Mjölkexosomhärlett mikroRNA-2478 undertrycker melanogenes genom Akt-GSK3-vägen

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

In-Seon Bae och Sang Hoon Kim

Abstrakt:Exosomer deltar i intercellulär kommunikation genom att överföra molekyler från donor till mottagarceller. Exosomer finns i olika kroppsvätskor, inklusive blod, urin, cerebrospinalvätska och mjölk. Mjölkexosomer innehåller många endogena mikroRNA-molekyler. MikroRNA är små icke-kodande RNA och har viktiga roller i biologiska processer. De specifika biologiska funktionerna hos mjölkexosomer är inte väl förstådda. I denna studie undersökte vi effekterna avmjölkexosomerpå melaninproduktion i melanomceller och melanocyter. Vi hittade detmjölkexosomer minskademelanininnehåll, tyrosinasaktivitet och uttrycket av melanogenesrelaterade gener i melanomceller och melanocyter. Bovinspecifik miR-2478 i exosomer hämmade melaninproduktionen. Vi fann att Rap1a är en direkt målgen för miR-2478 i melanomceller och melanocyter. MiR-2478överuttryck minskade Rap1a-uttrycket, vilket ledde till nedreglerad melaninproduktion och uttryck av melanogenesrelaterade gener. Hämning av Rap1a-uttryck minskademelanogenesgenom Akt-GSK3-signalvägen. Dessa resultat stöder rollen för miR-2478 som härrör från mjölkexosomer som en regulator avmelanogenesgenom direkt inriktning av Rap1a. Dessa resultat visar att mjölkexosomer kan vara användbara kosmetiska ingredienser för att förbättrablekning.

Nyckelord: melanogenes;mjölk exosom; miR-2478; Rap1a

herba cistanchesär en melaninhämmande ingrediens

1. Introduktion

Cosmeceutical är ett sammansatt ord som kombinerar kosmetika och farmaceutiska och hänvisar till kosmetika med funktionella ingredienser som har medicinska effekter [1]. Tidigare har huden förbättrats genom dermatologiska ingrepp, men nyligen har intresset för kosmetika ökat på grund av konsumenternas önskan att få dessa effekter genom kosmetika. Den kosmetiska industrin har också visat ett ökat intresse de senaste åren för användningen av nya kosmetiska ingredienser [ 2]. Funktionella kosmetika inkluderar produkter som hjälper huden att bleka genom att förhindra avlagring av melanin på huden.

Melanin, ett viktigt element som bestämmer färgen på hud och hår, skyddar huden från ultravioletta strålar [3]. Men överdriven bildning av melanin orsakar ojämn hudton, t.ex. fläckar och fräknar [4]. Mikroftalmi transkriptionsfaktor (MITF) är en viktig regulator av melanocytutveckling. Tyrosinas (TYR) är det viktigaste enzymet för melaninsyntesen. Melaninsyntesprocessen induceras av TYR-aktivering via MITF, vilket är ett viktigt enzym involverat i det inledande skedet av melaninsyntesprocessen och använder L-formen av tyrosin eller DOPA som ett substrat för att bilda melanin [5].

MicroRNAs (miRs) är korta icke-kodande RNA som deltar i många biologiska processer genom att kontrollera post-transkriptionellt genuttryck [6]. Studier har också avslöjat kontrollen av melaninbiosyntesen genom mikroRNA. Till exempel har det rapporterats att miR-143-5p riktar sig mot Tak1-genen och minskar MITF-uttryck, och därigenom hämmar melaninsyntesen [7]. MiR-125b, en negativ regulator avmelanogenes, har visats reglera pigmenteringsgenen SH3BP4 [8], och miR-675 i exosomer som utsöndras från keratinocyter hämmarmelanogenesgenom att rikta in sig på MITF [9].

