Fytokemisk screening och östrogen aktivitet av totala glykosider av Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt

Under decennierna har det gjorts kontinuerliga ansträngningar för att förbättra människors livskvalitet. Postmenopausalt syndrom är ett allvarligt problem för kvinnors välbefinnande. Hormonterapi är för närvarande grundpelaren i behandlingen av detta tillstånd. Men denna terapi kan leda till östrogenmissbruk, vilket leder till biverkningar och biverkningar. Som ett resultat av detta har hormonbehandling inte varit framgångsrik för att lindra postmenopausalt syndrom.Cistanche deserticolaär en klassisk stärkande ört inom traditionell kinesisk medicin. Det uppvisar betydande östrogen aktivitet. De viktigaste aktiva föreningarna i denna ört är glykosider. I ett tidigare experiment identifierades tre viktiga faktorer som bidrar till det totala glykosidutbytet, akteosidutbytet och östrogenaktivitet, nämligen eluentkoncentration, pH och eluentvolym. I detta experiment bestämdes en optimal reningsprocess med hjälp av en central kompositdesign-respons-ytmetodik för att erhålla glykosider från denna ört. En eluentkoncentration (etanol) på 85 procent och volymen 25 BV vid ett pH av 11 visade sig vara optimal. Tjugoen aktiva föreningar identifierades med en högpresterande vätskekromatografi/kvadrupol-tids-flight-masspektrometrianalys. Denna studie ger värdefulla insikter för ytterligare djupgående forskning som utvärderar de östrogena aktiviteterna hos totala glykosider avCistanche deserticola.

Nyckelord: Central kompositdesign; Cistanche deserticola totalglykosider; LC/Q-TOF-MS; reningsteknik; livmodertillväxttest.

Introduktion

Cistanche deserticolaär en ätbar, klassisk stärkande ört. Den nämndes först i Shen Nongs örtklassiker och togs in i högsta klass. Det är en varm ört och söt. Det har många medicinska egenskaper, såsom näring av lever och njure, stärkande av muskler och skelett, och förbättring av immunförsvaret tillsammans med anti-aging och anti-tumöraktiviteter [1-4]. Vissa naturliga föreningar har isolerats och identifierats från extrakten av denna ört, de viktigaste är fenyletanoidglykosider, lignanoider, iridoider, polysackarider och alkaloider [5-8].

Läkemedlen som erhålls från medicinalväxter innehåller olika aktiva föreningar, som i första hand är ansvariga för deras terapeutiska verkan. Effekten av samma läkemedel som erhållits från olika växtkällor kan variera på grund av skillnaderna i typen och mängden av aktiva föreningar som finns i det. Därför är det viktigt att identifiera och kvantifiera alla aktiva föreningar som finns i läkemedlen som erhålls från medicinalväxter. Detsamma gäller C. deserticola. Responsytmetodik är en experimentell metod för att undersöka interaktionen mellan olika faktorer samtidigt [9-10]. Den kan användas för optimering av extraktionsparametrar för fytoläkemedel och kvantitativ uppskattning av aktiva föreningar i läkemedel. Central composite design (CCD) är en av de experimentella designerna som är användbara i responsytmetodik. Jämfört med ortogonala och enhetliga konstruktioner har CCD högre precision och bättre förutsägbarhet [11].

Det postmenopausala syndromet kan avsevärt minska livskvaliteten hos kvinnor. Normalt används östrogen för att behandla detta tillstånd. Långvarig användning av östrogen kan dock leda till missbruk och därigenom orsaka olika biverkningar och biverkningar. Därför är det absolut nödvändigt att välja en alternativ behandling, helst ett växtbaserat läkemedel som innehåller östrogen som en aktiv ingrediens för behandling av postmenopausalt syndrom [12-13].

