Neuroprotektiva effekter av Glochidion Zeylanicum bladextrakt mot H2O2/Glutamat-inducerad toxicitet i odlade neuronala celler och A-inducerad toxicitet i Caenorhabditis Elegans
Oct 09, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Enkel sammanfattning:Antioxidanter som är inbördes relaterade i processen att övervinna oxidativ stress-inducerad toxicitet och neurit-utväxt-inducerande aktivitet har blivit huvudmålen för neuroprotektiv terapi. Metanolextraktet av Gloclidion zeylanicum (GZM) uppvisar neuroprotektiva egenskaper som inte bara är begränsade mot H2O2/glutamat/A-förolämpningar utan också främjar neuritutväxtaktivitet. De neuroprotektiva effekterna av GZM-extrakt bekräftades i odlade neuronala (HT-22 och Neuro-2a) celler och C.elegans-modeller. Så vitt vi vet är denna studie den första att rapportera för de neuroprotektiva effekterna av GZ M-extrakt, vilket tyder på att G.zeylanicum kan vara en neuroprotektant sökande för förebyggande och lindring av oxidativ stress-inducerade neurodegenerativa störningar, inklusive Alzheimers sjukdom. Ytterligare studier krävs dock för att identifiera de mekanistiska vägarna som är involverade i neuroprotection och för att bekräfta effektiviteten av extraktet i mer komplexa modellorganismer.
Sammanfattning: Oxidativ stress spelar en avgörande roll i utvecklingen av åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar. Tidigare har Glochidion zeylanicum metanol (GZM) extrakt rapporterats ha antioxidant- och anti-aging egenskaper. Effekten av GZM på neuroskydd har dock inte rapporterats ännu; dessutom förblir mekanismen involverad i dess antioxidantegenskaper olöst. Studien syftar till att demonstrera de neuroprotektiva egenskaperna hos GZM-extrakt och deras underliggande mekanismer i odlade neuronala (HT-22 och Neuro-2a) celler och Caenorhabditis elegans-modeller. GZM-extrakt uppvisade skyddande effekter mot glutamat/H2O 2-inducerad toxicitet i odlade neuronala celler genom att undertrycka genereringen av intracellulära reaktiva syrearter (ROS) och förbättra uttrycket av endogena antioxidantenzymer (SODs, GPx och GSTs). GZM-extrakt utlöste också uttrycket av SIRT1/Nrf2-proteiner och mRNA-transkription av antioxidantgener (NQO1, GCLM och EAAT3) som är huvudregulatorerna för cellulärt försvar mot oxidativ stress.cistanche tubulosa fördelar och biverkningarDessutom uppvisade GZM-extrakt skyddande effekter för att motverka -amyloid (A)-inducerad toxicitet i C. elegans och främjade neuritogenesegenskaper i Neuro-2a-celler.cistanche stamVåra observationer tyder på att GZM-bladextrakt har intressant neuritogenes och neuroprotektiv potential och kan möjligen fungera som potentiell utmanare för behandling av oxidativ stress-inducerad Alzheimers sjukdom (AD) och relaterade neurodegenerativa tillstånd; detta måste dock studeras vidare i andra in vivo-system.
Nyckelord:Glochidion zeylanicum; glutamat; anyloid-;H2O2; neuritutväxt; Nrf2/SIRT1;antioxidant; Caenorhabditis elegans;HT22;Neuro-2a
1. Introduktion
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv neurologisk sjukdom som orsakar kognitiva störningar och minnesproblem hos patienter [1]. De typiska markörerna för AD-histopatologi är ackumuleringen av neurofibrillära trassel (NFT) av hyperfosforylerat tau-protein och -amyloid (A)-plack i hjärnvävnaden, vilket leder till neuronal dysfunktion och celldöd [1]. De onormala ansamlingarna av A- och tau-protein påverkar neuroplasticitet och neurodegeneration, vilket korrelerar väl med de kognitiva symtomen hos AD-patienter [1,2]. Bevisen stöder att oxidativ stress-associerad neuronal cellskada spelar en avgörande roll i patogenesen av AD [3]. Oxidativ stress är nära förknippad med neurotoxicitet, särskilt genom att främja A-aggregation och mitokondriell skada, vilket utlöser neuronal celldöd [1]. Glutamat är den främsta excitatoriska signalsubstansen som har ansetts vara en initierande faktor för neuronal död i flera neurodegenerativa störningar[4,5]. Dessutom är den höga nivån av ackumulering av reaktiva syrearter (ROS) nära relaterad till neuronal skada av glutamat [4,6,7], som uppstår via receptormedierad excitotoxicitet och icke-receptormedierad oxidativ toxicitet [4,6].
