Echinacosid utövar antitumöraktivitet vid levercancer
Mar 31, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Wen Li*, Jing Zhou, Yajie Zhang, Jing Zhang, Xue Li, Qiao Yan, Jiabing Han och Fangdi Hu*
Abstrakt
Bakgrund:Echinacosid (ECH) är den huvudsakliga aktiva ingrediensen i Cistanches Herba, som är känd för att ha terapeutiska effekter på metastatiska tumörer. Effekterna av ECH på levercancer är dock fortfarande oklara. Denna studie skulle undersöka effekterna av ECH på aggression av levercancerceller.
Metoder:Två typer av levercancerceller Huh7 och HepG2 behandlades med olika doser av ECH vid olika tidpunkter och gradienter. MTT- och kolonibildningsanalyser användes för att bestämma effekterna av ECH på livskraften hos Huh7 och HepG2-celler. Transwell-analyser och flödescytometrianalyser användes för att detektera effekterna av ECH-behandling på invasion, migration, apoptos och cellcykel av Huh7- och HepG2-celler. Western blot analys användes för att upptäcka effekter av ECH på uttrycksnivåerna av TGF-β1, smad3, smad7, apoptosrelaterade proteiner (Caspase-3, Caspase-8), och Cyto C i levercancerceller. Förhållandet mellan miR-503-3p och TGF-β1 detekterades med hjälp av bioinformatik analys och Luciferase reporter analys.
Resultat:Resultaten visade att ECH hämmade spridningen, invasionen och migrationen av Huh7- och HepG2-celler i ett dos- och tidsberoende sätt. Dessutom fann vi att ECH orsakade Huh7 och HepG2 cellapoptos genom att blockera celler i S-fasen. Vidare visade sig uttrycket av miR-503-3p reduceras i levertumörvävnader, men ECH-behandling ökade uttrycket av miR-503-3p i Huh7- och HepG2-celler. Dessutom fann vi att TGF-β1 identifierades som ett potentiellt mål för miR-503-3p. ECH främjade aktiveringen av signalvägen TGF-β1/Smad och ökade uttrycksnivåerna för Bax/Bcl-2. Dessutom kan ECH utlösa frisättningen av mitokondriell Cyto C, och orsaka reaktionen Caspases grad.
Slutsatser:Denna studie visar att ECH utövar antitumöraktivitet via miR-503-3p / TGF-β1 / Smad-axeln i levercancer, och ger ett säkert och effektivt antitumörmedel för levercancer.
Nyckelord: Echinacosid, Levercancer, Apoptos, MiR-503-3p, TGF-β1/smad
Cistanche är ett säkert och effektivt antitumörmedel för levercancer.
Införandet
Levercancer är en av de vanligaste maligna tumörer med hög incidens och förekomsten av levercancer har ökat snabbt [1]. Hepatektomi är det bästa sättet att behandla levercancer för patienter i början steg [2]. De flesta patienter har dock återfall och metastasering efter operationen. 5-årsöverlevnaden är bara ca 3–5 % [2]. Därför nya terapeutiska tillvägagångssätt och agenter behövs snarast.
Under de senaste åren har utvecklingen av cancerläkemedel och forskning om fytokemikalier har börjat uppmärksammas till etnofarmakologi [3, 4]. Ett stort antal kliniska och experimentella studier har visat att medicin monomerer kan hämma proliferationen, metastaseringen av hepatocellulära karcinomceller, inducera apoptos och differentiering av cancerceller [5]. Cistanches Herba är en växt som tillhör familjen växter, som är traditionell medicin i Kina och är känd som "ökenginseng" [6]. Cistanches Herba är rik på typer av kemiska komponenter, och forskare hemma och utomlands har isolerat mer än hundra föreningar från den, inklusive fenyletaninglykosider, lignaner, cykloalifatiska terpener, sockerarter, aminosyror etc. [7]. Echinacosid (ECH) är huvudkomponent i Cistanches Herba och anses också allmänt vara dess huvudsakliga aktiva ingrediens [6]. På senare tid år har studier visat att ECH kan vara ett nytt behandlingsalternativ för aggressiva eller allmänt metastatiska tumörer [8]. Studier har visat att ECH kan hämma bukspottkörteln cancer, leukemi, magcancer, endometriecancer och många andra tumörer [9]. Det finns dock ingen rapport om effekten av ECH på utvecklingen av levercancer.
