Morfologiska analyser av nefrianska uttryck i progressiv glomerulonefriopati

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt:

I denna studie fokuserade vi på nefrin, en av nyckelmolekylerna i slitsmembranet hos podocyter, eftersom även om det har rapporterats om dess uttryck hos människor och råttor, har deras närvaro i vanliga marmoseter inte rapporterats. Vi undersökte nefrinuttryck och förändringar i glomeruli, beroende på utvecklingen av spontan progressiv glomerulonefriopati hos vanliga marmoseter. Nitton vanliga marmoseter vid två till tio års ålder utvärderades. Njuren undersöktes genom mikroskopi med hematoxylin och eosin och immunohistokemisk färgning för nefhrin. Lesionerna klassificerades i tre grader enligt ett renalt lesionsgraderingssystem som rapporterats tidigare. Det nefrinpositiva området mättes genom morfometrisk analys och det nefrinpositiva förhållandet beräknades. Nephrinuttryck observerades längs den glomerulära kapillärslingan i ett kontinuerligt linjärt mönster i njurlesionsgraderna 0 till 2 och antingen diskontinuerlig linjär eller grov granulär mönster i grad 3. Nephrin uttryck tenderade att minska signifikant beroende på graden av njurskador. Förändring i nefrinuttryck har föreslagits spela en viktig roll i utvecklingen av njurskador.

Nyckelord:nefhrin, marmoset,glomerulonefripati,njure,patologi

öken cistanche fördelarochCistanche växtär bra förnjure

Införandet

Spontan progressiv glomerulonefriopati hos vanliga marmoseter (Callithrix jacchus) är känd för att förekomma ofta från och med två år gammal, med lesionens svårighetsgrad som fortskrider med åldern. Vi har tidigare rapporterat primära och progressiva lesioner av nefropati hos vanliga marmoseter1. Primära glomerulära förändringar av nefropati i tidigt stadium kännetecknas av utplåning av podocytfotprocesser och partiell förtjockning av det glomerulära basalmembranet, som antas orsaka läckage av protein från glomeruli, och kan observeras genom ultramikroskopi men inte genom ljusmikroskopi1-3. Vidare spelar immunoglobulin en viktig roll i utvecklingen av nefropati1, 2. IgM deponeras på mesangium i det tidiga skedet av glomerulonefriopati, och efter den första avsättningen av IgM expanderar insättningsområdet till hela glomerulus, och IgA och IgG deponeras med progression2. Hyalingjutningar som tyder på läckage av protein från glomeruli kan observeras genom ljusmikroskopi med progressionen av glomerulonefriopati4. Proteinuri förvärrar utvecklingen av tubulointerstitiella lesioner hos vanliga marmoseter4, som hos människor5, 6, och i en nyligen genomförd studie av glomeruli kan proteinuri induceras av störningar i slitsmembranet och därigenom länka intilliggande fotprocesser (pediceller) av podocyter. Slitsmembranet är ett intercellulärt korsningskomplex som finns mellan intilliggande fotprocesser, och vissa molekyler relaterade till dess bildning har identifierats3. En minskning av uttrycket av dessa molekyler eller dysfunktion i slitsmembranet ansågs vara relaterat till progressionen av proteinuri3. Nephrin, en av de viktigaste molekylerna uttryckta i slitsmembranet hos podocyter, är ett glykoprotein bestående av 1241 aminosyror och är en välkänd biomarkör som används för att övervaka störningen av slitsmembran7-10. Molekyler relaterade till slitsmembran har inte studerats i nefropati hos vanliga marmoseter, även om förändringen av podocytfotprocesser och progression av proteinuri är kända för att förekomma i dem. Dessutom har det förekommit rapporter om uttrycket av nefron hos människor och råttor7-12 men inte hos marmoseter. Därför undersökte vi nefrinuttryck i glomeruli och förändringar i nefrinuttryck, beroende på lesionsprogressionen, genom immunohistokemiska analyser.