Exosomer är 30–200 nm-stora membranbundna vesiklar och innehåller DNA, RNA och peptider [10]. De inre komponenterna i exosomer kan säkert överföra information till intilliggande eller avlägsna celler utan att brytas ned av enzymer i biologiska vätskor, vilket påverkar mikromiljön runt olika celler [11].Mjölk exosomerär mjölkhärledda dextracellulära vesiklar som är stabila i mänskliga matsmältningsprocesser [12]. Exosomer som extraheras ur mjölk från nötkreatur innehåller inte bara flera proteiner som kasein och laktoglobulin utan även mikroRNA, som fungerar som last [13–15]. Bovinmjölk innehåller immunrelaterade mikroRNA som miR-15b, miR-27b, miR-34a och miR-10. Dessa mikroRNA är särskilt rikliga i råmjölken [16].

Vissa studier har visat att komponenter i mjölk hämmarmelanogenesi melanocyter; till exempel reglerar proteiner som -laktoglobulin och K-kasein i mjölk melanogenes [17,18]. Supernatanten av Lactobacillus helveticus NS8-fermenterad mjölk har visat sig hämma UV-skador och hyperpigmentering i huden [19]. Det finns dock ännu ingen rapport om huruvida mikroRNA i bovin mjölk är involverade i hudenblekning, även om 79 mikroRNA finns imjölkexosomer[13]. Därför undersökte vi i denna studie om mjölkexosomer som innehåller mikroRNA hämmar melaninsyntesen i mus- och humana melanomceller och melanocyter.

2. Material och metoder

2.1. Cell kultur

Musmelanom B16F10-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA). Humana melanom MNT-1-celler odlades i Minimum Essential Medium (MEM, Hyclone). Alla medier kompletterades med 10 procent fetalbovint serum (FBS, Hyclone, USA) och 1 procent av en penicillin-streptomycinlösning. Normalhumana epidermala melanocyter (NHEM, PromoCell, Heidelberg, Tyskland) vid passagenummer 5 eller 6 bibehölls i ett melanocyttillväxtmedium (PromoCell). Dessa celler inkuberades vid 37 ◦C i en fuktig atmosfär innehållande 5 procent CO2.

2.2. Exosomerrening

Kommersiell mjölk (1 ml) centrifugerades vid 2000× g under 10 min, sedan centrifugerades supernatanten vid 10,000× g i 10 minuter. Mjölksupernatanten fick passera genom ett 0,45 µm filter och sedan ett 0,2 µm filter. Den resulterande lösningen (300 µL) blandades med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 300 µL av Exoquick exosomutfällningslösning (Systems Biosciences, Palo Alto, CA, USA) och inkuberades i 30 minuter. Blandningen centrifugerades vid 10 000 x g under 30 minuter för att erhålla en exosompellet, som därefter återsuspenderades i PBS. Storleksfördelningen av exosomerna bestämdes på en Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Almelo, Frankrike). Exosomerna lagrades vid -80 ◦C för vidare användning.

2.3. Kryoelektronmikroskopi

En 3 µL alikvot av färsk exosomesuspension adsorberades till ett glödutsläppt, perforerat kolbelagt galler (2/2-3 C C-platt; Protochips, Morrisville, NC, USA), som sedan blottades i 3 s vid 4 ◦C och djupfryst med en Vitrobot Mark IV (Thermo FisherScientific, Lafayette, CO, USA). Gallren lagrades i flytande kväve och överfördes sedan till en Gatan 626 kryoprovhållare (Gatan, Pleasanton, CA, USA). Proverna avbildades med en nominell förstoring på 29,000× i ett kryoelektronmikroskop (FEI Tecnai F20 TEM,FEI, Hillsboro, OR, USA), utrustat med en standardfältemissionspistol (s-FEG) och en K2Summit-kamera (Gatan) med en accelerationsspänning på 200 kV.

2.4. Cellviabilitetsanalys (WST-analys)

Melanomceller (B16F10, MNT-1) och humana melanocyter (NHEM) såddes med 4 × 103 celler/brunn i 96-brunnsplattor och behandlades medmjölkexosomer(20 och 50 µg/ml) eller en mikroRNA-härmare (RNA-dubbelsträngade oligonukleotider) för varje experiment. Vid de angivna tidpunkterna mättes cellviabiliteten med hjälp av den förbättrade cellviabilitetsanalysen EZ-CyTox (Daeil Lab Service, Seoul, Korea) enligt tillverkarens instruktioner. Absorbansen mättes vid 450 nm på en Vmax-mikroplattaspektrofotometer (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

2.5. Melanininnehållsmätning

Melanomceller och melanocyter behandlades medmjölkexosomer(20 och 50 µg/ml) under 48 timmar. Efter tvättning två gånger med iskall PBS, centrifugerades cellerna vid 2500 x g under 10 min. Cellpelletarna återsuspenderades vid 90 ◦C under 30 minuter i 1 N NaOH innehållande 10 procent dimetylsulfoxid. Den totala melaninhalten mättes på Vmax-mikroplattspektrofotometern (Molecular Devices) vid 405 nm.