MiRNA spelar centrala roller i post-transkriptionen reglering av genuttryck (10). Omfattande studier har visat att miRNA är nära besläktade med lever cancer [11] och multipel skleros. MiR-503-3p är en nyupptäckt miRNA som är involverat i spridning, migration och invasion av tumörceller [12]. Dess funktion vid levercancer är dock oklar. Nu forskningen av miRNA nedströms målgener är i en relativt moget stadium, men många målgenlokier kvarstår Oupptäckta. Te TGF-β1/Smad3 signaltransduktion vägen är särskilt viktig för tumorigenes och utveckling [13]. Det visade sig att TGF-β1/Smad3 vägen aktiverades i hepatommodellen, vilket tyder på att att TGF-β1/Smad3-vägen spelade en viktig roll i utvecklingen av levercancer [14]. Det höga uttrycket av TGF-β1 / Smad3-vägen anses vara en av de viktigaste orsakerna till förekomsten av levercancer [15]. För att ytterligare undersöka den underliggande mekanismen som medierade effekterna av ECH på levercancer, miRNA / TGF-β1/Smad3-vägen undersöktes.
I denna studie utvärderade vi effekterna av ECH på utvecklingen av levercancerceller och fann att ECH utövade en antitumöraktivitet via miR-503-3p/TGF-β1/Smad axel i levercancer, och ger ett säkert och effektivt antitumörmedel för levercancer.
cistanche tcmär anti-cancer.
Metoder och material
Material
Echinacosid (ECH) (renhet>98%, monohydrat) var erhållen från Hetian Dichen sashing Pharmaceutical Development Co., Ltd (Xinjiang, Kina). Den strukturella formeln visades i fig.
Cellodling och transfektion
Humana levercancercellinjer Huh7 och HepG2 var köpt från FENGHUISHENGWU (Hunan, Kina). Cellerna odlades i DMEM-medium kompletterat med 10 % serum från fostrets nötkreatur (FBS, Gibco, USA) vid 37 °C i en 5 % CO2-cellinkubator. MiR-503-3p efterlikna och miR-NC erhölls från Shanghai Gene Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Alla transfektioner utfördes användning av Lipofectamine 2000-reagens (Invitrogen) enligt tillverkarens anvisningar. Efter ytterligare 24-48 timmar, de transfekterade cellerna samlades in och bearbetades för vidare studier.
Luciferase reporter analys
Totala RNA extraherades från celler, och TGF-β var amplifed med WT- och MUT-primers. Ett fragment av TGF-β1 infördes i pGL3-Bashc luciferas reportervektor med namnet TGF-β-WT-Luc. Bindningen regionen β1 och miR-503-3p mutageniserades för att bilda en mutant plasmid betecknad som TGF-β1-Mut-Luc. TGFβ1-WT-Luc och TGF-β1-Mut-Luc samtransfekterades in i celler med miR-503-3p mimic och pRLTK. Celler var samlas 6 timmar efter transfektion. Dubbel-Luciferase Reporter Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA) användes för att bestämma luciferasaktivitet.
Celltillväxtanalys
Huh7- och HepG2-celler (2× 105 ) placerades i 96-brunnar Plattor. Cellerna behandlades sedan med ECH i 24, 36 och 48 timmar. Därefter tillsattes 10 ml MTT-lösning till varje väl och cellerna inkuberades i 4 timmar. Därefter 150 μL DMSO tillsattes till brunnarna. Och absorbansen vid 570 nm mättes av en ELISA-läsare (Aoweiya, Peking, Kina).
Kolonibildning
Encellig suspension framställdes från den transfekterade celler och odlas i en inkubator i 7 dagar. Efter att ha kasserat mediet färgades cellerna med Wrights fläck i 5 min och sedan färgad med Giemsa färglösning och Sorensen fosfolybdat bufer lösning (1:9) i 10 minuter. Efter tvättning räknades kolonier under ett mikroskop.
Transwell-analys
Migrations- och invasionsanalyser utfördes i Transwell-kamrar (Costar, Badhoevedorp, Te Nederländerna) belagda med eller utan Maribel (BD Biosciences) på den övre ytan av membranet 8-μm (porstorlek). För migrationsanalys transfekterade Huh7- och HepG2-celler suspenderades på 200 μL serumfritt DMEM medium och sådd i de övre kamrarna. För invasionsanalysen var Matrigel (30 μg/brunn) förbelagd på membran i de övre kamrarna och andra steg var samma som migrationsanalysen. Efter inkubation av 24 timmar, celler som hade migrerat eller invaderat genom membranet till den nedre ytan fixerades med etanol och färgades med 0,2% kristallviolett. Slutligen observerades celler och räknas i fem slumpmässiga fält med hjälp av ett mikroskop.