Cistanche kan anti-aging
Prevalensen av AD ökar bland åldrande befolkningar[1]. För närvarande finns det få effektiva läkemedel tillgängliga för AD-behandling. Men de läkemedel som används för att behandla AD utövar olika biverkningar [1,8]. På senare tid har antioxidantföreningar betraktats som väsentliga tillskott för alternativ behandling och förebyggande av AD [9]Förebyggande mot oxidativ stress-inducerad neuronal toxicitet är en nyckelparameter för att hjälpa neuroskydd [10]. Därför kan naturliga bioaktiva föreningar som finns i örter eller växter med potenta antioxidanter och neuroprotektiva effekter tillhandahålla kompletterande och alternativa tillvägagångssätt för behandling eller förebyggande av AD och andra neurodegenerativa störningar.
Glochidion zeylanicum(Gaertn.) A.Juss.(familjen Phyllanthaceae)(GZ), hemmahörande i östra Asien inklusive Thailand, är en rik källa till antioxidantföreningar.cistanche tubulosa extraktI vår tidigare studie visades bladextraktet av GZ främja oxidativ stressbeständighet och uppvisa anti-aging effekter i nematoden Caenorhabditis elegans genom DAF-16/FoxO och SKN-1/Nrf{{3 }} signalvägar. [11,12]. Ändå har de neuroprotektiva och neuritogenesegenskaperna hos GZ-extrakt inte rapporterats.
Den aktuella studien undersökte de neuroprotektiva effekterna av GZ-extrakt och dess underliggande mekanismer på neurodegenerativa händelser med hjälp av odlade neuronala (HT-22 och Neuro-2a)celler och C.elegans-modeller. Vi undersökte också neuritogenesegenskaperna hos GZ-extrakt i samband med neuritutväxt. Studien ger experimentella bevis för GZ-extrakt och dess tillämpningar i förebyggande eller behandling av neurodegenerativa tillstånd som involverar oxidativ stress. 2. Material och
Metoder
2.1.Kemikalier och reagenser
Alla kemikalier och reagens som användes i studien köptes från Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) och Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Antikroppar (både primära och sekundära) anskaffades från Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) (Supplementary Materials).
2.2. Växtutvinning
Glochidion zeylanicum (GZ) blad samlades in av Mrs. Laong Kwunpet och Mrs. Korakod Choosri från Jana-distriktet, Songkhla-provinsen, i södra Thailand (7,205278 grader N, 100,596944 grader E). Växtproverna deponerades för identifiering på Kasin Suvatab- handhu herbarium, institutionen för botanik, naturvetenskapliga fakulteten, Chulalongkorn University, Thailand (kupongprov nr. BCU-016061). Torkade och malda löv (40 g) extraherades med metanol (400 ml) med användning av en Soxhlet-apparat som tidigare beskrivits [11]. Extrakten filtrerades och indunstades vid 35-45 grad. GZ-metanol GZM)-extraktet framställdes i DMSO och lagrades vid -20 grad som en stamlösning.
2.3. Kvalitativ fytokemisk screening
Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) av GZM-extrakt utfördes vid RSU Science and Technology Research Equipment Center, Rangsit University, Thailand för analys av de kemiska beståndsdelarna (Supplementary Materials).
2.4.Cellkultur
Cellkulturer bibehölls som tidigare beskrivits [13]. HT-22-celler (Salk Institute, CA, USA) odlades i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) och Neuro-2a-celler (The JCRB Cell Bank, Osaka, Japan) hölls i Ham's Nutrient Mixture F12, kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum och 1 procent streptomycin. Båda cellerna odlades vid 37 grader med 5 procent CO2-atmosfär.
2.5.Cellbehandling
Förbehandling av HT-22- och Neuro-2a-celler utfördes med olika koncentrationer (0.5-10 ug/mL) av GZM-extrakt under 48 timmar. Glutamat eller H2O2 blandades sedan i odlingsmediet för att inducera celltoxicitet. För skyddsanalyser sambehandlades extraktet med glutamat (HT-22:18h, Neuro-2a:24h) eller H2O2(15min). DMSO (0,1 procent v) fungerade som kontrollgrupp. Det fanns ingen betydelse mellan DMSO-behandling och obehandlad kontroll (Figur S3, kompletterande material).