2.6. Tyrosinasaktivitetsanalys

Melanomceller och melanocyter inkuberades medmjölkexosomeri 48 timmar. Cellerna tvättades två gånger med PBS och lyserades med PBS innehållande 1 procent Triton X-100 och 0.1 mMfenylmetansulfonylfluorid. Efter centrifugering uppsamlades supernatanten och överfördes till en 96-brunnsplatta. Efter tillsats av 0.1 ML-3,4-dihydroxifenylalanin, inkuberades prover vid 37 ◦C under 1 timme. Tyrosinasaktiviteten mättes på basis av absorbansen vid 475 nm med användning av mikroplattans spektrofotometer (Molecular Devices).

herba cistanches

2.7. Mänskliga hudvävnader

Epidermala ekvivalenter innehållande melanocyter (MelanoDerm, MEL-300B) erhölls från MatTek (Ashland, MA, USA) och hölls i EPI-100-NMM-113--medium.Mjölk exosomerapplicerades på MelanoDerm-vävnader dag 1, 3, 7, 9 och 12. PBS användes som negativ kontroll. Vävnader fotograferades dag 3, 7, 9, 12 och 14. Pigmentering mättes genom att jämföra förändringarna i L-värdet (Adobe PhotoshopCC 2015). Melanininnehåll i human hudvävnad mättes på dag 14 med en lösbarmelaninanalys. Kortfattat solubiliserades MelanoDerm-vävnaderna med hjälp av Solvable (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) och inkuberades över natten vid 60 ◦C. Prover vortexades och centrifugerades sedan vid 16 500 x g under 5 min. Supernatanten överfördes till brunnarna på en 96-brunnsplatta och avlästes vid 490 nm med en spektrofotometer.

3. Resultat

3.1. Karakterisering av exosomer isolerade från mjölk

För att undersöka egenskaperna hos exosomer som extraherats från komjölk, mätte vi först storleken på exosomer genom dynamisk ljusspridning. Som ett resultat visade sig exosomer som extraherades från mjölk ha en diameter på 80–190 nm (Figur 1A). Förmjölkexosomrening centrifugerades Exoquick-mjölkssupernatantblandningen för att erhålla en mjölkexosompellet. Uttrycket av CD9, TSG101 och HSP70 som exosomala markörer upptäcktes i pellets, men dessa proteiner fanns inte i supernatanten (Figur 1A). Dessutom bekräftades exosomernas sfäriska morfologi och storlek med kryo-elektronmikroskopi (Figur 1A). IB). Exosomer visade sig ha en rund form på upp till 200 nm i diameter. Därefter undersökte vi om exosomer som extraherades från mjölk togs upp av celler. Mus B16F10-celler inkuberades medmjölkexosomermärkt med det lipofila fluorescerande färgämnet PKH26. Som ett resultat observerade vi att de märkta exosomerna var närvarande inuti cellerna (Figur S1).

3.2. Tyrosinasaktivitet och melaninproduktion undertryckt av mjölkexosomer i B16F10-celler

Därefter undersökte vi effekten av de extraherade exosomerna på cellviabiliteten. Som avbildats i figur 2A avslöjade vi att det inte fanns någon signifikant skillnad i cellviabilitet, oavsett exosomkoncentrationen.

