Kapitel 5 Förändringar i enzymaktivitet under enzymfermentering

Kapitel 5 Förändringar i enzymaktivitet under enzymfermentering

 

Proteas, lipas ochSuperoxiddismutas (SOD)är de viktigaste funktionella enzymerna avMikrobiella enzym hälsokost. Bland dem,protesteraspelar en roll iFrämja hydrolysen av protein i mati människokroppen. Dessutom kan det också sönderdelas några döende celler, ta bort smuts på hudytan och porerna och spela en roll i peeling, så det används ofta i badprodukter. Lipas verkar på esterbindningen mellan fettsyror och glycerol, och hydrolysunderlaget är i allmänhet naturliga oljor. Därför ses det i många viktminskningsmat och hälsoprodukter. Många kvinnor är oerhört bekymrade över ämnet viktminskning, varför enzymer snabbt har blivit populära över hela världen.Enzymer är rika på lipas, vilket innebär att de har högt forskningsvärde och tillämpningsutsikter.Tråkigär ett speciellt metallenzym som katalyserar demonteringsreaktionen avsuperoxidjonradikalerdärmedTa bort superoxidanjonradikaleri kroppen. Det är en skyddande barriär för organismer, så den används ofta inom det medicinska området.
Detta kapitel tar Apple -enzym som ett exempel. Från det första fermenteringsstadiet,aktiviteter av superoxiddismutas, amylas, lipas, proteas och cellulas i experimentgruppen och kontrollgruppen mättes var 15: e dag för att omfattande och systematiskt återspegla den förändrade trenden för enzymaktivitet under hela jäsningsprocessen.

Nya örter Cistanche

Klicka för att få mer information

 

Stödjande tjänst för Wecistanche den största cistanche-exportören i Kina:
E -post: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Material och metoder

5.1.1 Material

(1) Experimentella material

Tvätta färska äpplen med sterilt vatten under sterila förhållanden, torka dem naturligt på ett sterilt operationsbord, skala dem och skiva dem för senare användning. Tillsätt vitt socker och äpplen i en steriliserad glasburk i ett massförhållande av 1: 1. Aktivera de bakterier som krävs för experimentet och ympa dem i enzymet enligt det optimala schemat (detta operationssteg utelämnas för kontrollgruppen), försegla den och placera den på en sval och torr plats. Efter 3 månaders jäsning av rumstemperatur, ta ett prov för att erhålla hela enzymvätskan som innehåller massa och filtrera den. Ta supernatanten som det experimentella provet. Efter att provet är centrifugerat vid 10, 000 rpm i 15 minuter i en höghastighetscentrifug, används det för att mäta relevanta data. Det är värt att notera att alla våra operationer genomfördes under sterila förhållanden i processen att göra enzymer för att undvika onödig förorening.

(2) Huvudinstrument
De instrument som krävs för experimentet är desamma som 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Metoder

(1) Bestämning av superoxiddismutas (SOD) -aktivitet [66]
Pyrogallol -lösningen förvärdes i ett 25 graders konstant temperaturvattenbad under en tid. Enligt tabell 5.1 tillsattes en lämplig mängd buffert, destillerat vatten och samma volym saltsyra eller pyrogallollösning till provröret. Det konstant temperaturvattenbadet sattes till 25 grader för 2 0 min. Efter att den blandade vätskan snabbt skakades injicerades den omedelbart i kyvetten. Absorbansvärdet A0 i provet mättes var 30: e sekund vid en våglängd av 325 nm med användning av en spektrofotometer.

Tab.5.1 Lägg till mängden av den intilliggande bensen tre fenolreagenset för bestämning av autoxidationshastighet

 

Metoden för att bestämma SOD -aktivitet är i princip densamma som ovanstående operation. Den enda skillnaden är att innan du tillsätter pyrogallol, {{0}}. 5 ml enzymprovlösning av olika koncentrationer måste tillsättas först. Samtidigt tillsätts samma volym destillerat vatten. Den uppmätta absorbansen är ASOD. Inhiberingshastigheten och SOD -enzymaktiviteten beräknas enligt formel 5.1 och formel 5.2: Inhibitionhastighet (%)=(△ A 0- △ ASOD)/△ A {{20} × 100 (5.1) Enzyme -aktivitet (u/ml) (5.2) där: V1 är den totala volymen för lösningen, ML; V2 är volymen för enzymprovlösningen, ML; △ A0 är auto-oxidationshastigheten för pyrogallol; △ ASOD är förändringshastigheten för prov absorbansvärdet; n är utspädningens multipel (2) bestämning av amylasaktivitet Denna studie använde den jod-stjärniga kolorimetriska metoden för att bestämma amylasaktivitet. De specifika operationsstegen hänvisar till "National Clinical Laboratory Operation Procedure" [67]. Det är främst uppdelat i följande två punkter:

