Nanomjölkprotein-slemkomplex: Karakterisering och anticancereffekt del 1

För mer information, kontaktatina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Denanticanceraktiviteten hos naturliga föreningar har nyligen lockat till multidisciplinär forskning. I denna studie undersöktes komplexbildningen av mjölkproteiner (MP) med Isabgol husk mucilage (IHM) och Ziziphus Spina Christi mucilage (NabM). I detta sammanhang mättes de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos mjölkproteinslemkomplex (MPMC) inklusive pH, Carrs index, vattenlöslighet och vattenabsorptionsindex, och flödesbeteendet studerades. Dessutom aminosyraprofilen, proteinsmältbarhet och fenoliska ochflavonoiderinnehållet av MPMC undersöktes och komplexens mikrostruktur visualiserades med hjälp av transmissionselektronmikroskopi. Deantioxidantoch anticancerpotenser hos MPMC mot två cancercellinjer, human levercancer HEPG-2 och bröstcancer MCF-7, i jämförelse med två normala cellinjer, nämligen Bj-1 och MCF{{ 3}}F, testades med användning av neutral röd upptagsanalys. Resultaten avslöjade att MPMC hade renande aktivitet mot DPPH-, ABTS- och HS-radikaler. Dessutom har MPMC potential att förhindra DNA-skador inducerade av oxidativ stress i Type-Fentons reaktion. Resultaten av den neutrala röda analysen visade signifikant tillväxthämning av både HEPG-2, MCF-7, medan ingen signifikant cytotoxisk effekt detekterades mot Bj-1 och MCF-12F. RT-qPCR-resultat indikerade MPMC-stimulerad apoptos som avslöjades av uppregleringen av pro-apoptos-genmarkörerna Caspase-3, p53, Bax. Under tiden nedreglerades genen mot apoptos Bcl-2. Ingen signifikant skillnad observerades dock i normala cellinjer som behandlats med MPMC. Sammanfattningsvis kan MPMC betraktas som en lovande anticancerenhet som kan användas i utvecklingen av nya cancerterapier med jämförbar aktivitet och minimala biverkningar jämfört med konventionella cancerkemoterapier .

Nyckelord: mjölkproteiner; Isabgol skalslem; Nabeq mucilage; mjölkproteinslemkomplex; anticanceraktivitet

Klicka för att lära dig mer om produkterna

1. Introduktion

Cancerär den primära dödsorsaken runt om i världen med cirka 10 miljoner dödsfall år 2020 [1]. Tidig diagnos och utvecklingen av nya terapier är det enda hoppet för att besegra cancer. Konventionella cancerbehandlingar som kemoterapi och strålning är relativt dyra och åtföljs av betydande biverkningar.

Därför tenderar vetenskapligt och forskningsintresse att använda naturliga föreningar (dvs. proteiner, polysackarider och polyfenoler) från deras källor som har anticarcinogen potential eftersom de anses ha mindre toxiska biverkningar jämfört med konventionella behandlingar.

Polysackariderfrån växtkällor har nyligen fått ökad uppmärksamhet på grund av deras bioaktiva egenskaper [2,3]. Många studier har varit intresserade av att isolera bioaktiva polysackarider och polyfenoler från naturliga växtkällor som frukt, grönsaker, spannmål och örter på grund av deras fördelaktiga farmakologiska effekter [4].

Plantago ovata (Psyllium eller Isabgol) och Ziziphus Spina-Christi (Nabeg eller Sidr) är kända källor till bioaktiva polysackarider. IHM och NabM valdes ut som lovande bioaktiva material. Tidigare studier indikerade att IHM- och NabM-komplex med mjölkproteiner förbättrade leverfunktionen och minskade risken för hjärt-kärlsjukdomar[5]. Isabgol husk har visat sig vara effektivt för behandling av diarré, förstoppning, ulcerös kolit, irritabel tarm, hyperkolesterolemi och diabetes. Dessutom tillskrevs anticancereffekten av isabgolskal mot kolorektal cancer till dess fiberinnehåll, som verkar för att minska dess effekter genom att minska transittiden. Detta kommer att leda till minskning av gallmetabolismen i tarmens mikroflora, utspädning av gallsyrorna genom avföring, förändring av mikrobiella gallsyrors metabolism på grund av fiberjäsning, sänkning av pH och produktion av kortkedjiga fettsyror, eller genom direkt bindning till gallsyror och därmed förhindra deras metabolism [6]. De huvudsakliga biologiskt aktiva komponenterna i Ziziphus Spina-Christi är vitamin C, fenoler, flavonoider och triterpensyra. Dess bioaktiviteter inkluderar anticancer, antibakteriella, antidiabetiska, antiproliferativa och antioxidantaktiviteter [7. Isabgol-skal- och Nabeq-frukter används för produktion av Isabgol-skalslem (IHM) respektive Nabeq-slem (NabM) [5].