För att undersöka möjliga hudceller-blekningeffekten avmjölkexosomerceller behandlades med mjölkexosomer. Vi fann att tyrosinasaktivitet i celler exponerade för mjölkexosomer vid koncentrationer av 20 eller 50 µg/ml minskade med 43 procent respektive 59 procent (Figur 2B). Eftersom minskningen av tyrosinasenzymaktiviteten kan hämma melaninbiosyntesen, mättes melaninhalten efter behandling med mjölkexosomer. Vi noterade hämning av melaninsyntes i celler som exponerades förmjölkexosomer(20 eller 50 µg/ml) med 45 procent respektive 55 procent (Figur 2C). Dessutom minskade uttrycket av MITF-mRNA när koncentrationen av mjölkexosomer ökade. Nivån av MITF-mRNA minskade med 59 procent i cellerna som behandlats med 20 µg/ml exosomer respektive med 84 procent i cellerna som behandlats med 50 µg/ml exosomer (Figur 2D). Tyrosinas (TYR) mRNA-uttryck minskade också med 49 procent och 76 procent i cellerna som exponerades för dessa koncentrationer av exosomer (Figur 2D). MITF- och tyrosinasproteinnivåerna minskade också med koncentrationen av mjölkexosomerökade (Figur 2E). Dessa resultat tyder på att mjölkexosomer hämmar melanogenes i mus-B16F10-celler.

3.3. Bovint-specifik miR-2478 från Milk Exosomes undertrycker melanogenes

För att avgöra om miR-2478 härrör frånmjölkexosomerdirekt påverka melanogenesen transfekterades miR-2478-hämmaren in i cellerna exponerade för mjölkexosomer (50 µg/ml). I närvaro av mjölkexosomer visade B16F10-celler transfekterade med themiR-2478-hämmaren signifikant högre tyrosinasaktivitet jämfört med den i kontrollen (Figur 4A). Melaninhalten var också högre i miR-2478-hämmarebehandlade celler än i kontrollceller (Figur 4B). MITF-mRNA-uttrycket var –2.5-faldigt högre i miR 2478-hämmarebehandlade celler än i kontrollceller, och TYR-mRNA-uttrycket var –2-falt högre när miR-2478 hämmades (Figur 4C ). Nivåerna av MITF- och TYR-proteiner återfanns också i cellerna som exponerats förmjölkexosomerefter att dessa celler transfekterats med miR-2478-hämmaren (Figur 4D). Dessa resultat antydde att miR-2478 härrörande från mjölkexosomer direkt undertryckte melanogenes i musmelanomceller.

3.4. Mjölkexosomer undertrycker melanogenes genom Akt-GSK3-vägen

Därefter undersökte vi hur manmjölkexosomerregleramelanogenesför att identifiera den relevanta påverkade vägen i melanomceller. Även om det inte är känt om Rap1a direkt kontrollerar melanogenes, har det rapporterats att Rap1a hämmar Akt fosforylering cancerceller [20]. På grundval av denna information undersökte vi om Rap1a modulerar Akt-vägen för att främja.

I Akt-relaterademelanogenesväg, aktiverad Akt inducerar fosforyleringen av Gsk3 vid Ser9 och inaktiverar den sålunda; thischange hämmar transkriptionsaktiviteten hos MITF och nedreglerar tyrosinas [21,22]. I den aktuella studien utvärderade vi uttrycket av Akt och GSK3 i celler behandlade medRap1a siRNA. I dessa celler ökade aktiveringen av Akt-fosforylering och mängden pGSK3 ökade också (Figur 7A). GSK3 inaktiverades genom aktivering av Akt på ett koncentrationsberoende sätt i cellerna som behandlats med 20 eller 50 µg/mlmjölkexosomer(Figur 7B). Nivåerna av proteinerna Akt och GSK3 i cellerna som behandlats med miR-2478mimiken överensstämde med ovanstående resultat (Figur 7C). Därefter testade vi om miR-2478från mjölkexosomer påverkar Akt-GSK3-vägen. I närvaro av mjölkexosomer var fosforyleringen av proteinerna Akt och GSK3 lägre i cellerna som behandlats med themiR-2478-hämmaren (Figur 7D). Dessutom ökade behandling med AKT-hämmaren GSK690693 uttrycket av gener associerade medmelanogenesi mjölkexosombehandlade celler. (Figur 7E). Dessa fynd innebar att miR-2478 inmjölkexosomernedreglerar Rap1a och undertrycker melanogenes genom Akt-GSK3-vägen.