2.6.Bestämning av cellviabilitet
Cellviabiliteten bestämdes med användning av MTT- och LDH-analyser. Detaljerna finns i tilläggsmaterialet. 2.7. Mätning av intracellulär ROS
Mätningen av intracellulär ROS genererad vid behandling analyserades med DCFH-DA-färgämne som tidigare beskrivits [11]. Detaljerna finns i tilläggsmaterialet.
2.8.RNA-isolering och kvantitativ RT-PCR
RNA-extraktion utfördes med TRIzol-reagens. Kvantitativ realtids-PCR utfördes med standardförfaranden[13]. Primersekvenserna är listade i tilläggsmaterialet. -aktin användes som normaliseringskontroll [7,13,14] (Supplementary Materials).
2.9. Western blot-analys
Proteiner erhölls från Neuro-2a-celler genom lys 1X med användning av RIPA-buffert innehållande proteashämmarecocktail (PMSF) och kvantifierades med Bradford-analys. Kortfattat underkastades protein elektrofores genom 10 procent SDS polyakrylamidgel, följt av överföring till PVDF-membran och blockering (5 procent skummjölk).cistanche tubulosa recensionerMembranen utsattes för immunoblotanalys med användning av respektive antikroppar (SIRT1, fNrf2 och -aktin (Supplementary Materials). Fullständiga bilder av blottarna tillhandahålls i de kompletterande materialen (Figur S2).
2.10.Neuritutväxtanalys
Neuritutväxt på GZM-extrakt utfördes enligt Eik et al. i Neuro-2a-celler och antalet neuritbärande celler och neuritlängd mättes [15](Supplementary Materials).
2.11. C.elegans stammar och kulturförhållanden
Alla C. elegans-stammar som användes i studien anskaffades från Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, USA) och underhålls med Escherichia coli OP50 som födokälla[16]. Nematoderna odlades i NGM-agarplattor vid 16 grader och synkroniserade populationer utvecklades som beskrivits tidigare [7,12]. Stammar som används i denna studie inkluderar CL4176(smg-1(cc546) I;dvls27[(myo-3p:A-Beta(1-42):let-8513'UTR) plus rol-6(su1006)]X),CL2006 (dvls2 [pCL12(unc-54/human Abeta-peptid 1-42minigen) plus pRF4),CL2355(smg-1( cc546)dvls50[pCL45(snb-1:Abeta1-42:3'UTR(long) plus mtl-2:GFP]I), och CL2122(dvls15[(pPD30.38)unc -54(vektor) plus (pCL26)mtl-2:GFP. Nematoderna behandlades med olika koncentrationer (1,25, 2,5 och 5 ug/mL) av GZM-extrakt med DMSO (1 procent v/v) ) som kontroll.
2.12. Förlamningsanalys
Transgena maskar (CL4176 och CL2006) som uttrycker mänskligt A 1-42 användes för att studera effekten av GZM mot A-toxicitet[17]. Den transgena masken CL4176 uttryckte och aggregerade mänskliga A 1-42-peptider i muskelcellerna efter en temperaturförskjutning till 25 grader, vilket ledde till oxidativ stress och förlamning [17]. Den transgena masken CL2006 uttrycker konstitutivt A längs kroppsväggsmusklerna vilket leder till progressiv förlamning i vuxen ålder [17]. För A-oberoende effekter användes CL802-stam som kontroll. Maskarna synkroniserades och behandlades med GZM-extrakt i L4-stadiet.
CL4176-maskarna hölls vid 16 grader i 48 timmar och skiftades till 25 grader för att inducera A-uttryck. Antalet förlamade maskar mättes vid 20,22,26,28 och 30 timmar efter temperaturförskjutningen.
CL2006-maskarna hölls vid 16 grader och klassificerades som förlamade när de inte svarade på beröring eller visade halo-utseende runt maskarnas huvuden. Förlamade maskar klassificerades och uteslöts från plattorna varannan dag.
2.13. Kemotaxianalys
De transgena stammarna CL2122 och CL2355 användes för identifiering av A-inducerade defekter i kemotaxibeteende. De transgena maskarna (L4-stadiet) behandlades med GZM-extrakt vid 16 grader i 36 timmar och skiftades sedan till 23 grader i 36 timmar för att inducera A 1-42-uttryck. Efter behandlingsperioden tvättades plattorna och nematoderna placerades i mitten av plattan. Den lockande sidan innehöll en blandning av diacetyl (0,1 procent i absolut etanol) och natriumazid (1 M) på plattan. Den motsatta sidan av plattan (kontroll) innehöll en blandning av absolut etanol och natriumazid (1M). Maskar som drogs mot lockmedels- och repellerande sidorna räknades och kemotaxiindexet beräknades (antal maskar på lockande plats - antalet maskar vid kontrollplatsen)/det totala antalet maskar).