 

① Förberedelse av lösning
Buffrad stärkelselösning ({{0}}. 4g/l): Väger exakt 9 g natriumklorid, 22,6 g vattenfria dydriumvätefosfat och 12,5g anhydröst potassium dihydrogenfosfat, dyker upp dem i 5 {15 {{{{{{16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16 {16} {och värme av {och 16 {16; Lösningen kokar; Väg dig exakt 0,4 g löslig stärkelse, lösa upp den i 10 ml destillerat vatten, blanda jämnt och justera till en pasta; Injicera stärkelselösningen justerad till en pasta i den ovanstående kokande lösningen och tvätta bägaren upprepade gånger tills stärkelsen helt överförs till den kokande vattenlösningen. Efter omrörning jämnt med en glasstång, sval till rumstemperatur, tillsätt 5 ml av en 37% hårformaldehydlösning och späd till 1L med destillerat vatten. Lösningsvärdet är 7,0 ± 0,1 och det placeras i kylskåpet för användning.
JOD -stamlösning (0. 1 mol/l): Väge exakt 1.7835g kaliumjodat och 22,5 g kaliumjodid i en ren 500 ml
Bägare, långsamt och jämnt tillsätt 4,5 ml koncentrerad saltsyra, omrörning kontinuerligt under tilläggsprocessen, späd till skalan med destillerat vatten och rör jämnt. Lägg den i kylen för användning och förvara den i en brun reagensflaska.
JOD -applikationslösning ({{0}}. 01MOL/L): Ta en viss mängd jodlaglösning (0,1 mol/L), späd den 10 gånger med destillerat vatten, lägg den i kylen för användning och lagra den i upp till 1 månad.

② Experimentella operationssteg
Ta enzymlösningen och späd den 10 gånger med fysiologisk saltlösning och arbeta enligt tabell 5.2. Blanda väl, spektrofotometerns våglängd är 660Nm och den lätta vägen för den kolorimetriska koppen är 10 mm. Noll med destillerat vatten och läs absorbansen för varje rör. Beräkna amylasaktiviteten baserad på den grundläggande beräkningsformeln 5.3.

 

Tab.5.2 Operationssteg för bestämning av amylas

 

(3) Bestämning av lipasaktivitet

Bestämningsmetoden utfördes i enlighet med QB/T {{0}} [68]. En 2% enzymtestlösning framställdes med 0. 0 25 mol/L fosfatbuffert (pH 7,5), fenolftalin användes som en indikator, och fettsyror titrerades med en standard -natriumhydroxidlösning. Lipasaktiviteten beräknades baserat på volymen av natriumhydroxid som konsumeras i experimentet. Regeln är: vid ett pH av 7,5 och en omgivningstemperatur på 40 grader hydrolyserar 1 ml flytande enzymlösning lipas under 1 min för att producera 1 μmol fettsyra, som är en lipasaktivitetsenhet, uttryckt som U/ml. Därefter beräknades lipasaktiviteten enligt formel 5.4: enzymaktivitet (u/ml)=(ba) × c/0,05 × 50 × 1/15 × n=200/3 × (ba) × c × n (5.4) där: b är volymen med sodiumhyDroxen, mommerad, momental, mome; A är volymen av natriumhydroxidstandardlösning som konsumeras i den tomma kontrollgruppen, ML; C är koncentrationen av natriumhydroxidstandardlösning, mol/L; 0,05 är omvandlingsfaktorn för koncentrationen av natriumhydroxidstandardlösning; 50 är fettsyrainnehållet i natriumhydroxidlösning; 15 min är reaktionstiden; n är utspädningens multipel.

(4) Bestämning av proteasaktivitet

Se gb/t 23527-2009 [69] med små modifieringar.
① Förberedelse av standardkurva
Ta 1 ml tyrosinstandardlösning med olika masskoncentrationer, som är 0, 1 0, 20, 30, 40 och 50 mg/l, och tillsätt 5 ml 0,4 mol/l natriumkarbonatlösning och 1 ml folinreagenslösning till den. Reagera i 20 minuter vid en temperatur på 40 grader. När reaktionen är klar tar du bort reaktionslösningen och mät absorbansvärdet för lösningen vid en våglängd av 680Nm med en spektrofotometer. Rita en tyrosinstandardkurva med tyrosinkoncentration som den horisontella axeln och absorbansvärdet som den vertikala axeln.