cistanche herbablekande effekt på huden till antioxidation

3.8. Mjölkexosomer hämmade melanogenes i humana melanomceller, melanocyter och melanodermvävnad

Givet attmjölkexosomerhämmasmelanogenesi musceller bestämde vi sedan om mjölkexosomer var lika effektiva i mänskliga celler. Först undersöktes livsdugligheten för MNT-1 humana melanomceller och NHEM humana melanocyter efter inkubation med 20 eller 50 ug/ml mjölkexosomer. Såsom visas i figur 8A fanns det ingen skillnad i livsduglighet. Tyrosinasaktiviteten hämmades med 43 procent respektive 85 procent i MNT-1-celler exponerade för 20 ug/mL eller 50 ug/mL mjölkexosomer (Figur 8B). NHEM reducerades också med 34 procent respektive 66 procent genom behandling med 20 ug/mL eller 50 ug/mL mjölkexosomer (Figur 8B). Dessutom mättes melaninhalten i MNT-1-celler och NHEM exponerade för mjölkexosomer. Som ett resultat av detta exponerades melaninsyntes i MNT-1-celler för 20 ug/mL eller 50 ug/mLmjölkexosomerhämmades med 37 procent respektive 58 procent, och i NHEM-celler hindrade mjölkexosombehandlingen melaninsyntesen med 36 procent respektive 62 procent (Figur 8C). Dessutom har hudens ljusare effektmjölkexosomerbekräftades ytterligare med användning av mänskliga hudvävnader. Efter behandling med mjölkexosomer i mänskliga vävnader, relativblekning effekter observerades på dag 3, 9, 12 och 14. Som ett resultat fann vi att hudfärgen i mjölkexosomexponerade vävnader verkade vara ljusare än i kontrollvävnaderna (Figur 8D). Graden av pigmentering beräknades som L-värdet, vilket är ett värde som representerar ljushet. Pigmentering fortskred långsammare i mjölkexosombehandlade hudvävnader än i kontrollhudvävnader (Figur 8D). Den experimentella gruppen som behandlades medmjölkexosomervisade en mindre melaninpartikelstorlek och en låg mängd melaninpigment jämfört med kontrollgruppen (Figur 8E). Som ett resultat av mätning av melanininnehållet efter 14 dagars mjölk exosomer hämmade melaninsyntesen i mänskliga vävnader (Figur 8F). Därför drog vi slutsatsen att mjölkexosomer hämmarmelanogenesi mänskliga celler och vävnader.

4. Diskussion

Studier om exosomer som reglerarmelanogeneshar rapporterat att exosomer härledda från keratinocyter har en blekande effekt. Melanocyter och de omgivande keratinocyterna är funktionellt kopplade till att bilda melaninenheter i hudens epidermis [23,24]. Keratinocythärledda lösliga faktorer reglerar melanogenesen hos närliggande melanocyter. Exosomes utsöndras från normala keratinocyter främjar melanogenes genom att uppreglera uttrycket avmelanogenes-relaterade proteiner [23–25]. Dessutom, i enblekningstudie med exosomer extraherade från celler, rapporterades det nyligen att exosomer extraherade från humanadiposvävnadshärledda stam-/stromaceller visade hudens ljusare effekt i musmelanomceller [26]. Det fanns också en rapport om att exosomer utvunna från växter har en blekande effekt. De extracellulära vesiklerna som extraherats från D. morbifera-växtblad och stammar uppvisade anti-melanogena effekter på musmelanomceller och frisk humanhud [27]. I vår studie undersöktes den blekande effekten av mjölkhärledda exosomer.