Cellcykelanalys
Huh7- och HepG2-celler såddes i 6-brunnsplattor vid en densitet av 1× 105 celler/ml. Celler samlades in efter att ha behandlats med ECH i 0, 24, 48 timmar. Tese-celler var då tillsatt med 1 ml is förkyld 75 % etanol, fixerad vid 20 °C i 2 timmar. Därefter tillsattes celler med PI-färgningslösning och inkuberades i mörker i 15 minuter. Cellcykeln analyserades sedan med flödescytometri.
Apoptotisk cellanalys
Cellerna pläterades i 6-brunnsplattor med en densitet av 5× 105 celler/brunn. Efter insamling centrifugerades cellerna och 195 μL annexin V-FITC-bindningslösning tillsattes för att återuppliva cellerna. Därefter 5 μL Annexin V-FITC och 10 μL propidiumjodidfärgningslösning tillkom. Celler inkuberades i mörkret och sedan placeras i ett isbad.
Cistanche skyddar levern.
Kvantitativ omvänd transkription PCR (qRT-PCR)
Totalt antal RNA extraherades med TRIzol-reagens (Haigene, Haerbin, Kina). Te viiA™ 7 PCR-system i realtid var används för qRT-PCR. RNA transkriberades omvänd till cDNA med BeyoRT™ First Strand cDNA-syntes Kit (Beyotime Institute of Biotechnology). U6 användes som endogen kontroll [16]. Primersekvenserna var följande:
miR-503-3p: framåt: 5′-CTGATGGTTAAGAGA ATGT-3′,
miR-503-3p: omvänd: 5′-GTCCTTGGACATCCG GGCCG-3′,
U6: framåt: 5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′,
U6: omvänd: 5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′.
Analys av western blot
De transfekterade cellerna samlades in och totalt antal proteiner extraherades. Proteinkoncentrationerna var bestämd med hjälp av BCA Protein Assay Kit. Proteinprover separerades med 10% SDS-PAGE och överförs till ett polyvinylidenfluoridmembran. Membranet inkuberades sedan med anti-TGF-β1 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina), SMAD3 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina), SMAD 7 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina), Bcl-2 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina), Bax (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina), Cyto C (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina), caspase-3 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina), caspase-8 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina) och anti-β-aktin-antikropp (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina) över natten. Tio membranet inkuberades med antikaninens sekundära antikropp (1:1000, Shifeng, Shanghai, Kina) [17].
Statistiska metoder
Uppgifterna presenterades som medelvärdet± för standardavvikelsen (SD). Alla statistiska analyser utfördes med SPSS 13.0-programvara. Studentens t-test användes för jämförelser. p-värde< 0.05="" was="" considered="">
Resultat
Effekt av ECH på mänsklig levercancercellaktivitet och spridning
För att undersöka effekten av ECH på human levercancercellfunktion utfördes MTT-analys och resultat visade att cellviabiliteten hos HepG2 (fig. 2a) och Huh7 (fig. 2b) minskade gradvis med ökning av dos och tid för ECH-behandling jämfört med med kontrollgruppen (p< 0.01).="" after="" 48="" h="" exposure="" of="" ech,="" the="" cell="" viability="" was="" the="" lowest,="" so="" 48="" h="" exposure="" of="" ech="" was="" selected="" for="" further="" experiment.="" colony="" formation="" assay="" results="" showed="" that="" the="" number="" of="" colonies="" of="" hepg2="" (fig.="" 2c)="" and="" huh7="" (fig.="" 2d)="" cells="" gradually="" decreased="" by="" treatment="" of="" ech="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" compared="" with="" the="" control="" group="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.001).="" these="" results="" indicate="" that="" ech="" plays="" an="" important="" role="" in="" hcc="" cell="" activity="" and="">
Effekter av ECH på mänsklig levercancercellmigration och invasion
Att ytterligare undersöka effekten av ECH på mänsklig lever cancercellfunktion, cellmigration och invasion var Upptäckt. Som framgår av fig. grupp utan behandling av ECH, migrationen och invasionen av Huh7- och HepG2-celler reducerades signifikant efter behandling av ECH på ett dosberoende sätt (p<0.01,><0.001), suggesting="" that="" ech="" inhibited="" the="" migration="" and="" invasion="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
ECH-reglerad distribution av levercancerceller hos människor och apoptos
För att undersöka effekten av ECH på levercancercellapoptos utfördes flödescytometri. Som visas i fig. 4a, jämfört med kontrollgruppen, procentandel av Huh7- och HepG2-celler i G0/G1-fasen reducerades signifikant efter behandling med ECH på ett dosberoende sätt (p<0.01), and="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" the="" s="" phase="" was="" gradually="" increased="" after="" ech="" treatment="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01), but="" there="" was="" no="" change="" of="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" g2/m="" phase="" after="" ech="" treatment="" (p="">0.05), vilket indikerar att ECH orsakade S-fasen arrestering av Huh7- och HepG2-celler. Dessutom, med ökning av dosen av ECH, apoptoshastigheten för Huh7 och HepG2-celler ökade gradvis jämfört med kontrollgrupp (fig. 4b, s<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" induced="" the="" apoptosis="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