Å andra sidan har proteinbaserade terapier för cancer fått ökat intresse på grund av nyckelfunktioner som låg cytotoxicitet, stark specificitet och enkel modifiering [8]. Förutom att tillhandahålla näringsbehoven för essentiella aminosyror, är mjölkproteiner bland de biologiska makromolekylerna som har många funktionella egenskaper såsom antioxidant, immunmodulerande, antidiabetiska, antimikrobiella och anticanceregenskaper [9,10]. Till exempel anticanceraktiviteten hos mejerihärledda peptider (dvs. -casomorfiner isolerade från -kasein och 1-kaseinfragment 90-95 och 90-96[Arg90-Tyr-Leu -Gly-Tyr-Leu95-(Glu96)]) som identifierats i mjölk från nötkreatur stödjer antagandet att mjölkproteiner inte bara är av näringsvärde utan också har potential för att förebygga och behandla cancer [11,12]

Komplexbildning mellan mjölkproteiner och polysackarider, såsom mjölkprotein-kitosankomplex, producerades tidigare som ett försök att förbättra de funktionella egenskaperna hos deras naturliga komponenter [13]. På grund av tillgängligheten och enkla förberedelser har sådana komplex potential att användas vid utvecklingen av billigare anticancerterapier. Sådana terapier kommer att vara billigare och uppvisa jämförbar aktivitet med de för närvarande använda kemoterapeutika.

Icke-kovalent bindning genom hydrofob och elektrostatisk interaktion är de primära faktorerna i sambandet mellan mjölkproteiner ochpolysackarider[14]. Dessutom visar proteiner överraskande motståndskraft mot interaktion med andra komponenter i pH-intervallet från 2 till 11. Vid ett specifikt pH ökar proteinets ytreaktivitet genom utvecklingen av proteinstrukturen [15].

I detta sammanhang har vår grupp nyligen fokuserat på mjölkproteinkomplexens funktionella roll för människors hälsa. Mjölkproteinkomplex med IHM eller NabM har dock uppvisat antihyperlipidemiska och leverskyddande egenskaper [9]. Sålunda, baserat på tidigare studier, postulerades det att mjölkprotein-polysackaridkomplex kan ha intressant anticanceraktivitet. Dessutom hade inga publikationer genomfört en studie av anticanceraktiviteten hos mjölkproteinkomplex med IHM och NabM. Därför var huvudsyftet med denna studie att karakterisera de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos de nyproducerade mjölkproteinslemkomplexen inklusive aminosyraprofilen och funktionella egenskaper hos dessa komplex. Dessutom undersöktes anticanceraktiviteten hos mjölkproteinkomplex med IHM- och NabM-slem mot två humana cancerceller (MCF7 och HEPG2) i jämförelse med icke-cancercellinjer (Bi-1 och MCF-12F ). Vi belyser också verkningssättet hos de producerade mjölkproteinslemkomplexen.

