Del 1: Acteosid undertryckt Microglia M1-polarisering genom hämmad NF-KB-signalväg och AMPK-medierad mitokondrierfunktionsåterställning

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Snälla klicka här till del 2

Abstrakt:

Bakgrund:Alzheimers sjukdom (AD)är den vanligaste typen av demens. Medanakteosid från cistancheört(ACT), en förening isolerad från Cistanchetubulosa, besitter neuroprotektiva egenskaper. Den underliggande mekanismen för att reglera mikrogliapolarisering förblir dock dåligt definierad.Metoder:Häri användes den AlCl3-inducerade AD-modellen i zebra¦shlarver för att avslöja den terapeutiska effekten av ACT. BV-2-celler användes för att demonstrera rollen av ACT på mikrogliapolarisering. RNA-sekvens, HPLC-Q-TOF-MS, western blot och molekylär dockning kombinerades för att bekräfta dess mekanism.Resultat:ACT förbättrade avsevärt den experimentella dyskinesien och störningar i nervsystemet hos zebra. Därefter undertryckte det M1-polarisering och främjades till M2-fenotypen i LPS-inducerade BV-2-celler. Vi visade först att ACT utövade en djupgående transkriptomisk inverkan, som involverade reglering av viktiga signalvägar i in§amation, argininbiosyntes, såväl som pantotenat- och CoA-biosyntes, som korrelerade med mitokondriernas funktion. SPELA TEATER(akteosid från cistancheört) behandling minskade mikroglia M1-polarisering genom att hämma NF-KB-signalvägen. Och de metaboliska vägarna bekräftades ytterligare av HPLC-Q-TOF-MS. Dessutom korrigerade ACT överdriven ROS för att återställa mitokondriernas funktion genom AMPK-medierad PGC-1 och UCP-2 uppreglering, i överensstämmelse med metabola förändringar. Spännande nog kan ACT binda direkt till både NF-KB och AMPK, vilket framgår av molekylär dockning.Slutsatser:Forskningen gav en infusiv mekanism för ACT och illustrerade ett nytt perspektiv baserat på mitokondriell dysfunktion för att avslöja sambandet mellan metabolism och mikrogliapolarisering.

Bakgrund:

Alzheimers sjukdom(AD) är en vanlig neurodegenerativ sjukdom som åtföljs av kognitiv funktionsnedsättning och dyskinesi[1]. Det kännetecknas av allvarlig neuronal förlust, senila plack och neuro-brillära trassel[2]. Patogenesen av AD är multidimensionell och kopplad till neuroin§amation. Neuroin§amation drivs av aktivering av gliaceller, nära relaterad till utvecklingen av AD[3, 4]. Under progressionen och exacerbationen av neuroin§amation anses mikroglia vara nyckelfaktorn. Microglia är de primära immuncellerna i det centrala nervsystemet. Det är nära förknippat med en kaskad av processer, som innehåller hjärnans utveckling, upprätthåller en neutral miljö, samt svarar på skador och reparationer[1]. Dessutom kan mikroglia stimuleras till en M1-fenotyp och uttrycket av pro-in§ammatoriska cytokiner ökar när neuroin§amationsrelaterade sjukdomar som AD inträffade[5]. Studier visar också att polariseringen till M1-fenotypen ofta åtföljs av metabola störningar[6], vilket orsakar obalans i energimetabolismen och mitokondriell dysfunktion[7]. Dessa negativa förändringar härrör från neurodegeneration, till och med AD.

akteosid från cistancheört(ACT), en fenyletanoidglykosid, härrör främst från Cistanchetubulosa. Ökande bevis har föreslagit att ACT hade många farmakologiska aktiviteter, inklusive neuroprotektiva[8], antiin§ammatoriska[9] och antioxidant[10] effekter. Speciellt har ACT rapporterats förbättra inlärnings- och minnesförsämring samt uppreglera energimetabolismen hos streptozotocininducerade råttor [11]. Det har också föreslagits att hämma neuronal apoptotisk celldöd och mitokondriell skada i de experimentella autoimmuna encefalomyelitmössen [12]. Men färre studier har fokuserats på effekten av ACT på mikroglia M1/M2-polarisering. Speciellt olika mekanismer, såsom reparation av mitokondriernas funktion och reglering av cellmetabolism, har inte utförts. Dessutom har mekanismen för ACT bidragit till mikroglia M1/M2-polarisering förblivit outforskad.

Den här rapporten syftade till att undersöka den terapeutiska effekten av ACT såväl som den underliggande molekylära mekanismen för ACT i AD. Häri visade ACT en signifikant neuroprotektionseffekt i AlCl3-inducerade AD-zebrashlarver. Dessutom hämmade ACT effektivt M1-polarisering och främjade M2-fenotypen i LPS-inducerade BV-2-celler. RNA-Sequencing (RNA-Seq) integrerad med metabolomics metod för att bättre förstå den underliggande mekanismen för ACT för att reglera mikroglia polarisation. Överhörningen mellan metabolism och mikrogliapolarisering i termer av mitokondriell funktion undersöktes. Denna studie kommer att ge ny respekt för den fortsatta undersökningen av ACT som ett potentiellt terapeutiskt medel för behandling av AD.