Effekterna av ECH på TGF-β1 / Smad-vägen
Det är känt att TGF-β1 / Smad signalväg är väl involverad i cellapoptos. För att utreda mekanism för ECH-inducerad apoptos i HepG2-celler. Uttrycket för TGF-β1/Smad-signalvägen var Upptäckt. Jämfört med kontrollgruppen fann vi att ECH-behandlingen signifikant minskade uttrycket nivåer av TGF-β1 och Smad3 vid både mRNA (fig. 5a) och proteinnivåer (fig. 5b) och signifikant uppreglerade uttrycket av Smad7 på ett dosberoende sätt vid både mRNA- och proteinnivåer (p<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" inhibited="" the="" activation="" of="" the="" tgf-β1/smad="" signaling="">
TGF-β1 var ett direkt mål för miR-503-3p
Dessutom online-förutsägelseverktyget Starbase v2. visade att TGF-β1 var ett potentiellt mål för miR-503-3p (fig. 6a). Luciferas Rapportörens genanalysresultat visade att luciferasaktiviteten hos HepG2-celler och Huh7-celler samtransfekterade med miR-503-3p-mimik och TGF-β1-WT reducerades signifikant, men inte cellerna samtransfekterade med miR-503-3p mimic och TGF-β1-MUT (fig. 6b, p<0.01). similarly,="" the="" luciferase="" activity="" of="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-="" mut="" was="" signifcantly="" increased,="" but="" not="" the="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-wt="" (fig.="" 6c,=""><0.01). furthermore,="" the="" expression="" levels="" of="" tgf-β1="" were="" signifcantly="" reduced="" in="" the="" mir-503-3p="" mimic="" group="" compared="" with="" that="" in="" the="" nc="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.01), but="" signifcantly="" increased="" in="" the="" mir-503-3p="" inhibitor="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.05). these="" results="" suggested="" that="" tgf-β1="" was="" a="" direct="" target="" of="" mir-503-3p.="" to="" further="" investigate="" whether="" mir-503-3p="" mediated="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="" cancer,="" the="" expression="" of="" mir-503-3p="" was="" detected="" in="" liver="" cancer="" tissues="" and="" it="" showed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" were="" decreased="" in="" liver="" cancer="" tissues="" compared="" with="" that="" in="" normal="" liver="" tissues="" (fig.="" 6f,=""><0.01). moreover,="" the="" expression="" levels="" of="" mir503-3p="" were="" further="" decreased="" in="" metastasis="" liver="" cancer="" tissues="" than="" that="" in="" nonmetastatic="" liver="" cancer="" tissues="" (fig.="" 6g,=""><0.01). the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" were="" gradually="" increased="" after="" ech="" exposure="" (fig.="" 6e,=""><0.05,><0.01). taken="" together,="" these="" results="" suggest="" that="" mir-503-3p/tgf-β1="" may="" mediate="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="">
Effekt av ECH på cytokrom C och caspases aktiviteter
Som visas i fig. fann att ECH-behandling inducerade en signifikant minskning i uttrycksnivåerna av Bcl-2 i en dosberoende sätt (p<0.01,><0.001), while="" the="" expression="" levels="" of="" bax="" were="" signifcantly="" increased="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01,><0.001). it="" was="" demonstrated="" that="" bcl-2="" and="" bax="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells.="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" cyto="" c,="" caspase-8,="" and="" caspase-3="" were="" signifcantly="" increased="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" (fig.="" 7b,=""><0.01,><0.001), indicating="" that="" the="" release="" of="" cyto="" c="" and="" the="" activation="" of="" caspase-8="" and="" caspase-3="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="">
Diskussion
Kirurgisk resektion är den huvudsakliga behandlingsmetoden för patienter med levercancer, och återfalls- och metastaseringsfrekvensen efter leverresektion är hög [18, 19]. I detta studie, vi fann att ECH har en viss hämmande effekt på levertumörer, och ger ett säkert och effektivt antitumörmedel för levercancer. Klinisk praxis har visat att traditionell kinesisk medicin effektivt kan lindra de kliniska symtomen hos levercancerpatienter [20]. För ECH har studier visat att ECH har antioxidant, antidepressiva, antiinflammatoriska, antivirala, antitumör- och antibakteriella effekter [21, 22]. I kolorektal cancer, ECH kan inducera tumörcellsapoptos genom uppreglering caspase-3 och klyvning DNA-reparationsenzymer för att inducera DNA-oxidation [23]. I denna studie fann vi för den första tid som ECH utövar antitumöraktivitet via miR503-3p / TGF-β1 / Smad-axeln vid levercancer.