I ett preliminärt experiment identifierades strukturerna av olika naturliga föreningar erhållna från C. deserticola med hjälp av masspektrometri (MS) [14]. Det bekräftades att glykosider är de huvudsakliga aktiva föreningarna med signifikant östrogen aktivitet [14-15]. För att utveckla en säker och effektiv östrogenaktiv ingrediens i ett nytt läkemedel behövs en fördjupad undersökning av TGCD efter rening. I denna studie användes CCD först för att optimera reningen av de totala glykosiderna av C. deserticola (TGCD). Därefter användes livmodertillväxttestet för att utvärdera de östrogena aktiviteterna av samma glykosid. Högpresterande vätskekromatografi/kvadrupol-tids-flight-masspektrometri (HPLC/Q-TOF-MS) användes för kvalitativ analys av föreningarna av TGCD efter rening. Denna process användes för att explicit demonstrera närvaron av olika aktiva föreningar med östrogen aktivitet i TGCD. Detta kan samtidigt ge grunden för dess kliniska användning vid postmenopausalt syndrom som ersätter östrogen.

Experimentell procedur

Instrument

Agilent 1290 HPLC-system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), Agilent 6530 series quadrupole time-of-flight LC/MS (Q-TOF) system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) och Chemical HPLC{ {5}}D-arbetsstationer användes som kromatografiska instrument för databehandling. Milli-Q ultrarent vatten användes för hela studien. AR1140 elektronisk analytisk våg (Ohaus International Ltd.); 680 mikroplattläsare (Bio-Rad Corporation); och 64R höghastighetscentrifug (Beckman Coulter Allegra) användes för provberedning.

Droger och kemikalier

C. deserticola köptes från läkemedelsmarknaden och identifierades av prof. Zhang Delian (Harbin University of Commerce, Kina). Standard dietylstilbestrol (99 procent ren, parti nr. 60518) köptes från Dr. Ehrenstorfer (Tyskland). Andra standarder akteosid (111530-200505) och echinakosid (111670-200503) erhölls från National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Peking, Kina. Renheten för varje standard var > 98 procent. Acetonitril (ACN), metanol och myrsyra (MS-kvalitet) köptes från Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL, USA). Ultrarent vatten erhölls från Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (Hangzhou, Kina). Alla kommersiellt tillgängliga reagens var av analytisk kvalitet.

Beredning av totala glykosider av C. deserticola reningslösning

Efter nedsänkning i 75 procent etanol under 12 timmar extraherades det råa pulvret av C. deserticola (100 g) med 800 ml 75 procent (v/v) etanol vid 80 grader under 150 minuter under återflöde. Den filtrerades sedan genom ett dubbeldäcksfilter och extraherades därefter med 800 ml 75 procent etanol två gånger under ytterligare 150 minuter. Därefter kombinerades filtraten och koncentrerades i vakuum vid 45 grader. Extraktet erhölls genom att avlägsna lösningsmedlet. En viss mängd destillerat vatten sattes till extraktet för att erhålla en koncentration av 0,5 g/ml, vilket användes för att screena reningsprocessen.

För adsorption med AB-8 makroporöst harts justerades testprovlösningens pH till 11. Först användes 2 BV-destillerat vatten för att tvätta bort föroreningarna. Därefter eluerades elueringsmedlet vid en koncentration av 25 BV 85 % etanol och samlades upp. Slutligen slogs den uppsamlade renade eluenten samman. En viss mängd destillerat vatten sattes till extraktet för att erhålla en koncentration av 1,5 g/ml, som användes för intragastrisk administrering. För positiv kontroll framställdes dietylstilbestrollösning (20 ug/ml) med dietylstilbestrolpulver.

Enligt reningsförhållandet ({{0}}.6) överfördes en viss mängd av extraktet (motsvarande 1 g C. deserticola) till en 10 ml mätkolv, löstes i 50 % (v/v) metanollösning i ett ultraljudsbad under 5 minuter och späddes till 10 ml. Den medicinska lösningen erhölls efter filtrering av supernatanten genom ett 0,45 μm filtermembran. Akteosid och echinakosid (1 mg vardera) blandades och löstes upp fullständigt i en 10 ml 50% (v/v) metanollösning. Slutligen filtrerades standardlösningen genom ett 0,45 μm Millipore-filter före analys.