2. Resultat och diskussion

2.1. Fourier-transform infraröd (FTIR) spektroskopi

De infraröda spektra för IHM, MP och MP/IHM illustreras i figur 1A. Spektrum för IHM visade det karakteristiska bandet för arabinoxylaner vid 100-1200 cm-1 och banden för amid I- och amid II-grupperna vid 1550 respektive 1650 cm-1. MP-spektrumet visar band vid 1700-1600 och 1200-900 cm-I motsvarande amid I (främst C=O-sträckning av proteiner) respektive mjölkkolhydrater [16]. De tidigare nämnda topparna för IHM och MP var reserverade i spektrumet av IHM/MP-komplexet. På liknande sätt bibehölls de karakteristiska banden av galakturonsyra i NabM i spektrumet av NabM/MP-komplexet (Figur 1B). Detta skulle indikera frånvaron av kemisk interaktion mellan polysackaridslem och MP och därmed bekräfta den föreslagna mekanismen för elektrostatisk attraktion mellan MP och polysackarider (IHM och NabM). Sådana observationer är i linje med de av Vukic et al, som rapporterade komplexbildningen mellan vasslemjölksproteiner och pektin genom elektrostatiska och hydrofoba interaktioner som resulterade i god konsistens av komplexet [17].

2.2. Fysikalisk-kemiska och funktionella egenskaper hos MP och MPMC

Värdena för bulkdensitet (BD), tappad density (TD), Carr's Index och pH-mätningar listas i tabell 1. BD och TD för MP var högre än IHM och IHM hade den lägsta bulk- och tappeddensiteten av de testade proverna . På liknande sätt hade MP/IHM-komplexet signifikant (s<0.05) lower="" bulk="" and="" tapped="" density="" compared="" to="" mp/nabm.="" the="" obtained="" results="" indicated="" that="" the="" distribution="" and="" solubility="" of="" mp="" have="" been="" improved="" by="" complexation="" with="" the="" ihm.="" carr's="" index="" is="" frequently="" used="" as="" an="" indication="" of="" the="" flowability="" of="" powders.="" the="" results="" in="" table="" 1="" show="" that="" carr's="" index="" of="" mpmc="" was="" significantly="" lower="" than="" ihm="" which="" indicated="" that="" nabm="" improved="" the="" flowability="" of="" mp.="" this="" was="" probably="" due="" to="" the="" lower="" carr's="" index="" value="" of="" mp(30.6±="" 0.10%)="" compared="" to="" ihm="" and="" nabm="" (57.58±0.14="" and="" 53.97±0.11%,="" respectively)which="" are="" vicious.ihm="" is="" alkaline="" (7.79="" ph)="" while="" mp="" and="" the="" complexes="" with="" polysaccharide="" mucilage="" were="" slightly="" acidic="" which="" came="" in="" accordance="" with="" previously="" reported="" results="">

WSI och WAI är viktiga funktionella egenskaper inom livsmedelsteknik. Tabell 1 visar att WSI och WAI för MP ökade signifikant efter komplexbildning med IHM och NabM. Detta berodde mest på att Isabgol-baserade material är mycket vattenlösliga med en förtjockningseffekt efter tillsats av tillräckliga mängder vatten [19]. Dessutom har Qaisrani et al. rapporterade att arabinoxylaner av Isabgol-skal har en vattenhållande kapacitet som är upp till tio gånger så stor som deras torrvikt [20]. Dessutom har MP/IHM högre WSI och WAI än MP/NabM eftersom IHM har högre WSI och WAI än NabM. Dessutom ledde ökningen av WSI-procent för MPMC jämfört med MP till en ökning av spridningen av målaktiva komponenter när de användes i terapeutiska frågor [21]. Detta var tydligt i anticancerresultaten som visade att dessa komplex har en cytotoxisk effekt än MP.

2.3. Bioaktiva komponenter

2.3.1. Fenoliska föreningar av PHM och NabM

Mat innehåller mycket viktiga bioaktiva föreningar (dvs. fenoler och flavonoider) som fungerar som antioxidanter och anticancerpotenser. HPLC-analys bekräftade och kvantifierade förekomsten av många fenoliska föreningar i Nab och IHM som visas i figur 2. Resultaten visar det höga innehållet av olika biologiskt aktiva föreningar såsom gallsyra (177,96 mg/Kg), katekol (13,87 mg/Kg) p-hydroxibensoesyra (24,02 mg/kg), katekin (5,93 mg/kg) och rutin (123,70 mg/kg) i PHM-extrakt och katekol (410,72 mg/kg) p-hydroxibensoesyra (426,71 mg/kg) klorgensyra (72,05 mg/Kg) Rutin (1750,57 mg/Kg) och rosmarinsyra (1771,72 mg/Kg) i NabM (Figur 2A,B). Innehållet av dessa föreningar är mycket viktigt för hälsofördelarna. Anticancereffekten av fenolföreningar har tidigare rapporterats. Denna effekt tillskrevs främst antioxidanteffekten av dessa föreningar.