cistanche tcm

Material och metoder

Djur

Denna studie godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Central Institution for Experimental Animals (CIEA; Kawasaki, Japan) och genomfördes i strikt överensstämmelse med CIEA: s föreskrifter för djurförsök baserat på riktlinjerna för korrekt uppförande av djurförsök (Science Council of Japan, 2006). Nitton vanliga marmoseter (11 män och 8 honor) från CLEA Japan Inc. (Tokyo, Japan) utvärderades. Deras åldrar varierade från 2 till 10 år vid obduktionstiden. Djuren hölls i burar i ett djurrum som hölls vid en temperatur av 26 ± 3 ° C och en fuktighet på 55 ± 20%. De matades med LCMS-1M (CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan) och kranvatten. Djuren offrades humant under anestesi med pentobarbitalnatrium på grund av olika orsaker till moribund (såsom syntexis, krökning av ländryggskotor, mandibulär ledförskjutning etc.). Urinanalys utfördes inte eftersom urin inte kunde provtas.

Histopatologi

DenNjurarperfusionerades med saltlösning, följt av 4% paraformaldehyd, och fixerades sedan i 10% neutralbuffrat formalin för mikroskopisk undersökning. Proverna var inbäddade i paraffin, sektionerade med en tjocklek på 5 μm och färgade med hematoxylin och eosin (HE). Lesionerna klassificerades som glomerulära, rörformiga och interstitiella lesioner baserat på publicerade kriterier1. Nefropati grader delades in i fyra grupper: grad 1 (3 män och 1 kvinna), grad 2 (3 män och 5 honor), grad 3 (1 man och 3 honor) och grad 4 (3 män) (tabell 1).

För immunohistokemi, en monoklonal antikropp mot den extracellulära domänen av mänskligt ursprungnefhrin(1:1,000,Nefhring-8, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) användes som primär antikropp. Sektionerna på 5 μm deparaffiniserades, rehydrerades, behandlades med 3% väteperoxid vid rumstemperatur i 5 minuter och upphettades sedan i en autoklav vid 121 ° C i 20 min i målhämtningslösning (pH 6,0, Dako, Glostrup, Danmark). Efter kylning inkuberades sektionerna med den primära antikroppen vid 4 °C över natten. Peroxidaskonjugerad antimus- och antikanin-IgG-polymer (Histofine Simple Stain Rat MAX-PO(MULTI), Nichirei Bioscience Inc., Tokyo, Japan) användes som sekundär antikropp för den polymerbaserade metoden13. Sektionerna inkuberades med den sekundära polymerantikroppen vid rumstemperatur i 30 minuter och de reagerande produkterna visualiserades med användning av 3,3'-diaminobenzidin som kromogen. Motfärgning utfördes med hematoxylin. För den negativa kontrollen utelämnades den primära antikroppen.

Morfologisk analys

För morfologisk analys lämnades glomeruli med glomerulär hilum in för undersökning, och 16 till 28 glomeruli fångades på varje bild (tabell 1) med hjälp av en hel bildskanner (Aperio AT2, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL, USA) och en motsvarande programvara för visning av patologiska bilder (Aperio ImageScope, Leica Microsystems Inc.) med samma upplösning och bildstorlek.Nefhrin-positiva och hela glomerulära områden beräknades med en bildanalysprogramvara (Image-Pro V10, Mediacybenetics Inc., Rockville MD, USA) genom att rita en region av intresse runt glomerulus, enligt en tidigare rapport14. Hela det glomerulära området definierades som det område som kan särskiljas från den vitfärgade bakgrunden. Färgtrösklarna för beräkningnefhrin-positiva områden bestämdes enligt varje färgningstillstånd. Tröskelvärdena för rött, grönt och blått var 37–67, 31–77 respektive 32–88. Det nefrivtiva förhållandet beräknades genom att dividera mätningarna avnefhrin-positivt område över det glomerulära området. Statistisk analys utfördes med jonckheere-testet (signifikansnivå: 5%, ensidigt test) för att utvärdera trenden mellan nefropatigrad och uttryck avnefhrin.