LC-MS-förhållanden

Kromatografiseparation utfördes i ett HPLC-system (Agilent 129{{10}}), utrustat med ett kvartärt lösningsmedelstillförselsystem, vakuumavgasare och fotodiodmatrisdetektor. MS/MS-analys utfördes i ett instrument Agilent-1290 HPLC/6530 Q-TOF-MS-system, utrustat med en elektrosprayjoniseringskälla i både positiv och negativ jonläge. En Waters Symmetry shield RP C18-kolonn (4,6 × 250 mm, 5 μm) (Waters Corporation, Milford, MA, USA) användes för separation. Den mobila fasen omfattade 0,2 procent myrsyravattenlösning (volym/volym) (A) och ACN (B), och den pumpades med en flödeshastighet av 0,5 ml/min. Injektionsvolymen för varje prov var 10 μL. Gradientelueringsprogrammet var som följer: 5–23 procent B i 0–35 minuter, 23–25 procent B i 35–65 minuter och 25–5 procent B i 65–70 minuter. Kolonntemperaturen hölls vid 30 grader. Kromatogrammen övervakades och registrerades vid 330 nm. Finfördelningsgastrycket sattes till 30 Psi och kapillärspänningen var 3,5 kV. Flödeshastigheten för torr gas var 8 l/min vid en temperatur av 30 grader. Temperaturen för mantelgasen sattes till 400 grader vid en flödeshastighet av 12 L/min. Kollisionsenergin sattes till 10–20 eV för lågenergiskanningar och 30–50 eV för högenergiskanningar. Masspektradata registrerades inom skanningsområdet 50–1000 Da i positiva och negativa jonskanningslägen. I denna studie genomfördes en snabb och effektiv jämförelse mellan TGCD och standarderna under samma LC-MS-förhållande.

Uterus tillväxt test

Detta utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i vägledningen för vård och användning av försöksdjur från National Institutes of Health. Alla experimentella förfaranden granskades och godkändes av Animal Ethical Committee vid Harbin University of Commerce, Kina.

Omogna Kunming-honmöss (cirka 21 dagar efter födseln, avvanda) som vägde 12 ± 2 g, köptes från Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center (Changchun, Kina). Mössen hölls i ett temperaturreglerat rum (22 ± 2 grader) med mat och vatten ad libitum. Djurförsök initierades efter fem dagars acklimatisering. Mössen fastade över natten med vatten ad libitum före intragastrisk administrering av testlösningen.

Mössen delades slumpmässigt in i 22 grupper, med 10 djur i varje grupp. De administrerades experimentella läkemedel av samma volym två gånger om dagen (morgon och kväll) under fyra dagar enligt följande:

Grupp 1: Intragastriska totala glykosider av C. deserticola reningslösning (20 ml/kg), (lösningsvolym/musvikt),

Grupp II: Intragastiskt destillerat vatten (negativ kontrollgrupp), och

Grupp III: Intragastrisk dietylstilbestrol (20 ug/ml) (positiv kontrollgrupp).

På den femte dagen offrades alla möss. Livmodern avlägsnades omedelbart och vägdes och livmoderkoefficienterna beräknades.