Metoder:

Djur och modellgruppering:

Vildtypszebra¦sh (AB-stam, 4 månader gammal) valdes i denna studie (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). De hölls under en 14/10 timmars ljus/mörkercykel vid 28 grader, enligt den tidigare metoden[13]. Naturligt gödningsmedel och normalt utvecklade embryon genererades och odlades till 3 dagar efter befruktning (dpf) i en belysningsinkubator. Alla zebra¦sh-experiment utfördes under överinseende av Animal Ethics Committee of China Pharmaceutical University.

Zebra¦sh-larver delades in i sex grupper och behandlades från 3 dpf till 7 dpf: kontrollgrupp, modellgrupp, modell plus donepezilhydroklorid (DPZ) grupp, modell plus ACT-grupper. Kontrollgruppen hölls i mediet med 0,2 procent DMSO och modellgruppen behandlades med 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Modellen plus DPZ-gruppen sambehandlades med AlCl3 och 8 μM DPZ. Modellen plus ACT-grupper sambehandlades med AlCl3 och olika koncentrationer av ACT (200, 100, 50 μM). SPELA TEATER(akteosid från cistancheört)(HPLC-renhet större än eller lika med 98 procent) erhölls från Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kina). AlCl3·6H2O och DPZ köptes från Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, Kina).

Beteendeanalys

Zebra¦sh-larvers rörelser registrerades med en ViewPoint beteendeanalysator (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) vid 28 grader. Kortfattat, beteendeparametrarna och resultatbearbetningen överensstämde med den metod vi etablerade tidigare[13]. Här valdes medelhastighet (AS), hastighetsförändring (ΔS), återhämtningshastighet för dyskinesi (DRR) och svarseffektivitet (RE, procent) för att utvärdera återhämtning av dyskinesi i zebra¦sh.

Efter behandling från 3 dpf till 7 dpf, samlades zebra¦sh-larver upp för att mäta AChE- och ChAT-aktivitet. Baserat på tillverkarens protokoll detekterades aktiviteten av de enzymkopplade immunosorbentanalyssatserna (ELISA) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kina). Och proteinkoncentrationerna i olika prover bestämdes med BCA-metoden.

BV-2-celler såddes i en 6-brunnsskål separat (n=6/grupp). Efter behandling avlägsnades mediet och cellerna tvättades tre gånger med kall PBS. Sedan omedelbart utsatt för flytande kväve för att undertrycka cellernas ämnesomsättning. Cellerna skördades med kall 80 procent metanol (1 ml/brunn) och suspensionen överfördes till ett 2 ml Eppendorf-rör. För att underlätta proteinutfällning, virvlade kraftigt i 1 min och centrifugerades vid 13, 000 rpm i 15 minuter vid 4 grader. Cellsuspensionen överfördes till ett nytt 2 mL Eppendorf-rör och torkades under en ström av kväve och lagrades vid -80 grad fram till analys. Den torkade återstoden rekonstituerades i 150 μL förkyld 25 procent acetonitril. För att säkerställa stabiliteten och noggrannheten i sekvensanalysen kombinerades lika volymer (10 μL) av varje cellprov som kvalitetskontrollprover (QC). Under metabolitdetektion injicerades dessa prover efter var sjätte cellprov för att bekräfta deras stabilitet. En 1 μL alikvot injicerades för HPLC-Q-TOF-MS.

HPLC-Q-TOF-MS-analys utfördes på Agilent 1290 HPLC-system kopplat till masspektrometern Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separationen utfördes på en ACQUITY UPLC BEH C18-kolonn (2,1×100 mm, 1,7 μm). Den mobila fasen bestod av 0,1 procent myrsyra-vatten (v/v; A) och acetonitril (B).

§flödeshastigheten sattes till {{0}},4 mL/min med följande optimala gradientelueringsvillkor: 0 till 2 min, 5 procent B; 2 till 20 min, 5 procent till 95 procent B (positivt jonläge); O till 2 min, 5 procent B; 2 till 20 min, 5 procent till 95 procent B (negativ jonläge). Masspektrometerns driftsparametrar ställdes in enligt följande: gastemperatur, 320 grader; torkgas, 10 l/min; nebulisator, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V.

Rådata kördes under MassHunter Workstation Software version B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Rådata förbehandlades av XCMS-plattformen. Huvudkomponentanalys (PCA) och partiell minsta kvadraters diskriminantanalys (PLS-DA) av normaliserade data utfördes med MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Kombinerat med litteratur, de differentiella metaboliterna (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">