costanche

Resultat

De patologiska poängen och graderna av enskilda njurskador visas i tabell 1. Samma som rapporterats i vår första rapport1 tenderade lesionsgraden att öka med åldern och det fanns ingen uppenbar könsskillnad. Resultaten av immunohistokemisk färgning avnefhrinvisas i fig.nefhrin-positivt förhållande visas i fig. Bland poängen och betygen i tabell 1 användes njurlesionsgraden, härledd från den totala poängen för varje njurskada, och hyalingjutningspoängen för jämförelse mednefhrin-positivt förhållande (fig. 2 och 3). Enskilda fall i tabell 1 visas i stigande ordning efter njurskada. Nephrinuttryck observerades tillsammans med den glomerulära kapillärslingan i ett kontinuerligt linjärt mönster i graderna 0 till 2 (fig. 1A–C) och ett diskontinuerlig linjärt eller grovt granulärt mönster i klass 3 (fig. 1D). I det negativa kontrollprovet, ingen positiv reaktion förnefhrinobserverades på vilken plats som helst.

Jämförelsen avnefhrin-positivt förhållande till njurlesionsgrad visas i fig. I fall av njurskada grad 0 ± medelvärdet av standardavvikelsen (SD) förnefhrin-positiv kvot var 5,66 ± 1,18%, och maximi-, minimi- och medianvärdena var 6,84%, 4,27% respektive 5,76%. I fall av grad 1 var medelvärdet ± SD 3,99 ± 1,61%, och maximi-, minimi- och medianvärdena var 5,69%, 1,19% respektive 4,35%. I fall av grad 2 var medelvärdet ± SD 3,82 ± 2,25%, och maximi-, minimi- och medianvärdena var 6,71%, 1,58% respektive 3,49%. I fall av grad 3 var medelvärdet ± SD 2,52 ± 1,02%, och maximi-, minimi- och medianvärdena var 3,67%, 2,17% respektive 2,17%. Sammantaget var individuella skillnader i nefrinuttryck små i fall av grad 0, men stora i fall av grad 1 eller högre, och lågt positivt uttryck detekterades sporadiskt.Nefhrinuttrycket tenderade att minska beroende på graden av njurskador (fig. 2). Det fanns en signifikant lägre trend mellan njurskador ochnefhrin-positivt förhållande enligt Jonckheere-testet (p = 0,0166). Hyalingjutningspoängen i jämförelse med njurlesionsgraden visas i fig. I fall med en hyalingjutningspoäng på 0 var medelvärdet ± SD av nefrinpositivt förhållande 5,40 ± 1,32%, i poäng 1 fall var det 4,10 ± 1,70%, och i poäng 2 fall var det 3,37 ± 1,98%. Det fanns en signifikant lägre trend mellan hyalingjutningspoängen och nefrinpositivt förhållande enligt Jonckheere-testet (p = 0,0654).

