mest signifikant när provkoncentrationen är 10%till 20%, och förändringen är inte uppenbar efter att koncentrationen är större än 20%; När koncentrationen är 50%är superoxidanjonens fria radikala rensningsförmåga så hög som 85,4%. Den superoxidfria radikala rensningsförmågan som visas av kontrollgruppen kan tydligt ses från trenddiagrammet. När enzymkoncentrationen ökar ökar också denna fria radikala rensningsförmåga, förändras långsamt och tenderar gradvis till ett stabilt tillstånd. Den rensningsförmågan når högst 42,6%. Den experimentella gruppen är nästan dubbelt så hög som kontrollgruppen.

 

 

3.2.4 Hydroxylfri radikal rensningsförmåga

Förändringarna i den hydroxylfria radikala rensningsförmågan hos Apple -enzymerna i kontrollgruppen och experimentgruppen i olika koncentrationer visas i fig. 3.5.

 

 

Fig.3.5 Kurvan för rensande hydroxylfri radikal

 

Det kan ses från fig. 3.5 att inom koncentrationsområdet som presenterades i experimentet ökade den hydroxylfria radikala rensningsförmågan hos enzymerna i experimentgruppen och kontrollgruppen med ökningen av den tillsatta mängden. Den hydroxylfria radikala rensningsförmågan hos den experimentella gruppen var lägre än för kontrollgruppen, och den presterade mycket dåligt vid låga koncentrationer. Vid höga koncentrationer ökade den hydroxylfria radikala rensningsförmågan avsevärt. Anledningen kan vara att under fermenteringsprocessen var typen och innehållet på mikroorganismer i Apple -enzymerna i experimentgruppen och kontrollgruppen olika, och innehållet i de sekundära metaboliterna och komponenterna i varje produkt som producerats genom jäsningen var olika, så att antioxidantkapaciteten visade var annorlunda.

 

3.2.5 DPPH · Fri radikal rensningsförmåga

Jämfört med andra detekteringsmetoder används DPPH · Fri radikal rensningsförmåga i stor utsträckning för att utvärdera antioxidantaktivitet på kort tid [59]. DPPH · Fri radikal rensningsförmåga vid olika koncentrationer planerades enligt resultaten från kontrollgruppen och experimentgruppen Apple -enzymer, såsom visas i figur 3.6.

Såsom visas i figur 3.6, när koncentrationen av kontrollgruppens äppelenzym var lägre än 30%, var den fria radikala rensningsförmågan mindre än 50%, men det experimentella gruppen Apple -enzymet visade också en högre DPPH · Fri radikal rensningsförmåga vid låga koncentrationer. De experimentella resultaten visar att tillsatsen av Aspergillus oryzae, jäst, termofil streptococcus och bulgariska Lactobacillus är fördelaktigt för enzymets fria radikala rensningsförmåga. När enzymkoncentrationen är 50%är denna förmåga så hög som 91,4%, vilket är mycket högre än 69,8%av kontrollgruppen i samma koncentration.

 

3.2.6 ABTS Radical Scavenging -kapacitet

Resultaten av ABTS -radikala rensningskapacitet för Apple -enzymerna i kontrollgruppen och experimentgruppen i olika koncentrationer visas i fig 3.7.

Fig.3.7 Kurvan för ABTS Radical Scavenging -kapacitet
Det kan ses från fig. 3.7 att den rensningshastigheten för Apple -enzymerna i experimentgruppen är högre när enzymtilläggsmängden är större än 5 ul. Studien av Erel et al. visade att rensningskapaciteten hos ABTS -radikaler beror till stor del på den högre koncentrationen av fenoliska ämnen [60]. Resultaten av det totala bestämningen av fenolinnehåll visade att det totala fenolinnehållet i experimentgruppen var högre än för kontrollgruppen. De experimentella resultaten i fig.

 

3.3 Sammanfattning av detta kapitel

Detta kapitel studerar förhållandet mellan antioxidantaktiviteten hos äppelenzymer som produceras genom fermentering med fyra utvalda stammar av äpplen, koncentrationen av enzymprover och jämförelse av antioxidantaktiva komponenter och fria radikala rensningsförmåga mellan experimentgruppen och kontrollgruppen. De experimentella resultaten visar att det totala fenolinnehållet i Apple -enzymet i kontrollgruppen är lägre än i den experimentella gruppen, och dess reducerande kraft, superoxidanjonfria radikala, DPPH -fria radikala och ABTS -fria radikala rensningsförmåga är bättre än i kontrollgruppen; Enzymet i kontrollgruppen har en särskilt god rensningsförmåga för hydroxylfria radikaler.
I allmänhet visade den experimentella gruppen högre antioxidantaktivitet, vilket ytterligare bekräftade genomförbarheten av att konstgjort tillsats av stammar för att göra mikrobiella enzymer. På detta sätt har mikrobiella enzymmat mer ämnen som är fördelaktiga för människors hälsa på grundval av den ursprungliga naturliga jäsningen och kan bättre utvecklas i den riktning som förväntas av människor.