2.14.Statistisk analys
Data visas som medelvärde ± SEM. Datahantering och statistisk bearbetning slutfördes med GraphPad Prism 8.0 och analyserades med envägs ANOVA, följt av Bonferronis test. och p Mindre än eller lika med 0.05 ansågs vara signifikant.
3. Resultat
3.1. Mätning av optimala glutamat- och HzO2-förhållanden i odlade neuronala (HT-22- och neuro-2a)celler
Neuronal cellskada inducerad av oxidativ stress är ett stort fenomen i neurodegenerativa tillstånd [3].cistanche StorbritannienDe optimala förhållandena vid vilka H2O2/glutamat inducerar neurotoxicitet i HT22- och Neuro-2a-celler undersöktes. Exponering av HT-22- och Neuro-2a-celler för olika doser av glutamat (2.5-10 mM) och HzO2 (100 till 400 uM) under 1-24h och {{ 12}} min. För H2O2-behandling fann vi att cellviabiliteten för båda cellerna minskade med 50 procent jämfört med den obehandlade kontrollen efter behandling med 20 och 400 uMH2O2 under 15 minuter i HT22- respektive Neuro-2a-celler (Figur la,b) ).I fallet med glutamatbehandling erhölls en minskning av cellviabiliteten med 50 procent vid 5 och 10 mM glutamat i HT22(18h) respektive Neuro-2a-celler (24 timmar) (Figur 1c,d) ). Därför användes dessa optimala betingelser i följande experiment.
3.2. Neuroskyddande effekter av GZM-extrakt mot H2O2/Glutamat-inducerad neuronal död i odlade neuronala (HT-22 och neuro-2a) celler
Cytotoxiciteten för GZM-extrakt i båda cellerna undersöktes för att undersöka den icke-dödliga koncentrationen. Behandling med GZM-extrakt (0.5-10 ug/mL) utfördes under 48 timmar i HT22- och Neuro-2a-celler. Jämfört med DMSO-kontrollen påverkade GZM-extraktbehandling (0.5-10 ug/mL) inte cellviabiliteten för båda cellerna (Figur le,f). Resultaten visade att GZMextract är icke-toxiskt vid de testade doserna (0.5-10 ug/ml). Därför användes dessa koncentrationer i efterföljande experiment.
De tids- och dosberoende svaren av H4O2/glutamat stödde och bekräftade den experimentella modellen för neurotoxicitet i odlade neuronala (HT22 och Neuro-2a)celler (Figur la-d). Cellöverlevnaden, när den behandlades med enbart H2Oz, var signifikant lägre (ungefär 50 procent) än DMSO-kontrollcellerna. Dock sambehandling med GZM
3.2. Neuroskyddande effekter av GZM-extrakt mot H2O2/Glutamat-inducerad neuronal död i odlade neuronala (HT-22 och neuro-2a) celler
Cytotoxiciteten för GZM-extrakt i båda cellerna undersöktes för att undersöka den icke-dödliga koncentrationen. Behandling med GZM-extrakt (0.5-10 ug/mL) utfördes under 48 timmar i HT22- och Neuro-2a-celler. Jämfört med DMSO-kontrollen påverkade GZM-extraktbehandling (0.5-10 ug/mL) inte cellviabiliteten för båda cellerna (Figur le,f). Resultaten visade att GZMextract är icke-toxiskt vid de testade doserna (0.5-10 ug/ml). Därför användes dessa koncentrationer i efterföljande experiment.
De tids- och dosberoende svaren av H4O2/glutamat stödde och bekräftade den experimentella modellen för neurotoxicitet i odlade neuronala (HT22 och Neuro-2a)celler (Figur land). Cellöverlevnaden, när den behandlades med enbart H2Oz, var signifikant lägre (ungefär 50 procent) än DMSO-kontrollcellerna. Samtidig behandling med GZM På samma sätt förbättrade sambehandling med GZM-extrakt avsevärt cellviabiliteten jämfört med den för glutamatbehandlade celler (Figur 3a-c,f). Dessutom försvagades glutamatinducerad LDH-frisättning också genom GZM-behandling (Figur 3c, d). Resultaten tyder på att GZM-extrakt utövade en inflytelserik neuroprotektiv effekt mot H2O2/glutamat-inducerad neurotoxicitet.
Den här artikeln är extraherad från Biology 2021, 10, 800. https://doi.org/10.3390/biology10080800 https://www.mdpi.com/journal/biology