Diskussion

En minskning av nefrin var korrelerad med progressionen av njurskador under utvecklingen av marmosetglomerulonefriopati. Anti-nefhrinantikroppen som användes i denna studie kände igen den extracellulära domänen vid N-terminalsidan. Denna extracellulära domän interagerar med NEPH1-molekyler och bildar en blixtlåsliknande struktur i slitsmembranet15. Lokalisering av nefrin i normal glomeruli ligger längs den glomerulära kapillärslingan och färgningsmönstret är ett linjärt mönster av kontinuerliga fina granuler både hos råttor och människor11, 12, 16–18. Färgningen som utförs i denna studie är lämplig; vilket bekräftas av observationen att kapillärväggarna i kontakt med mesangialområdet inte färgades, medan de som var i kontakt med podocyterna var. Under onormala förhållanden, såsom nefrotiskt syndrom hos människor eller puromycinaminonukleosidnefros hos råttor, är nefrinfärgningsmönstret i glomeruli diskontinueröst och grovt granulärt och intensiteten av immunohistokemisk färgning är svagare än i normal glomeruli11, 16, 17. I den aktuella studien var nefrisnuttrycksmönstret i årskurserna 0 till 2 normalt; Färgningsmönstret i klass 3 var dock jämförbart med det för onormala förhållanden. I en tidigare undersökning av glomerulärt nefrinuttryck hos Crl: CD(SD)-råttor med minimal förändringssjukdom var nefrynuttrycket intakt, även om podocytfotprocesser visade utplåning under elektronmikroskopi utan några uppenbara morfologiska förändringar observerade under ljusmikroskopi18. I den vanliga njursjukdomen hos råttor, kronisk progressiv nefropati (CPN), har det visats att albuminuri åtföljd av CPN i tidigt stadium kan resultera i färre förändringar i glomerulär permeabilitet från underlåtenhet att reabsorbera albumin från proximala tubuler19. Hos människa har det gjorts vissa undersökningar om minskningen av nefruttryck under mindre förändringar10 eller under andra njursjukdomar14, 16. Å andra sidan har det funnits en rapport om intakt nefrinuttryck vid minimal förändring nefros20. Förekomsten eller frånvaron av en förändring i uttrycket av nefrin i minimal förändring nefrotisk sjukdom diskuteras fortfarande. I själva verket var det svårt att bekräfta ökningen eller minskningen av antikroppsreaktionen av nefrin genom visuell observation i marmosetnefropati, men det var möjligt att detektera förändringen i hela njuren genom bildanalys. Vår undersökning tyder på att abnormiteten hos slitsmembran i glomerulus kan vara involverad i utvecklingen av nefropati i vanliga marmoseter på grund av en minskning av nefrin. Omvandlingen av det positiva färgningsmönstret för nefron, från linjärt till granulärt mönster, har rapporterats i en råttdjursmodell av nefrotisk sjukdom under utvecklingen av lesionen11, 16, 21. En koppling mellan avvikelser i slitsmembranet och proteinuri har ofta rapporterats22, 23; därför har det spekulerats i att proteinuri kan orsakas av slitsmembrandysfunktion. I vår studie på marmosetnefropati kan progressionen av glomerulär proteinpermeabilitet på grund av slitsmembrandysfunktion ha inträffat eftersom de morfologiska egenskaperna hos hyalingjutningar endast observerades i fallen utan tubulointerstitiella förändringar. I denna studie observerades ingen statistiskt signifikant skillnad mellan poängen för morfologiska förändringar av hyalingjutningar och minskningen av nefrinuttryck. Nephrinuttrycket tenderar emellertid att minska beroende på hyalingjutningspoängen, vilket är en indikator på proteinläckage från glomerulus.

I vår tidigare undersökning observerades utplåning av fotprocesser i det tidiga skedet av marmosetnefropati och det drabbade fotprocessområdet utvidgades beroende på njurskador grad1. Tabell 2 visar sambandet mellan reduktionshastigheten för nefhrin i denna studie och elektronmikroskopifynden för varje njurlesionsgrad från en tidigare studie. Utmattning tros bero på en nedbrytning av aktincytoskelettet i fotprocesserna24. Nephrin defosforyleras när slitsmembranet är konstruerat, och det binder till aktin genom CD2AP och podocin25, 26. När ett slitsmembran skadas blir nefrinmolekyler grupperade, vilket inducerar nefrintfosforylering, aktinpolymerisation och utplåning av fotprocesser26. Nefrinfosforylering sker också snabbt efter induktion av fotprocessutplåning i protaminsulfatmodellen hos möss27. Nephrin är ett glomerulärt vidhäftningsprotein associerat med monocytmognad, differentiering, processbildning och signalering24. Vår undersökning visade att det fanns en korrelation mellan minskningen av nefrinuttryck, som bestäms av immunohistokemi, och progression av njurlesionsgrad, vilket tyder på en expansion av utplåning av podocytfotprocesser. Det är emellertid oklart om avvikelser i slitsmembranproteinkomplexet orsakar skador på podocytfotprocesser eller om podocytskador orsakar förändringar i slitsmembran och nefrinreduktion. Eftersom nefrin också är involverat i podocytdifferentiering, antas det att detta förhållande kommer att klargöras ytterligare av data om podocytregenerering och differentiering.