Den intercellulära fasen av cellcykeln hos eukaryota celler kan delas in i G1, S och G2. Förordningen pekar på av cellcykeln vid olika perioder regleras av olika reglerande faktorer [24]. Denna studie visade att andelen Huh7- och HepG2-celler i G0/G1 och G2/M-fasen reducerades och andelen celler i S-fasen ökades efter ECH, vilket indikerar att ECH orsakade S-fasstopp av Huh7- och HepG2-celler. Obalans av apoptos är en av de viktigaste mekanismerna för mänskliga tumörer. Det har rapporterats att antitumör kemoterapeutiska läkemedel inducerar i allmänhet apoptos av cancerceller och kontrollera cancerprogression. I vår studie, vi fann också att ECH kunde inducera levercancerceller apoptos på ett dosberoende sätt, vilket tyder på att inducera cancercellsapoptos kan vara en av de underliggande mekanismerna för ECH på levercancer.
MiRNA spelar nyckelroller i regleringen av HCC-celler spridning, cykel, apoptos, migration genom interaktioner med olika signalvägar och molekyler [25, 26]. Till exempel konstaterades att miR-26a är mycket uttryckt i normala leverceller, men det är signifikant nedreglerad i levercancerceller och hämmar proliferation [27]. Överuttryck av miR-503-3p inducerar apoptos av lungcancerceller och hämmar cellinvasion och migration [28]. Dessutom har ett stort antal studier visat att TGF-β1/Smad-signalvägen spelar en avgörande roll i utvecklingen av levercancer [7]. Dessutom, när levercancer fortsätter att utvecklas, uttrycket av TGF-β1 rapporteras vara gradvis ökat [29]. I denna studie fann vi att ECH nedreglerade TGF-β1 och Smad3 och uppreglerade Smad7, som visar att ECH hindrade aktiveringen av signalvägen TGF-β1/Smad. I denna studie har vi fann att uttrycket av miR-503-3p befanns minskas i levertumörvävnader, men ECH-behandling ökade uttrycket av miR-503-3p i Huh7 och HepG2-celler. Dessutom fann vi att TGF-β1 var identifieras som ett potentiellt mål för miR-503-3p. ECH främjade aktiveringen av TGF-β1/Smad-signalerna väg och ökade uttrycksnivåerna för Bax / Bcl-2. Dessa resultat tyder på att miR-503-3p / TGF-β1 / Smad signalvägen kan förmedla effekterna av ECH på levercancer. Det har varit känt att den ökade Bax/ Bcl-2-förhållandet kan orsaka att Cyto C i mitokondrierna är släpps ut i cytoplasman. Cyto C interagerar med Caspase-8 och bildar en apoptotisk kropp som sedan rekryterar och aktiverar Caspase-3, vilket orsakar Caspases-kaskaden och främjar celldöd [30]. I denna studie fann vi att ECH minskade uttrycket av Bcl-2 och ökade uttrycket av Bax, Cyto C, caspase-8 och caspase-3. Dessa resultat tyder på att ECH kan reparera mitokondriella skada i viss utsträckning.
Slutsats I denna studie fann vi att ECH-behandling hämmade spridning, invasion och migration, och inducerade apoptos av levercancerceller. Den underliggande mekanismen av ECH-behandling på levercancerceller befanns vara relaterad till signalvägen miR-503-3p/TGF-β1/Smad. Denna studie kommer att ge en viss experimentell grund för forskning av ECH på antitumör. Det är värt att notera att den föreliggande studien är begränsad av bristen på djur Experiment. Därför kommer vår framtida studie att utföra djurförsök för att ytterligare bekräfta våra resultat.