2.3.2. Total fenol-, flavonoid- och antioxidantaktivitet hos MP och MPMC

Flera rapporter har visat att föreningar som uppvisar antioxidantegenskaper oftast uppvisar anticanceraktivitet[22]. Totalt innehåll av fenol (TP) och totalt flavonoid (TF) bestämdes i NabM, IHM, MP och deras komplex (Figur 3A, B). Resultaten visade att TP och TF var högre i NabM och MP/NabM jämfört med IHM och MP/IHM. Emellertid var TP- och TF-halterna signifikant lägre i MP jämfört med MPC. Dessa resultat överensstämde med data som rapporterats av Singh et al.[23] som fann att TP och TF av NabM var 1,6 GAE mg/100 g torrvikt respektive 47 mg CE/100g torrvikt. MP/NabM- och MP/IHM-komplex visade en signifikant ökning med 309 procent och 59 procent i TP respektive 476 procent och 123 procent i TF jämfört med MP. Konjugering av MP med IHM och NabM ledde till förlust av 23 procent och 36 procent av TPC motsvarande IHM respektive NabM. TF reducerades med 44 procent i IHM och 46 procent i NabM vid komplexbildning med MP. Detta berodde troligen på den låga TP och TF för MP.

Den potentiella radikalfångande aktiviteten för MP/IHM och MP/NabM jämfört med MP med användning av DPPH, ABTS och HS illustreras i figur 3C-E. Data erhållna från de tre antioxidantaktiviteten hade en liknande trend som indikerar att NabM uppvisade högre antioxidantaktivitet än IHM och detta är i sammanhanget med resultaten av fenoler och

innehåll av flavonoider. Antioxidantkapaciteten hos MP ökade efter komplexbildning med NabM och IHM. Med undantag för ABTS-analysen ökade antioxidantaktiviteten hos NabM genom konjugering med MP. Antioxidantaktiviteten indikerade att MPMC hade högre antioxidantaktivitet jämfört med MP. Vår hypotes pekar på en möjlig interaktion mellan MP och polysackarider som leder till att man får den potentiella antioxidantaktiviteten som beskrivs av Li et al. [24]. Det har tidigare rapporterats att det finns en positiv korrelation mellan renskapaciteten och halten fenol/flavonoider 5]. Vi kan dock inte utesluta att nya bioaktiva peptider berikade med svavelinnehållande aminosyror produceras, vilket förklarar den höga antioxidantaktiviteten hos MPMC jämfört med de okomplexerade komponenterna. Dessutom frigörs de små peptiderna i vasslefraktioner vilket påverkar de höga antioxidantegenskaperna [4]. Slutligen påverkar fenol- och flavonoidinnehåll olika cancerceller. Dessutom, under in vitro cellodlingsanalyser, observerades dessa aktiviteter och mekanismer. Antioxidant- och anticanceraktiviteter hos fenoler tillskrivs dubbelbindningar och hydroxylsubstitutioner på de aromatiska ringarna [25].

2.4 Aminosyraprofil för MP och MPMC

Aminosyraprofiler för MP, NabM, MP/IHM och MP/NabMare illustrerade i figur 4. Det fanns inga signifikanta skillnader i aminosyraprofiler för MP och dess komplex med IHM och NabM. Detta indikerade att den icke-kovalenta interaktionen mellan MP och polysackaridslem inte förändrade sammansättningen av mjölkproteiner. Resultaten visar det höga innehållet av glutaminsyra i MP och MPMC (Figur 4) [26].

2.5. Reologiska egenskaper hos MP och MPMC

2.5.1.Synlig viskositet

Figur S1 visar viskositeten för proteinprover vid olika rpm-värden. IHM och NabM hade hög viskositet vid långsam rotation, men viskositeten minskade signifikant när rotationshastigheten ökade. Dessa fynd var i överensstämmelse med Chen och Che som registrerade att den skenbara viskositeten hos vattenlösligt slem av grön laver (Monostroma iridium) minskade genom att öka skjuvhastigheten [27].