Sammanfattningsvis ger våra resultat information omnefhrinuttryck i progressiv glomerulonefriopati hos vanliga marmoseter. Morfologisk analys avslöjade en lägre trend avnefhrinuttryck i podocyter i progressiv glomerulonefriopati hos vanliga marmoseter och förändring avnefhrinuttryck föreslogs spela en viktig roll i utvecklingen av njurskador.

Upplysningar om potentiella intressekonflikter:

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Bekräftelse:

Författarna vill tacka Takayoshi Ito för det utmärkta tekniska bistånd de gav. Författarna tackar också Kanae Tamatsukuri och James Harada för språkredigeringen av manuskriptet.

sistanch

Referenser
1. Yamada N, Sato J, Kanno T, Wako Y och Tsuchitani M. Morfologisk studie av progressiv glomerulonefriopati i vanliga marmoseter (Callithrix jacchus). Toxicol Pathol. 41: 1106–1115. 2013.
2. Yamada N, Hashimoto N, Kamiie J, Doi T, Sato J, Inoue T, Shirota K och Tsuchitani M. Förhållandet mellan immunoglobulinavsättning och tidiga lesioner av progressiv glomerulonefripati hos unga vanliga marmoseter. Veterinär Pathol. 55: 173–176. 2018.
3. Cara-Fuentes G, Clapp WL, Johnson RJ och Garin EH. Patogenes av proteinuri i idiopatisk minimal förändringssjukdom: molekylära mekanismer. Pediatr Nephrol. 31: 2179–2189. 2016.
4. Isobe K, Adachi K, Hayashi S, Ito T, Miyoshi A, Kato A och Suzuki M. Spontana glomerulära och tubulointerstitiella lesioner i vanliga marmoseter (Callithrix jacchus). Veterinär Pathol. 49: 839–845. 2012.
5. Eddy AA. Proteinuri och interstitiell skada. Nephrol Dial Transplantation. 19: 277–281. 2004.
6. Hingorani S, Gooley T, Pao E, Sandmaier B och McDonald G. Urincytokiner efter HCT: bevis för njurinflammation i patogenesen av proteinuri ochnjuresjukdom. Benmärgstransplantation. 49: 403–409. 2014.
7. Kestilä M, Lenkkeri U, Männikkö M, Lamerdin J, McCready P, Putaala H, Ruotsalainen V, Morita T, Nissinen M, Herva R, Kashtan CE, Peltonen L, Holmberg C, Olsen
A, och Tryggvason K. Positionellt klonad gen för ett nytt glomerulärt protein - nefrin - muteras i medfött nefrotiskt syndrom. Mol Cell. 1: 575–582. 1998.
8. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, Thomson NM, Holthöfer H, Zaoui P, Pinel N, Cordonnier DJ och Gilbert RE. Proteinuri och uttrycket av podocytslitsmembranproteinet, nefhrin, i diabetisk nefropati: effekter av angiotensinkonverterande enzymhämning. Diabetologia. 45: 572–1576. 2002.
9. Walesisk GI och Saleem MA. Nephrin-signaturmolekylen i den glomerulära podocyten? J Pathol. 220: 328–337. 2010.
10. van de Lest NA, Zandbergen M, IJpelaar DHT, Wolterbeek R, Bruijn JA, Bajema IM och Scharpfenecker M. Nephrin förlust kan användas för att förutsäga remission och långsiktigt njurutfall hos patienter med minimal förändringssjukdom.Njure3: 168–177. 2017.
11. Kawachi H, Koike H, Kurihara H, Yaoita E, Orikasa M, Shia MA, Sakai T, Yamamoto T, Salant DJ och Shimizu F. Kloning av råtta nephrin: uttryck i att utveckla glomeruli och i proteinuriska tillstånd.Njure57: 1949–1961. 2000.