Statistisk analys

Ett tvåsidigt t-test med parvis prov användes för att identifiera statistiskt signifikanta skillnader i de olika parametrarna i de olika experimentgrupperna. Analysen utfördes med hjälp av SPSS statistisk programvara (SPSS för Windows v21.0, SPSS Inc., USA). Skillnaderna ansågs vara statistiskt signifikanta vid en konfidensnivå på 95 procent (p <>

resultat och diskussion

Linjäritet och korrelation mellan akteosid och totala glykosiderutbyten

Den linjära regressionsekvationen för akteosidutbytet var y {{0}}x – 14,75 (där x är koncentrationen av akteosid och y är dess motsvarande topparea) med en korrelationskoefficient på r=1 i koncentrationsintervallet 0.12−{{10}},72 mg/mL. Detta indikerade en linjär kalibreringskurva. Den linjära regressionsekvationen för det totala glykosiderutbytet var y=26.074x plus 0,0866 (där x är koncentrationen av totala glykosider och y är dess motsvarande topparea) med en korrelationskoefficient på r { {12}}.9982 i koncentrationsintervallet 0,013−0,065 mg/ml. Detta indikerade också en linjär kalibreringskurva.

Metodologisk utredning

Precisionen, reproducerbarheten, stabiliteten och återhämtningen av proverna undersöktes i den metodologiska undersökningen. I precisionsexperimentet var den relativa standardavvikelsen (RSD) för akteosid och totala glykosider 1,43 procent respektive 0.05 procent. I reproducerbarhetsexperimentet var RSD för akteosid och totala glykosider 0,10 procent respektive 1,44 procent. I 24 timmars stabilitetsexperimentet var RSD för akteosid och totala glykosider 0,14 procent respektive 0,90 procent. I återvinningsexperimentet var återvinningen av akteosid 100,50 procent med en RSD på 2,08 procent, medan återvinningen av totala glykosider var 99,12 procent med en RSD på 1,65 procent. Alla RSD-värden var mindre än 3 procent. Dessa resultat visade god precision och reproducerbarhet. Dessutom var provet stabilt i 24 timmar. Resultaten av återhämtningen ligger också inom det tillåtna intervallet (95−105 procent). Därför kan denna metod användas för bestämning av akteosid och totalt glykosiderutbyte efter rening.

Enfaktorsundersökning av TGCD

Reningen av TGCD med hjälp av makroporöst harts kan påverkas av många faktorer, såsom hartstyp, statiska adsorptionsfaktorer (adsorptionstid, läckagekoncentration och pH i provlösningen) och elueringsförhållanden (flödeshastighet, volym och koncentration). Med användning av adsorptionskapacitet och desorptionshastigheter och eluering av TGCD som index, bestämdes det experimentella tillståndet baserat på resultaten av enkelfaktorexperiment. Med användning av makroporöst adsorptionsharts av typen AB-8 bestämdes följande optimala förhållanden: 0,5 mg/ml provlösning, pH 10, statisk adsorptionstid på 8 timmar, 2 BV destillerat vatten för att tvätta föroreningar, 20 BV 80 procent etanol som elueringsmedel och en flödeshastighet på 0,5 BV/min. De specifika resultaten visas i figurerna 1−7.

CCD för optimering av TGCD-reningsteknik

Baserat på resultaten av enfaktorundersökningen valdes tre faktorer som signifikant påverkar reningsmetoden som index, nämligen pH i provlösningen (x1), eluentkoncentration (x2) och eluentvolym (x3). Enligt principen för CCD har varje faktor fem nivåer. Maximi- och miniminivåerna för dessa olika faktorer sattes i enlighet med resultaten av det preliminära experimentet. Faktornivåerna visas i tabell 1 och de experimentella resultaten visas i tabell 2.

