Neuroprotektiva effekter och mekanismer av procyanidiner in vitro och in vivo del 2
Mar 21, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
3. Diskussion
Flera studier har visat att datorer uppvisar starka radikalfångande och antioxidantaktiviteter ]25-27I, och att oxidativ stress orsakad av överdriven produktion av ROS och/eller försämring av antioxidantförsvarssystemet spelar en avgörande roll vid neurodegenerativa sjukdomar [ -6,28,29]. Däremot är de neuroprotektiva effekterna och mekanismerna hos datorer angående oxidativ skada fortfarande oklara. Därför undersökte den här studien effekterna och mekanismerna hos datorer i neuroskydd.
I den aktuella studien förbättrade lämpliga koncentrationer av PC:er nivåerna av antioxidantenzymer, inklusive GSH-Px, CAT och SOD, men minskade nivåerna av ROS och MDA i modeller av oxidativ skada jämfört med mätningar med enbart H, O. Dessa nuvarande fynd överensstämde med tidigare studier som antydde att ett lågt PC-tillskott via kosten kan förbättra aktiviteterna av GSH-Px, CAT och SOD hos avvanda smågrisar [30]. En annan studie antydde också att datorer signifikant ökade CAT- och SOD-aktiviteter och minskade MDA-innehållet, vilket förbättrade kvaliteten på getspermier [31].
Cistanche kan förbättra immuniteten
Nrf2/ARE-vägen är en betydande antioxidantväg [32-34]. Normalt finns Nrf2 i cytoplasman, där det är bundet till det hämmande proteinet Keap135,36]. Vid H2O2-stimulering dissocierar Nrf2 från Keap1, initierar det endogena antioxidantförsvarssystemet och translokerar därefter in i kärnan [34,37,38]. Den interagerar sedan med ARE för att aktivera en serie cellskyddande gener och antioxidantgener, inklusive GCLC, GCLM, NOO1 och HO-139,40]. Som svar på oxidativ stress, liknande förändringar som ses under H-O2-stimulering, dissocierar Nrf2 från Keap1 i cytosolen och translokeras sedan in i kärnan och binder till ARE-sekvensen för att aktivera transkription av kryoskyddande gener [41,42]. Vi observerade att lämpliga koncentrationer av PC: er underlättade nukleär lokalisering av Nrf2 under H, O 2- lesionsförhållanden i PC12-celler. Dessutom uppreglerade de lämpliga koncentrationerna av PC uttrycksnivåerna av NOO1, HO -1, GCLM och GCLC, som alla direkt kan verka för att eliminera fria radikaler och oxidativa molekyler [43]. Därför visade dessa resultat att lämpliga koncentrationer av PC: er ökade nivåerna av Nrf2/ARE-vägen. Därefter användes Nfr2-genavstängning via Nrf2 siRNA för att ytterligare bedöma rollen av Nrf2/ARE-aktivering i PCs-medierat neuroskydd mot H, O 2-inducerad oxidativ skada. Nrf2-siRNA-transfekterade celler indikerade en markant minskning i Nrf2-uttryck. Samtidigt fann vi att Nrf2 knockout avskaffade PC-medierat skydd mot H2O-behandlade försämringar i cellviabilitet, och Nrf2 knockout avskaffade också antioxidanteffekterna av PC:er. Dessa fynd överensstämde med en tidigare studie som antydde att förbättring av aktiveringen av Nrf2/ARE-vägen bidrar till neuroskydd [44]. Därför indikerar de nuvarande resultaten att Nrf2/ARE-vägen kan representera ett farmakologiskt mål för datorer för att förhindra neurodegeneration.
4. Material och metoder 4.1. Kemikalier och reagenser
H2O2 köptes från HUSHI (HUSHI, Shanghai, Kina). CCK-8, NAC köptes från Beyotime (Beyotime, Shanghai, Kina). PC, 2',7/-diklorfluoresceindiacetat, MDA, GSH-Px, SOD-diagnostiksatser och CAT-diagnostiksatser köptes från Solarbio (Solarbio, Peking, Kina).RNAi Plus, PrimeScript RT-reagenskit med gDNA Eraser och SYBR Premix Ex Tag II köptes från Takara (Takara, Shiga, Japan). Nrf2-siRNA, kontroll-siRNA och lipofectamine 2000 erhölls från GenePharma (GenePharma, Shanghai, Kina). Följande primära antikroppar och motsvarande sekundära antikroppar erhölls från Proteintech (Proteintech, Wuhan, Kina): Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, lamin B och GAPDH.