Resultaten i figur S1 visar också att komplexbildningen av MP med IHM och NabM resulterade i en signifikant ökning (p Mindre än eller lika med 0.05) i MP:s skenbara viskositet. Detta skulle kunna tillskrivas de unika egenskaperna hos IHM (hydrokolloidmaterial) som har en viskositetshöjande effekt [28].

2.5.2. Flödesbeteende

Flödesbeteendet (skjuvspänning/skjuvhastighetskurvor) för mjölkproteiner och deras komplex illustreras i figur S2. Med ökningen i skjuvhastighet ökade skjuvspänningen. Omvandling av skjuvspännings- och skjuvhastighetsdata till effektlagsekvationen, värdena för flödeskonsistensindex (K) och flödesbeteendeindex (n) visas i tabell S1.IHM och MP/IHM hade det högsta flödeskonsistensindexet. Detta kan bero på den höga viskositeten hos vattenlösligt slem av IHM på grund av dess höga kapacitet att hålla vatten och gelning i ett vattenhaltigt medium. Resultaten visade också att IHIM, NabM och MP/IHM hade skjuvförtunnande beteende (icke-newtonska vätskor) med ett lågt n-värde från 0.25 till 0.64. Dessa resultat kom i enlighet med Thanatcha och Pranee som studerade de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos Ziziphus mauritiana[29]. Å andra sidan var n-värdet för MP ungefär 1(0.99) vilket indikerar Newtonskt flöde. På liknande sätt var n-värdet för MP/NabM-komplexet 0.95 som visas i tabell S1.

2.6.Differentiell skanningskalorimetri för MP och MPMC

Differentiell skanningskalorimetri användes för att undersöka den termiska stabiliteten hos MP och dess komplex med IHIM och NabM. Termogrammen för MP och MPMC illustreras i figur S3, och DSC-parametrarna finns i tabell 2. Det observerades att det inte fanns någon tydlig endotermisk topp på MP-termogrammet, men det fanns en framträdande endotermisk topp för MP/IHM och en bred endotermisk topp för MP/NabM. Detta beror förmodligen på den gradvisa elimineringen av fritt vatten, smältpunkten för NabM, långsam gelning och proteindenaturering [30].

Det noterades också att MPMC var mer värmestabilt än okomplexerat protein som observerats av den låga denatureringstemperaturen för MP (101,44 grader) jämfört med MP/IHM och MP/NabM (148,24 respektive 121,4 grader) som visas i tabell 2. Dessutom registrerades nedbrytningstemperaturen för MP till 302,3 grader, medan ingen nedbrytning av MPMC observerades med en temperaturökning upp till 350C. Dessa fynd stämde överens med flera studier, som fann att den termiska stabiliteten hos mjölkproteiner ökade genom interaktionen med fenoliska föreningar som förhindrade proteinaggregation [2,31].

Värmen som passerar in i eller ut ur systemet under en reaktion är entalpin (AH). Den högre entalpin för MP/IHM och MP/NabM jämfört med den för icke-komplexerade MP kan bero på den potentiella kemiska reaktionen mellan mjölkproteiner (vassle och kasein) och mellan mjölkproteiner och polysackarider vid hög temperatur (Maillard-reaktion)[ 31.

2.7 Transmissionselektronmikroskopi (TEM) av MP och MPMC

Figur 5 visar mikrostrukturen för IHM, NabM, MP och MPMC. Det visade sig att partikelstorleken för MPMC var i nanoområdet (114-250 nm), och den var mindre än partikelstorleken för MP(191-300 nm). Dessutom avslöjade TEM för MPMC (Figur 5D, E) det grenade mönstret för de bildade komplexen. Detta kan tillskrivas den elektrostatiska attraktionen mellan mjölkproteiner och polysackarider Goh, et al. [32]. Dessutom kan den större grenade strukturen av MP/IHM jämfört med MP/NabM vara ansvarig för dess högre viskositet som visas i figur S1.