Jämfört med exosomer som extraheras från blodplasma eller odlingsvätska har exosomer som härrör från mjölk fördelarna att de inte bara har stora mängder exosomer som kan extraheras per volymenhet utan också ett lågt pris [26,27]. Därför attmjölkexosomerhar en kemisk sammansättning som liknar den hos cellmembran, de uppvisar lägre immunogenicitet och cytotoxicitet och har hög biokompatibilitet [28,29]. Nyligen, när mjölkexosomer matades till DSS (dextransulfatnatriumsalt)-inducerade kolitmodellmöss, minskade uttrycket av de proinflammatoriska cytokinerna IL-6 och TNF jämfört med kontrollgruppen, vilket minskade inflammationen och förbättrade nekrotiserande enterit [30, 31]. Dessutom förbättrade intag av mjölkexosomer i en musmodell av osteoporossjukdom artrit genom att öka bentätheten och minska pro-inflammatoriska cytokiner [32,33]. Hittills har effekterna av mjölkexosomer fokuserats på immunologiska fenomen som minskar proinflammatoriska cytokiner och på benutveckling, såsom lindring av enterit och förbättring av osteoporos. I denna studie, förutom metoden att tamjölkexosomer, det bekräftades att när det applicerades på huden var det effektivt i hudenblekning. Detta indikerar att det kan användas för behandling av olika sjukdomar genom att förbättra fysiologisk aktivitet med hjälp av mjölkexosomer i framtiden.

Även om denna studie antydde detmjölkexosomerhämmamelanogenes, är det redan känt att vassleproteiner såsom kasein, -laktoglobulin och -laktalbumin har en blekande effekt. -laktoglobulin minskar tyrosinasaktivitet i humana melanocyter [18], och k-kasein hämmar melanogenes i mus B16 melanomceller [17]. Intressant nog finns många av dessa komponenter också i mjölkexosomer. Enligt proteomerresultaten av mjölkexosomer fördelas kasein, -laktoglobulin och -laktalbumin i exosomer [15,34,35]. Mjölkexosomer innehåller såväl mikroRNA som proteiner. Som ett resultat av en miRNA-mikroarray som använder mjölkexosomer av Izumi och kollegor, miR-2478, miR-1777b,miR-1777a, let-7b och miR{{16 }} var högt fördelade i mjölkexosomer [13]. I denna studie, med undantag för miR-2478, visade bland dessa mikroRNA: miR-1777b, miR-1777a,let-7b och miR-1224 ingen skillnad i tyrosinasaktivitet från kontrollgruppen (Figur S2). miR-2478 var mest förekommande imjölkexosomeroch minskad tyrosinasaktivitet. Men uttrycket av blekningsrelaterade MITF- och TYR-gener minskade mer i cellerna som behandlades medmjölkexosomerän i cellerna som behandlats med enbart miR-2478mimik. Dessa resultat indikerar att flera komponenter, inklusive mikroRNA i mjölkexosomer, är involverade iblekninghandling.

De flesta mikroRNA i mjölkexosomer utövar biologiska funktioner genom att hämma uttrycket av målgener i mottagarcellerna. I den här studien hämmade miR-2478 också melaninsyntesen genom att rikta in Rap1a som en målgen. Även om de inte var mjölkhärledda mikroRNA, har mikroRNA som kontrollerar uttrycket av blekningsrelaterade gener redan rapporterats. När den mänskliga miR-27a-3p-härmaren applicerades på musmelanocyter, hämmade den Wnt3a-uttryck och hämmade därigenom melaninsyntesen [36], och ektopisk miR-218 hämmade TYR-aktivitet genom att minska MITF-uttrycket i murina melanom melanocyter [37]. miR-203 marknadsförmelanogenesgenom CREB1/MITF/Rab27apathway genom att rikta in sig på Kif5b vid melanom [38]. Det finns 79 mikroRNA i mjölkexosomer

mikroRNA imjölkexosomerhärrör från kor [13]. Därför behövs ytterligare forskning om den fysiologiska aktiviteten hos mjölkexosomer.

5. Slutsatser

Våra resultat tyder på detmjölkexosomerär kandidater för anti-melanogena medel som minskar pigmentering genom att hämma uttrycket av melaninrelaterade gener (Figur 10). I melanomceller och melanocyter visade mjölkexosomer TYR-hämning och minskning av melaninhalten jämfört med den negativa kontrollen. Dessutom medierades dessa effekter av miR-2478 frånmjölkexosomer. Därför kan mjölkexosomer vara användbara för utvecklingen av funktionellablekningkosmetika med låg cytotoxicitet.

cistancheblekande effekt på huden till antioxidation