4.2. Cell kultur
PC12-celler erhölls från National Collection of Authenticated Cell Cultures. Cellerna hölls i DMEM-medium kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum och penicillin-streptomycin (100 U/mL; 100 ug/mL) i en fuktad inkubator vid 37 grader med 5 procent CO2.
4.3. Cellviabilitetsanalyser
PC12-celler såddes i 96-brunnsplattor med en densitet av 1×104 celler/brunn. Cellerna exponerades för olika koncentrationer av PC eller NAC (20 μM) i 24 timmar, varefter de inkuberades med 200 μM H2O2 i 24 timmar. Därefter tillsattes 10 μL CCK-8lösning till varje brunn och inkuberades i 1 timme, varefter absorbansen mättes vid 450 nm.
4.4. Underhåll av fisk
Etiskt godkännande för djuranvändning beviljades av djurskydds- och användningskommittén vid försöksdjurscentret vid Zhejiang University (ZJU20200125). Vuxna zebrafiskar (Danio rerio, AB-stam) erhölls från laboratoriedjurscentret vid Zhejiang University och hölls vid 28±1C under en 14/10-h ljus/mörkercykel [21J. Fiskarna matades med Artemia nauplii två gånger dagligen. För att producera embryon placerades vuxna zebrafiskar över natten i uppfödningstankar i förhållandet 1:1, hane:hona. Leken utlöstes inom 2 timmar efter att lamporna tändes nästa morgon. Embryon växte upp i embryovatten vid 28 grader [45].
4.5. ROS-mått
För att mäta ROS-produktion in vivo exponerades zebrafisklarver (AB-stam), 3 dagar efter befruktning (pdf) för NAC (30 μM) eller olika koncentrationer av PC:er i frånvaro eller närvaro av 300 μM H,O, under 4 dagar. Därefter, vid 7 pdf, överfördes de olika behandlingsgrupperna till en 24-brunnsplatta (10 zebrafisklarver per grupp) behandlad med 20 uM 2',7'-diklorfluoresceindiacetatlösning och inkuberades i 60 minuter i mörkret vid 28,5 grader C[46]. Därefter tvättades larverna tre gånger med embryomedium för att avlägsna överskott av 2'7'-diklorfluoresceindiacetat. De färgade larverna observerades sedan och avbildades under ett Olympus laserskannande konfokalmikroskop. Den fluorescerande intensiteten för varje enskild larv kvantifierades via programvaran Image].
För att mäta ROS-produktion In vitro såddes PC12-celler i 6-brunnsplattor med en densitet av 2×10* celler/brunn. Cellerna exponerades för olika koncentrationer av PC eller NAC (20 uM) under 24 timmar och inkuberades sedan med 200 uM H2O, under 24 timmar. Cellerna inkuberades med 10 μM 2',7'-diklorfluoresceindiacetatlösning i mörker under 30 minuter; därefter avlägsnades färglösningen och cellerna tvättades tre gånger i fosfatbuffrad saltlösning. Cellerna observerades sedan och avbildades under ett Olympus laserskannande konfokalmikroskop. Cellernas fluorescerande intensiteter kvantifierades via programvaran Image].
4.6.Utvärdering av MDA, GSH-Px, SOD och CAT
Zebrafisklarver (AB-stam) vid 3 pdf exponerades för NAC (30 μM) eller olika koncentrationer av PC:er i frånvaro eller närvaro av 300 uM H2O, under 4 dagar. 7 dpf zebrafisken bedövades med tetrakain och homogeniserades efter dödshjälp på is. MDA, GSH-Px, CAT och SOD analyserades samtidigt enligt tillverkarens instruktioner. Varje experiment innehöll 20 larver och varje uppmätt index upprepades i tre exemplar.
PC12-celler såddes i 6-brunnsplattor med en densitet av 2 x 10* celler/brunn. Cellerna exponerades för olika koncentrationer av PC eller NAC (20 uM) i 24 timmar och inkuberades sedan med 200 uM H2O, i 24 timmar. PC12-celler samlades sedan upp och inkuberades med lysbuffert. MDA-, GSH-Px-, SOD- och CAT-aktiviteter mättes med hjälp av motsvarande analyskit, enligt varje tillverkares protokoll. Varje uppmätt index upprepades i triplikat.