De totala glykosiderna och akteosidutbytena bestämdes för att optimera reningsmetoden för TGCD. Först sattes de totala glykosider- och akteosidutbytena till de numeriska kriterierna för önskvärdhet (d) mellan {{0}}-1. Sedan beräknades den totala önskvärdheten (OD) [OD=(d1, d2, d3,....,dn)1/n, där n är indextalet]. SPSS21.{{10}} programvara och designexpert programvara användes för multipel linjär regression och binomial anpassning av oberoende variabler och OD, med p < 0.05="" övervägdes="" en="" statistiskt="" signifikant="" standard="" för="" ekvationen.="" ekvationen="" med="" ett="" större="" r-värde="" (multipelkorrelationskoefficient)="" valdes="" som="" den="" bästa="" modellen.="" den="" multivariata="" linjära="" ekvationen="" representeras="" som="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" plus="" 0.034x2="" plus="" 0,012x3="" (r="" {{="" 25}}.55,="" sid="0.004)." den="" binomiala="" ekvationen="" är="" y="–" 21,92173="" –="" 0,74079x1="" plus="" 0,62914x2="" plus="" 0,041161x3="" plus="" 0,014972x1x2="" plus="" 2,06050*10-4x1x52}x{9,52}x2}x1x52}x2,06050*10-4x1x52}x2}x1x52}x2}x1x52}x20x2}="" {56}}.78730="" ×="" 10-3x22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0.91," p="0}.012)." det="" kan="" ses="" från="" ovanstående="" ekvationer="" att="" korrelationskoefficienten="" för="" den="" multivariata="" linjära="" regressionsekvationen="" är="" lägre.="" korrelationen="" mellan="" de="" oberoende="" och="" beroende="" variablerna="" är="" mycket="" låg,="" och="" den="" ansågs="" ogynnsam="" att="" använda="" i="" den="" linjära="">

Men korrelationskoefficienten för binomialekvationen var hög och det resulterade i en bra passform. Därför valdes den binomiala modellen. Baserat på en omfattande analys av ytfiguren och konturkartan kombinerat med experimentdata (OD-värde nära {{0}}.6), erhölls det optimala området för reningsmetoden. Från figur 8 kan det ses att det maximala OD-värdet genererades när pH för provlösningen (A) var i intervallet 9−10, och eluentkoncentrationen (B) var i intervallet 79−85 procent . Figur 9 visar att det maximala OD-värdet erhölls när pH-värdet för provlösning (A) var i intervallet 9−10 och elueringsvolymen (C) var i intervallet 20−25 BV. Figur 10 visar att det maximala OD-värdet erhölls när eluentkoncentrationen (B) låg i intervallet 80–85 procent och elueringsvolymen (C) var i intervallet 20–25 BV. Från en omfattande analys av dessa data bestämdes provlösningens pH, eluentkoncentration och eluentvolym till intervallet 9-10, 80-85 procent respektive 20-25 BV. Baserat på den multivariata binomialekvationen för resultat av variabla derivat och optimalt schema, visade sig den bästa TGCD-reningsmetoden vara vid en eluentkoncentration (etanol) på 85 procent och volymen 25 BV vid ett pH på 11. Motsvarande OD-värde var 0,8332 , och det totala glykosiderutbytet var 73,0339 procent. Det visuella intrycket från figurerna 8-10 identifierar den bästa metoden för att vara den där interaktioner mellan de två faktorerna beaktades, även om den bästa metoden som härleds från formeln känner igen den där interaktioner mellan de tre faktorerna ingick. De två resultaten skilde sig åt och den optimala reningsmetoden ansågs vara med en eluentkoncentration (etanol) på 85 procent och volymen 25 BV vid ett pH på 11.

Mätning av livmodertillväxt

Livmoderkoefficienten för varje grupp visas i tabell 3. Jämfört med den negativa kontrollgruppen var resultaten för de andra grupperna signifikant olika. Det visade sig att TGCD erhållet från 20 olika reningsmetoder alla utövade östrogena effekter.

Bekräftande experiment

De omfattande resultaten av CCD- och livmodertillväxttestet visade att den optimala reningsmetoden ansågs vara med en eluentkoncentration (etanol) på 85 procent och en volym på 25 BV vid ett pH på 11. Under

valideringsprocessen var det genomsnittliga utbytet av totala glykosider 70,9150 procent. Den genomsnittliga avvikelsen mellan predikterade och faktiska värden var 2,1180 procent. Därför kan det antydas att denna modells förutsägbarhet och experimentella trovärdighet är god.