2.8. Biologiska studier på MP och MPMC

2.8.1. Anticanceraktivitet hos MP och MPMC

Den cytotoxiska effekten av olika koncentrationer (1, 5, 10 och 20 ug/mL) av MP och MPMC på HepG-2- och MCF-7-celler jämfört med MCF-12F och Bij{ {7}} normala celler illustreras i figurerna 6 och 7. MPMC uppvisade anticancereffekt på HepG-2- och MCF-7-celler, figur 6A, respektive. Den doskänsliga kurvan uppvisade en minskning i cellviabilitet som svar på högre koncentrationer. Å andra sidan observerades ingen signifikant cytotoxisk effekt av MP och MPMC på Bj-1 och MCF-12F normala celler (Figur 6C, D). Våra resultat visade också att MP/NabM hade högre anticanceraktivitet mot HepG-2- och MCF-7-cancercellinjer, med IC50-värden 5,13 respektive 10,07 ug/mL. Dessutom uppvisade MP/IHM en måttlig cytotoxisk effekt mot cancercellinjer jämfört med respektive kontroller. Sammantaget tyder våra cytotoxiska data på att komplexbindning av MP med IHM och NabM signifikant förbättrar anticanceraktiviteten jämfört med okomplexerade mjölkproteiner, som visas i tabell 3. Det var också uppenbart att Hep G-2-celler var mer känsliga för MP och MPMC jämfört med MCF-7-celler som manifesteras av de lägre värdena på IC50.

Anticancereffekten av mjölkprotein-härledda antitumörpeptider har tidigare rapporterats. I detta sammanhang observerade Jeong och Hong [33] att trypsinhydrolysat av -laktalbumin hade en cytotoxisk effekt på human skelettcancer SJSA -1, human kolorektal cancer HCT 116 och humana magcancer NCI-N87 cellinjer. Det visade sig att o-laktalbumin interagerar med cellytemodulatorer och förändrar celltillväxthastighet, intracellulärt kalcium och kalciumtransporthastigheten [34]. Det är värt att notera att bovint laktoferrin inducerade apoptos i MCF7-celler på ett dosberoende sätt [35]. Dessutom visade kasein- och vassleproteinfraktionerna av mjölk antitumöreffekter i en djurmodell såväl som antiproliferativ aktivitet in vitro [36]. Dessutom har Elzoghby et al.[37] rapporterade att kaseinnanopartiklar kan användas för att kapsla in det hydrofoba anticancerläkemedlet, flutamid, för att kontrollera läkemedelsfrisättningen, förbättra dess antitumöraktivitet och minska dess levertoxicitet.

Anticancereffekten av IHIM och NabM har tidigare rapporterats [6,38]. Den cytotoxiska effekten av MP och MPMC kan tillskrivas närvaron av aminosyror som glutamin, arginin och cystein som rapporteras uppvisa anticanceraktivitet mot kolorektal cancer [39]. Dessa resultat överensstämmer med det höga innehållet av glutaminsyra i MPMC (Figur 5).

2.8.2. Bestämning av proteinnivån p53, Bax, Caspase-3 och Bd-2

För att undersöka cytotoxicitetsmekanismen för MPMC bestämdes nivån av apoptosmarkörproteiner p53, Bax, Caspase-3 och Bcl-2 i HepG-2, MCF-7 , Bj-1 och MCF-12F-cellinjer behandlade med ICs0 av MPMC (Figur 8). Nivån av pro- och anti-apoptotiska markörer är associerad med apoptosinduktion i cancercellinjer [40,41]. Resultaten visade att MP/NabM och MP/IHM förstärkte apoptos i HepG-2 och MCF-7, men inte i MCF-12F- och Bj-1-cellinjer. Nivån av kaspas-3, p53, Bax ökade signifikant jämfört med respektive kontroller (Figur 8), medan Bcl-2-protein reducerades i alla behandlingar. Intressant nog visade MP också en signifikant förändring i apoptosproteinmarkörer. Detta överensstämde med resultaten av anticancerstudien och kunde hänvisas till som den cytotoxiska effekten av ett antal mjölkproteinhärledda peptider som diskuterats ovan (avsnitt 2.8.1).