Nya örter Cistanche med stark antioxidantkraft

② Bestämning av proteasaktivitet
Experimentell grupp: Ta 1 ml kaseinlösning med en koncentration av 10 g/l och blanda den jämnt med 1 ml av provlösningen som ska testas och reagera i 10 minuter vid en omgivningstemperatur på 40 grader; filtrera och erhålla filtratet efter stående, ta 1 ml filtratet, 5 ml natriumkarbonatlösning och 1 ml folinreagens, blanda jämnt och reagera i 20 minuter vid en omgivningstemperatur på 40 grader; Använd en spektrofotometer för att mäta lösningens absorbansvärde vid en våglängd av 680 nm.
Tom kontrollgrupp: Ta 1 ml av provlösningen som ska testas, tillsätt triklorättiksyra, reagera fullt ut för att inaktivera proteaset och andra operationsmetoder är desamma som experimentgruppen.

Beräkna proteasaktiviteten enligt formel 5.5:
Proteasaktivitet (u/ml)=ak × 4/10 (5.5) där: a är absorbansen av enzymlösningen i experimentgruppen; K är mängden tyrosin när absorbansen är lika med 1; 4 är den totala volymen för reaktionslösningen, ML; 10 är reaktionstiden, min.

(5) Bestämning av cellulasaktivitet [70]

Aktiviteten av cellulas i enzymer uttrycks generellt av mängden glukos som frisätts av en viss mängd enzymlösning per enhetstid. Principen att använda filterpappermetoden för att mäta cellulasaktivitet är att cellulas kan sönderdelas cellulosa i filterpapperet för att producera sekundära metaboliter såsom glukos och glukos kan reagera med 3, 5- Dinitrosalicylsyra för att bilda ett gult komplex. Färgen på denna reaktion är relativt ljus, vilket väl kan bestämma mängden glukos och andra reducerande sockerarter som produceras.

 

①3, 5- dinitrosalicylsyra kolorimetriska medel
Väg dig exakt 1 0 g av 3, 5- dinitrosalicylsyra med en smältpunkt av 168-169 grad, upplös den med destillerat vatten, tillsätt 20 g natriumhydroxid och 200 g kaliumnatriumtartat, fortsätt uppvärmning tills det fasta ämnet är helt uppdelat, dilverat till 500 mL till 500 mL med tillägg av vatten, tillsätt 2, tillsätt 2, tillsätt 2, tillsätt 2, tillsätt 2, tillsätt 2, tillsätt 2, tillsätt 2 0,5 g vattenfri natriumsulfit, rör om kontinuerligt under tilläggsprocessen tills den är helt upplöst, stoppar uppvärmning efter blandning jämnt, svalt till rumstemperatur, överför alla till en 1000 ml volymetrisk kolv, späd till märket med destillerat vatten, plats vid rumstemperatur i en vecka, filtrera, få den supernatanta, och lagra i en brunt flask.②enzymatisk hydrolys
Pipetten exakt {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 ml enzymprovlösning i 2 ml ättiksyra-n-n-n-n-acetatbuffertlösning med ett pH-värde på 4,5. Efter 5 minuters konstant temperaturvattenbad vid 40 grader, tillsätt 6 bitar av kromatografifilterpapper med ett område på 1 × 1 cm2 respektive och börja omedelbart tidpunkten för att göra reaktionstiden korrekt till 60 minuter. Överför omedelbart till kokande vattenbad för reaktion i 10 minuter, och cellulaset förlorar sin aktivitet.

 

 

③ Färgreaktion
Ta enzymprovlösningen, tillsätt 3 ml av 3, 5- dinitrosalicylsyra kolorimetriska medel framställt i ①, värme i kokande vattenbad i 15 minuter, ta ut, sval till rumstemperatur, tillsätt 10 ml av destillerat vatten, blanda jämnt, använd spektrofotometer vid en våglängd på 550nm, justera den tomma kontrollgruppen till zero och mäta dess absoratbana.
④ Ritning av glukosstandardkurva
Förbered en glukosstandardlösning med en koncentration av 1 mg/ml exakt och använd destillerat vatten för att göra glukosstandardlösningen med en volym av 0, 0. 2, 0. 4, {6}}. 6, 0. av 3, 5- Dinitrosalicylsyra kolorimetriskt medel framställt i ① för att utföra färgutvecklingsreaktion. Plotta standardkurvan med glukoskoncentration som den horisontella axeln och absorbansen som den vertikala axeln.
⑤ kalkulation
Använd absorbansvärdet A efter färgutveckling med enzymlösning och beräkna sedan glukosfrisättningsmängden M enligt glukosstandardkurvan och beräkna enligt formel 5.6:
Cellulasaktivitet (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) där: m är glukosfrisättningsbeloppet, ug; T är den enzymatiska hydrolysiden, min; M är enzyminnehållet i reaktionen, ug/ml.