Identifiering av TGCD efter rening

Baserat på retentionstid och MS-data spekulerades 21 naturliga beståndsdelar, inklusive campneosid 1, 2′-acetylakteosid, cistanosid A, cistanosid B, syringalid A 3'- - L-rhamnopyranosid, tubulosid A, tubulosid B, salidrosid, cistanosid G, teniposidsyra, koffeoylakteosid, 8-epilogansyra, echinakosid, cistanosid F, cistantubulosid B1, isoakteosid, acteosid, cis-acteosid, kankanosid E, osmanthusid B och cistanosid C och MS/Cistanosidtiden. MS-information, formel och spekulerade föreningar visas i tabell 4.

Q-TOF-MS är särskilt lämplig för strukturell identifiering av komplexa molekylära komponenter i läkemedel och livsmedel eftersom det kan tillhandahålla möjliga elementära sammansättningar genom exakt molekylmassa och strukturella egenskaper hos fragmentjonerna. För att etablera en systematisk strukturell karakterisering användes även Q-TOF-MS, MS-data, databassökning och publicerad referenslitteratur för identifiering. Molekylformeln för varje målkomponent härleddes från moderjonen, och den matchades med de kända föreningarna. Denna formel skulle kunna bestämmas ytterligare från dess relaterade fragmentjoner. Till exempel visade topp 5 en övervägande deprotonerad jon vid m/z 654 (C30H38O16), som var identisk med den elementära sammansättningen av campneosid 1. Förlusten av caffeoyl bildades från en fragmentjon vid m/z 493, och förlusten av rha-delen bildades från en fragmentjon vid m/z 347.

Slutsats

Med hjälp av en LC-Q-TOF-MS-teknologi har en enkel och robust kvalitativ analysmetod för TGCD utvecklats och helt validerats. Valideringsdata för screening och identifiering av naturliga föreningar från TGCD var tillfredsställande. Tjugoen bioaktiva föreningar från TGCD spekulerades enligt följande: salidrosid, cistanosid G, geniposidinsyra, koffeoylakteosid, campneosid 1, 8-epilogansyra, 2'-acetylakteosid, cistanosid A, cistanosid B, syringalid{9' }}L-rhamnopyranosid, echinacosid, cistanosid F, cistantubulosid B1, isoacteosid, acteosid, tubulosid A, cis-acteosid, kankanosid E, osmanthusid B, cistanosid C och tubulosid B. De strukturella grundämnena kan ge en experimentell karaktärisering av dessa deras kvalitetskontroll och ytterligare klinisk tillämpning på grund av deras östrogena aktivitet. Detta kan erbjuda ett nytt och förbättrat terapeutiskt alternativ för behandling av postmenopausalt syndrom, och därigenom undvika biverkningar och biverkningar av östrogenbehandling.

Förkortningar

TGCDCistanche deserticolatotala glykosider LC/Q-TOF-MS vätskekromatografi/kvadrupol flygtid masspektrometri

RSM svarsytmetodik

CCD central kompositdesign

MS-masspektrometri HPLC/Q-TOF-MS Högpresterande vätskekromatografi/kvadrupol-time-of-flight-masspektrometri

ACN Acetonitril

BV sängvolym

OD övergripande önskvärdhet

LC-MS vätskekromatografi-masspektrometri

Q-TOF-MS kvadrupol masspektrometri för flygtid

TCM traditionella kinesiska mediciner

RSD relativ standardavvikelse

Erkännanden

Detta projekt stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81073015), Nature Scientific Foundation i Heilongjiang-provinsen (ZD2017014), utbildningsplan för unga innovativa talanger från College i Heilongjiang-provinsen (UNPYSCT- 2017209). Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.

Intressekonflikt

Författarna uppger ingen intressekonflikt.

Referenser

[1] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Fenyletanoidglykosider med antiinflammatoriska aktiviteter från stjälkar av Cistanche deserticola odlade i Tarimöknen, Fitoterapia, 2013, 89, {{4} }.