2.8.3.DNA-skadaskydd av MPMC mot oxidativ klyvning av RNH1-plasmid

RNH1-plasmid-DNA har tre former på agarosgelelektrofores ordnade från topp till botten som öppet cirkulärt, linjärt och superspolat cirkulärt DNA. Den oxidativa stressen av Fentons reagens inducerade DNA-skada. Därefter förändras nivån av DNA-former. Men öppna cirkulära och linjära former indikerar DNA-skada och supercoiled cirkulär DNA indikerar mer skyddspotential. I denna analys testade vi om MP och MPMC vid deras IC50 kan skydda mot nedbrytning av supercoiled cirkulär form som svar på oxidativ stress. Som ett resultat visade både MP/NabM och MP/IHM hög skyddskapacitet liknande DNA-kontroll (banorna 3 och 4, figur 9A). Å andra sidan observerades ingen signifikant skillnad i DNA behandlat med MP jämfört med DNA-kontroll och DNA behandlat med endast Fentons reagens (bana 5).

2.8.4.DNA-skadaskydd av MPMC mot oxidativ klyvning av genomiskt DNA

Med användning av PCR-tekniken undersöktes de skyddande egenskaperna hos MPMC på genomisk DNA-skada inducerad av Fenton-reaktionen. I allmänhet minskar DNA-skada kopieantalet av vissa gener, vilket ger lägre bandintensitet vid gelelektrofores. Banddensitets-MTHFR-genen av genomiskt DNA från blod inkuberat med Fentons reagens med och utan IC5s0 för MP, MP/NabM och MP/IHM testades. Det visade sig att MP/NabM och MP/IHM (banorna 3 och 4, figur 9B) förhindrade DNA-skada och skyddade därefter MTHFR-mallskärningsstället. Därför producerades högre PCR-produktbandintensitet i elektroforesgelen jämfört med respektive kontroller (Figur 9B). Dessa resultat indikerade att antioxidantaktiviteten hos MPMC hämmade produktionen av fria radikaler som medierade DNA-skada.

2.8.5. Genexpression

I överensstämmelse med erhållna data från apoptosproteinmarkören visade resultat av RT-qPCR att inkubation av HepG-2, MCF-7-celler med MP, MP/NabM och MP/IHM inducerade en signifikant uppreglering av pro- apoptotiska mRNA-markörer, nämligen Casp3, p53 och Bax, medan expressionsnivån för den anti-apoptotiska markören Bcl-2 var signifikant nedreglerad (Figur 10A-D). Kaspaser är aktörsproteiner som spelar en viktig roll vid initiering och upprätthållande av apoptos. Uppreglering av kaspas 3-protein indikerar dock utförande av den huvudsakliga inneboende vägen för apoptos (Figur 10A, B) som kännetecknas av kollapsen av mitokondriella membranet med Bax-inducerad cytokrom c-frisättning, och aktivering av kaspas 9 som leder till efterföljande ingrepp av kaspas 3 [42]. Uppreglering av Casp3, p53 och Bax, tillsammans med minskning av Bcl-2-uttryck avslöjade att MP, MP/NabM och MP/IHM utlöste apoptos. I detta avseende stimulerade uppreglering av p53 uttryck av Bax, vilket i sin tur kommer att inducera cytokrom c-frisättning, följt av kaspas-9 och -3-aktivering. Emellertid är Bcl-2 som en anti-apoptos känd för att hämma cytokrom c-frisättning [43], behandlingen resulterade i signifikanta minskningar av mRNA-transkriptnivåerna för den anti-apoptotiska markörgenen Bcl-2 p.g.a. MP/NabM- och MP/IHM-behandling, som underlättar obestridd Bax-inducerad cytokrom c-frisättning och efterföljande apoptos. I denna studie förmedlade MP/NabM allvarligt apoptos jämfört med MP/IHM och MP som observerats i (Figur 10). Observerade anti-cancereffekter av MP/NabMor MP/IHM fortsätter via modulering av ap53-beroende apoptosväg eftersom både dess protein- och mRNA-transkriptnivåer var signifikant uppreglerade.

Klicka på länken för att få mer information:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049190.html