12. Luimula P, Ahola H, Wang SX, Solin ML, Aaltonen P, Tikkanen I, Kerjaschki D och Holthöfer H. Nephrin i experimentell glomerulär sjukdom.Njure58: 1461–1468. 2000.
13. Janardhan KS, Jensen H, Clayton NP och Herbert RA. Immunohistokemi i undersökande och toxikologisk patologi. Toxicol Pathol. 46: 488–510. 2018.
14. Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, Kawachi H, De Heer E, Paul LC och Bruijn JA. Uttryck av podocytassocierade molekyler i förvärvad människanjureSjukdomar. J Am Soc Nephrol. 14: 2063–2071. 2003.
15. Gerke P, Huber TB, Sellin L, Benzing T och Walz G. Homodimerisering och heterodimerisering av de glomerulära podocytproteinerna nephrin och NEPH1. J Am Soc Nephrol. 14: 918–926. 2003.
16. Doublier S, Ruotsalainen V, Salvidio G, Lupia E, Biancone L, Conaldi PG, Reponen P, Tryggvason K och Camussi G. Nephrin omfördelning på podocyter är en potentiell mekanism för proteinuri hos patienter med primärt förvärvat nefrotiskt syndrom. Är J Pathol. 158: 1723–1731. 2001.
17. Kawakami H, Kamiie J, Yasuno K, Kobayashi R, Aihara N och Shirota K. Dynamiken i den absoluta mängden nefrin i en enda podocyt hos puromycinaminonukleosidnefrosråttor beräknade med kvantitativ glomerulär proteomikmetod med valt reaktionsövervakningsläge. Nephrol Dial Transplantation. 27: 1324–1330. 2012.
18. Yasuno K, Honda K, Hakamata S, Kai K och Mori K. Minimal förändringssjukdom hosnjurei en ung Sprague Dawley-råtta. J Toxicol Pathol. 31: 55–59. 2018.
19. Obert LA och Frazier KS. Intrarenal renin-angiotensinsysteminvolvering i patogenesen av kronisk progressiv nefropati-överbryggande informationsgapet mellan discipliner. Toxicol Pathol. 47: 799–816. 2019.
20. Patrakka J, Ruotsalainen V, Ketola I, Holmberg C, Heikinheimo M, Tryggvason K och Jalanko H. Uttryck av nefhrin hos barnnjureSjukdomar. J Am Soc Nephrol. 12: 289–296. 2001.
21. Saran AM, Yuan H, Takeuchi E, McLaughlin M och Salant DJ. Komplement förmedlar nefrinomfördelning och aktindissociation i experimentell membranös nefropati.Njure64: 2072–2078. 2003.
22. Gagliardini E, Benigni A, Tomasoni S, Abbate M, Kalluri R och Remuzzi G. Riktad nedreglering av extracellulär nefrin i human IgA-nefropati. Är J Nephrol. 23: 277–286. 2003.
23. Wakamatsu A, Fukusumi Y, Hasegawa E, Tomita M, Watanabe T, Narita I och Kawachi H. Calcineurins (CN) roll injureglomerulär podocyt: CN-hämmare förbättrade proteinuri genom att hämma omfördelningen av CN vid slitsmembranet. 4: e12679. 2016.
24. Garg P. En översyn av podocytbiologi. Är J Nephrol. 47 (Suppl 1): 3–13. 2018.
25. Ichimura K, Kurihara H och Sakai T. Actin filament organisation av fotprocesser i råtta podocyter. J Histochem Cytochem. 51: 1589–1600. 2003.
26. Ronco P. Proteinuri: är allt i foten? J Clin Invest. 117: 2079–2082. 2007.
27. Verma R, Kovari I, Soofi A, Nihalani D, Patrie K och Holzman LB. Nephrin ectodomain engagement resulterar i Src kinasaktivering, nefrinfosforylering, Nck rekrytering och aktinpolymerisation. J Clin Invest. 116: 1346–1359. 2006.