[2] Guo Y., Cao L., Zhao Q., Zhang L., Chen J., Liu B., Zhao B., Preliminära karakteriseringar, antioxidant- och leverskyddsaktiviteten hos polysackarider från Cistanche deserticola, International Journal of Biological Macromolecules , 2016, 293, 678-685.

[3] Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y., Tu PF, Antiinflammatoriska iridoider från stjälkar av Cistanche deserticola odlade i Tarimöknen, Chinese Journal of Natural Medicines, 2016, 14, 61-65.

[4] Peng F., Chen J., Wang X., Xu C., Liu T., Xu R., Changes in Levels of Phenylethanoid Glycosiders, Antioxidant Activity, and Other Quality Traits in Cistanche deserticola-skivor genom ångbearbetning, kemiska produkter och Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 2016, 64, 1024-1030.

[5] Wang T., Zhang X., Xie W., Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": en recension, The American Journal of Chinese Medicine, 2012, 40, 1123-1141.

[6] Song Y., Song Q., Li J., Zhang N., Zhao Y., Liu X., Jiang Y., Tu P., En integrerad strategi för att kvantitativt skilja kamomill mellanCistanche deserticolaoch C. tubulosa med hjälp av högpresterande vätskekromatografi-hybrid trippelkvadrupol linjär jonfälla masspektrometri, Journal of Chromatography A, 2016, 1429, 238-247.

[7] Li Y., Peng Y., Wang M., Zhou G., Zhang Y., Li X., Snabb screening och identifiering av skillnaderna mellan metaboliter avCistanche deserticolaoch C. tubulosa vattenextrakt hos råttor genom UPLC-Q-TOF-MS kombinerad mönsterigenkänningsanalys, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2016, 131, 364-372.

[8] Li WL, Sun XM, Song H., Ding JX, Bai J., Chen Q., HPLC/Q-TOF-MS-baserad identifiering av absorberade beståndsdelar och deras metaboliter i råttserum och urin efter oral administrering av Cistanche deserticola-extrakt, Journal of Food Science, 2015, 80, H2079-2087.

[9] Almasi A., Dargahi A., Mohamadi M., Biglari H., Amirian F., Raei M., Avlägsnande av penicillin G genom kombinationen av sonolys och fotokatalytisk (sono-fotokatalytisk) process från vattenlösning: processoptimering med hjälp av RSM (Response Surface Methodology), Electron Physician, 2016, 8,

[10] 2878-2887. Hou W., Zhang W., Chen G., Luo Y., Optimization of Extraction Conditions for Maximal Phenolic, Flavonoid and Antioxidant Activity from Melaleuca bract data Leaves Using the Response Surface Methodology, PloS One, 2016, 11,

[11] e0162139. Pooralhossini J., Ghaedi M., Zanjanchi MA, Asfaram A., Valet av ultraljudsassisterad extraktion i kombination med spektrofotometri för snabb bestämning av gallsyra i vattenprover: Central kompositdesign för optimering av processvariabler, Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 34 , 692- 699.

[12] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Strukturell karakterisering och identifiering av fenyletanoidglykosider frånCistanches deserticola YC Maav UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochemical Analysis, 2012, 23, 668-676.

[13] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Kvantitativ analys av Cistanches Herba med hjälp av högpresterande vätskekromatografi i kombination med dioduppsättningsdetektion och hög- upplösningsmasspektrometri kombinerat med kemometriska metoder. Journal of Separation Science, 2013, 36, 1945-1952.

[14] Li WL, Chen Q., Yang B., Gao S., Zhang JJ, Screening av fytoöstrogena effektiva extrakt och dos avCistanche deserticola, Kinesiska örtmediciner, 2013, 5, 292-296.

[15] Li YP, Huang FR, Dong J., Xiao C., Xian RY, Ma ZG, Zhao J., Rapid Identification of Cistanche via Fluorescence Spectrum Imaging Technology Combined with Principal Components Analysis and Fisher Distinction, Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi, 2015, 35, 689-694.