4.7.Total RNA-extraktion, omvänd transkription och kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion
Zebrafisklarver (AB-stam) vid 3 dpf exponerades för NAC (30 μM) eller olika koncentrationer av PCs i frånvaro eller närvaro av 300 uM H, O, under 4 dagar. Efter behandlingar extraherades RNA med användning av RNAiso, enligt tillverkarens instruktioner. RNA omvänt transkriberades med användning av ett PrimeScript RT Kit med ett gDNA-radergummi, enligt tillverkarens instruktioner (Takara, Shiga, Japan). Kvantitativ realtids-PCR utfördes med ett Applied Biosystems Vi-7 realtids-PCR-system med användning av SYBR Premix Ex TaqII-aktin användes som referensgen, och det relativa genuttrycket beräknades med hjälp av 2-AACt metod. De använda primersekvenserna är listade i tabell 1.
4.8. Nrf2 siRNA-transfektion
Nrf2-siRNA användes för att slå ner Nrf2. PC12-celler såddes i 6-brunnsodlingsplattor och transfekterades sedan med Nrf2-siRNA (80 nM) eller kontroll-siRNA med användning av Lipofectamine 2000, enligt tillverkarens instruktioner.
4.9. Framställning av helcells-, cytoplasmatiskt och nukleärt protein
För helcellsproteinextraktion uppsamlades celler och inkuberades med RIPA-lysbuffert innehållande 1 procent PMSF och 1 procent proteashämmarcocktail under 30 minuter på is. Cellysat centrifugerades och supernatanten uppsamlades och lagrades. För subcellulär fraktioneringsberedning bearbetades cellprover med användning av nukleärt och cytoplasmatiskt proteinextraktionskit. Proteininnehållet analyserades med användning av BCA-analysen. 4.10.Western Blotting
Alikvoterade proteinprover upplöstes med SDS-PAGE och överfördes till polyvinyliden-difluoridmembran. Blotterna inkuberades sedan med följande primära antikroppar: Nrf2, Keapl, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B eller GAPDH. Membranet tvättades sedan med TBST under 5 min; detta upprepades 5 gånger. Därefter inkuberades blottar i peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar. Slutligen visualiserades proteinband med användning av ett ECL-plus Western blotting-detektionsreagens.
4.11. Lokomotorisk beteendeanalys
Zebrafisklarver （AB-stam） vid 3 pdf exponerades för NAC（30 μM） eller olika koncentrationer av PC:er i frånvaro eller närvaro av 300 μM H2O, under 4 dagar. Därefter, vid 7 pdf, pläterades dessa behandlade larver i 24-brunnsplattor (en fisk per brunn och 12 larver per grupp). Vi använde Any-labyrint 4.73 för att mäta rörelsebeteendet hos zebrafisklarver och beräknade den totala sträckan tillryggalagd på 10 minuter [47].
4.12.Statistisk analys
Data visas som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD) för minst tre oberoende experiment. Envägsvariansanalys (ANOVA) och Duncans multipla intervalltester användes för att bestämma statistisk signifikans, och skillnaderna ansågs signifikanta när p<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">
5. Slutsatser
Sammanfattningsvis indikerar de aktuella resultaten att datorer utövar neuroprotektiva effekter genom att aktivera Nrf2/ARE-vägen och dess nedströms avgiftningsenzymer och antioxidantenzymer. Sammantaget kan datorer ha en skyddande effekt på neurodegenerativa störningar.
Författarbidrag:Konceptualisering, JCandJZ.(Jiajin Zhu); metodik, JC; mjukvara, YC; validering, YZ., JZ(Jiawen Zhao) och HY; formell analys, JC; undersökning, YC; resurser, JZ(iajin Zhu); datakurering, JC; skrift—original utkast förberedelse, JC; skrivande—granskning och redigering, JZ.(iajin Zhu); visualisering, JC; övervakning, DL; projektadministration, JZ(Jiajin Zhu); finansieringsförvärv, JZ(Jiajin Zhu). Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.
Finansiering:Denna forskning fick ingen extern finansiering.
Uttalande av institutionell granskningsnämnd:Studien genomfördes enligt riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av Ethics Committee of Animal Conservation and Use Committee vid Experimental Animal Center vid Zhejiang University (ZJU20200125). Informerat samtycke: Ej tillämpligt.
Datatillgänglighetsförklaring:Data finns i artikeln. Intressekonflikter: Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Provtillgänglighet: Prover av föreningarna är inte tillgängliga från författarna.
Den här artikeln är extraherad från Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules
