Del 1: Bioaktiva föreningar från Ephedra Fragilis: Extraktionsoptimering, kemisk karakterisering, antioxidant- och antiglykationsaktiviteter

För mer information. Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Responsytmetodik (RSM) med en Box-Behnken-design (BBD) användes för att optimera extraktionen av bioaktiva föreningar från Ephedra fragilis. Resultaten antydde att extraktion med 61,93 procent etanol vid 44,43 grader i 15,84 timmar var den bästa lösningen för denna kombination av variabler. Det råa etanolextraktet (CEE) erhållet under optimala extraktionsbetingelser fraktionerades sekventiellt med lösningsmedel med ökande polaritet. Innehållet av total fenol (TP) och total flavonoid (TF) samtantioxidantoch antiglykationsaktiviteter mättes. Den fytokemiska fingeravtrycksprofilen för fraktionen med högst aktivitet karakteriserades med användning av RP-HPLC. Etylacetatfraktionen (EAF) hade de högsta TP- och TF-halterna och uppvisade de mest potenta antioxidant- och antiglykeringsaktiviteterna. Pearsons korrelationsanalysresultat visade att TP- och TF-innehåll var mycket signifikant korrelerade med antioxidant- och antiglykeringsaktiviteterna. Totalt identifierades sex föreningar i EAF fragilis, inklusive fyra fenolsyror och två flavonoider. Dessutom visade molekylär dockningsanalys också det möjliga sambandet mellan identifierade bioaktiva föreningar och deras verkningsmekanismer. Våra resultat tyder på nya bevis på antioxidant- och antiglykeringsaktiviteterna hos E. fragilis bioaktiva föreningar som kan användas vid behandling och förebyggande av åldrande och glykerationsrelaterade komplikationer.

Nyckelord: Ephedra fragilis; svarsytmetodologi; Box-Behnken design; bioaktiva föreningar; RP-HPLC; antioxidant och antiglykerande aktiviteter

Klicka här för att lära dig fler produkter

1. Introduktion

Den kontinuerliga exponeringen för angripare från olika källor kan leda till en ökning avfria radikalerproduktionen i människokroppen, överskrider dess förmåga att reglera dem, och bidrar över tiden till utvecklingen av flera oxidativ stressrelaterade sjukdomar inklusive åldrande och diabetes[1]. Därmed,antioxidantertillskott kan hjälpa till att upprätthålla ett optimalt biologiskt system genom att ta bort alltför höga koncentrationer av fria radikaler [2]. Det har visats att fria radikaler deltar i glykeringsprocessen. Glykering, en spontan icke-enzymatisk reaktion mellan tillgängliga aminogrupper av aminosyrarester i proteiner och reducerande sockerarter, sker i högre utsträckning under åldrande och hyperglykemi, vilket resulterar i avancerad produktion och ackumulering av slutprodukter av glykation (AGE). Förutom att det stör proteiner och ändrar deras funktionalitet, kan AGEs också

engagera sig med receptorn för AGEs (RAGE), en 45 KDa multi-ligand-cellytereceptor som tillhör immunglobulinsuperfamiljen [4], och aktivera flera nedströms intracellulära signalvägar åtföljda av en ökning av produktionen av fria radikaler som bidrar till patologiska komplikationer relaterade till diabetes [5].

Det är väl etablerat att antioxidanter och radikalfångare molekyler är bra beskyddare mot dessa processer [6]. Användningen av medicinalväxter för att förebygga och motverka sjukdomar associerade med oxidativ stress är en gammal medicinsk tradition. Nyligen har många studier visat att sekundära metaboliter som tanniner, fenolsyror och flavonoider med dubbel antioxidant- och antiglykeringspotential är mer effektiva vid behandling av diabetes mellitus [7]. Därför är det av stort intresse att identifiera nya källor till fytokemikalier som effektivt avlägsnar fria radikaler och minskar icke-enzymatisk glykering.

Ephedra fragilis är en medlem av Ephedra-släktet (Ephedracea-familjen) som innehåller mer än 60 arter som växer i öken och halvtorra förhållanden på båda halvkloten över sex kontinenter [8]. I mer än 5000 år har många arter i släktet Ephedra använts i traditionell kinesisk medicin (TCM) för behandling av flera sjukdomar; det har gjorts flera studier som rapporterat deras flera hälsofördelar såsom antiinflammatoriska [9, antiinvasiva, anti-angiogena, [10], antimikrobiella, antiproliferativa, pro-apoptotiska[11], neuroprotektiva [12], leverskyddande och anti -oxidantegenskaper [13]. Flavonoider, alkaloider, fenolsyror och andra föreningar i Ephedra-växter har ansetts vara de viktigaste fytokemiska komponenterna för dessa farmakologiska egenskaper [14]. Inom läkemedelsindustrin används omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC) i stor utsträckning som en analysmetod för att detektera och identifiera kemiska föreningar baserat på deras olika hydrofoba egenskaper, även om få studier beskrivs i litteraturen för kemisk analys av Ephedra arter.

Extraktionsprocessen av dessa bioaktiva föreningar från olika växtkällor är det första viktiga steget i deras kvalitativa och kvantitativa analys [15]. Olika faktorer t.ex. extraktionsmetod, lösningsmedelstyp och koncentration, temperatur, tid och annat kan avsevärt påverka sammansättningen och extraktionshastigheten för dessa föreningar [16]. Därför krävs optimering av extraktionsprocesserna för att ge ett högt innehåll av växtaktiva föreningar. Ursprungligen utvecklad på 1950-talet av Box och Wilson, är responsytormetodik (RSM) numera det mest använda verktyget för att utföra, förbättra och optimera sådana processer där oberoende faktorer har en kombinerad effekt på den önskade responsen. En av de mest utvalda designerna i RSM av forskare är Box-Behnken-designen (BBD) eftersom den behöver en begränsad prövning och därför representerar ett alternativ som undviker långvariga experiment och minskar kostnaderna [17-19].

Upp till dags dato finns inga studier tillgängliga i litteraturen angående extraktionsoptimering av E. fragilis bioaktiva föreningar. Därför syftade denna studie till att optimera extraktionen av totalt fenolhalt (TP) och flavonoid (TF) innehåll från E.fragilis genom att applicera en BBD. Det råa etanolextraktet (CEE) som erhölls under optimala extraktionsförhållanden fraktionerades sekventiellt med lösningsmedel med ökande polaritet, och deras antioxidant- och antiglykeringsaktiviteter undersöktes med användning av olika in vitro-tester. Slutligen utförde vi i silicoanalys för att ytterligare förstå mekanismerna genom vilka bioaktiva föreningar i EAE, som identifierats av omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC), binder till BSA och RAGE som målproteiner.

2. Resultat och diskussion

2.1. Montering av modellerna

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{{0}}.05) för två svar indikerar lämpligheten hos modeller för korrekt förutsägelse av variationen i resultaten [20]. En god precision beskrivs som ett signal-brusförhållande större än 4, vilket anses vara önskvärt [21]. Värdena för adekvat precision är 29,4772 och 28,729 för TP- respektive TF-innehåll, vilket visar en adekvat signal. Samtidigt indikerar de mindre värdena för variationskoefficient (CV procent) (1,52 och 0,4246 procent för TP- respektive TF-innehåll) bättre precision och tillförlitlighet hos experimentella värden. För varje svarsfaktor undersöktes inverkan av extraktionsfaktorerna XI (etanolkoncentration), X2 (extraktionstemperatur) och X3 (extraktionstid) noggrant (tabell 2). Signifikansen av varje koefficient testades med F- och p-värden, med tanke på att ett större F-värde och ett mindre p-värde alltid ledde till mer signifikant överensstämmelse mellan olika oberoende variabler [22]. Sammantaget indikerade dessa resultat att modellerna var reproducerbara och lämpade sig för optimering.

2.2. Effekter av extraktionsvariabler på TP-innehåll

Som anges i tabell 2 visade ANOVA-resultaten signifikanta linjära (X och X2), kvadratiska (Xj, X5 och X) och interaktiva (X1X och X2X3) effekter på TP-innehåll. Bland dessa är TP-innehållet huvudsakligen beroende av X, X3 på sid<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

Värdet av bristande passform var icke-signifikant (F-värde =11.02, p-värde=0.0843), vilket indikerar att modellen är välutrustad med god förutsägelse (R{ {9}}.9935; Adj R2=0.9818)(Tabell 2).

Interaktionerna mellan etanolkoncentration och extraktionstemperatur (XjX2) ger en mycket signifikant (s<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Dessa effekter kan bero på att fenolföreningar är polära molekyler som naturligt förekommer med glukosider, vilket gör dem mer vattenlösliga [23]. Eftersom extraktion av fenolföreningar är starkt beroende av lösningsmedlets polaritet är en vatten-alkoholblandning mer effektiv i sin extraktion än enbart alkohol [20]. När det gäller principen "lika-löser-liknande" leder en minskning av etanolkoncentrationen till en ökning av lösningsmedlets polaritet, vilket hjälper till att lösa upp TP[15]. Ändå kan en hög etanolkoncentration påverka extraktionshastigheten genom att förhindra upplösning av fenoliska föreningar. På samma sätt förbättrade en ökning av extraktionstemperaturen återvinningen av målfenolföreningar genom mjukning av vävnader, försvagade cellväggens integritet, förbättrade massöverföring och penetration av lösningsmedel in i växtmatrisen och ökade både löslighet och diffusionshastighet; dock kan temperaturer för höga för en längre extraktionstid öka chanserna för deras nedbrytning [23]. Dessutom har en lång extraktionsperiod visat sig potentiellt förlänga syre- och ljusexponeringen, vilket i slutändan ökar risken för bildning av fria radikaler som kan avlägsnas av fenoliska föreningar [23]. Därför var en förlängd extraktionstid inte till hjälp för att maximera extraktionsutbytet [24].

2.3.Effekter av extraktionsvariabler på TF-innehåll

Som framgår av tabell 2, de linjära effekterna av X och X3; kvadratiska effekter av X och X; och interaktionseffekten av X1X2 och XjXg visade signifikanta effekter på TF-innehåll. Bland alla signifikanta faktorer är TF huvudsakligen beroende av X3,X,X,X och X1X2 vid p<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

Det icke-signifikanta värdet av bristande passform(F-värde=1.13; p-värde=0.5024) antydde att den föreslagna modellen passade till den rumsliga inverkan av variablerna på svaret med god förutsägelse (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (tabell 2).

Olika 3D-responsytgrafer genererades för TF-innehåll och visas i figur 1D-F. Interaktionseffekten av etanolkoncentration och extraktionstemperatur (X1X2) visade en signifikant (s<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

På liknande sätt visade interaktionen mellan etanolkoncentration och extraktionstid (XIX3) en liknande korrelation (Figur 1F). Extraktionsutbytet av TF ökade gradvis med ökande både etanolkoncentration (Xj) och extraktionstid (X3). Nära mittpunkten av svarsdiagrammet (61,89 procent och 15,81 timmar för X respektive X3) nådde TF-utbytet sitt högsta men minskade långsamt därefter. Detta fenomen beror troligen på att Ficks andra diffusionsprincip avslöjar att den slutliga jämvikten mellan lösningskoncentrationen i den fasta matrisen och lösningsmedlet kommer att uppnås efter en viss varaktighet, vilket leder till en retardation i extraktionsutbytet av målföreningar [26] .

2.4. Validering av optimerade villkor

Syftet med optimeringen var att bestämma de extraktionsförhållanden som samtidigt skulle ge det högsta TP- och TF-innehållet. Designexpertprogramvara användes för att utföra optimering. BBD föreslog att den optimala etanolkoncentrationen, extraktionstemperaturen och tiden skulle vara 61,93 procent, 44,43 grader respektive 15,84 timmar för extraktion av E. fragilis bioaktiva föreningar. Vid denna optimala punkt var de förutsagda TP- och TF-halterna 15,335 mg GAE/g dw respektive 2,972 mg OE/g dw (tabell 3). Validering av modellernas prediktiva kapacitet utfördes experimentellt under de optimala förhållanden som erhållits från RSM. Experiment utfördes i tre exemplar under de erhållna förhållandena, och medelhalten av TP och TF var 14,98±0.29GAE/g DW respektive 2.92±0.09 QE/g dw. De experimentella värdena för undersökta svar var jämförbara och i linje med de för förutspådda värden, vilket bekräftade att modellerna var tillräckliga för att återspegla den förväntade optimeringen.

2.5. Extraktionsutbyte och fytokemisk analys

Tabell 4 visade extraktionsutbytet av E. fragilis CEE och dess fraktioner. Våra resultat visade att extraktionsutbytet i olika fraktioner skiljer sig signifikant från 0.78 till 10,6 procent (vikt/vikt). Som visas i tabell 4, CEE(1{{14} },6 procent ) hade den högsta procentuella avkastningen, följt av WF (2,73 procent), WBF (2,04 procent), DMF(0,64 procent) och EAF(0,93 procent), medan HF (0,78 procent). ) hade den lägsta procentuella avkastningen.

TP-innehållet i E. fragilis CEE och dess fraktioner bestämdes genom en regressionsekvation av kalibreringskurvan (y {{0}}.009x-0.{{ 25}}154; R2=0.9973) och uttryckt i milligram gallussyraekvivalenter (GAE) per gram torkad vikt (tabell 4). I allmänhet hade EAF det högsta TP-innehållet (32,78±0,49 mg GAE/g DW) följt av successivt WBF, DMF och CEE (25,02±1,01,19,21±0,22 och 14,98±0,29 mg GAE/g DW), medan WF och HF uppvisade de lägsta halterna (10,47±0,71 respektive 8,14±0,17 mg GAE/g DW). TF-innehållet i E. fragilis CEE och dess fraktioner utvärderades med aluminiumklorid kolorimetrisk analys med användning avquercetinas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. Intressant nog var TP- och TF-halterna i EAF 2,18 och 3,59- gånger högre än i CEE, vilket tyder på att etylacetat kan vara det lämpliga lösningsmedlet för att koncentrera mer tillgängliga fenoler och flavonoidföreningar under CEE-fraktioneringen. Våra uppgifter om TP- och TF-innehåll överensstämmer med de från Yao et al. [27] som rapporterar att EAF erhållen från medicinalväxten Pyrola asarifolia hade de högsta nivåerna av fenoler och flavonoider jämfört med de andra fraktionerna (petroleumeter, n-butanol och vatten). I sin studie, Bhardwaj et al. [28] rapporterade också liknande resultat vid användning av flera lösningsmedel med ökande polaritet (n-hexan, kloroform, etylacetat och n-butanol) vid splittringen av en medicinalväxt Codonopsis clematidea. Enligt dessa författare har EAF det högsta TP- och TF-innehållet på avstånd följt av n-butanol, kloroform och hexan. Denna betydande variation i extraktionsutbyten, sammansättning och renhet av fenolföreningar mellan fraktionerna beror troligen på skillnaderna i polariteten hos beståndsdelar som finns i växtmaterial, deras kemiska struktur, deras polymerisationsgrad och deras interaktion med varandra [29 ].

2.6. In vitro antioxidantaktivitet

2.6.1.DPPH"Scavenging Activity

DPPH" är en av få stabila fria radikaler som används i stor utsträckning för att undersöka antioxidantpotentialen hos växtextrakt [30]. Ett extrakts renande potential är ofta förknippat med dess förmåga att avlägsna stabila fria radikaler, vilket beror på dess vätedonerande förmåga .

Rengöringsförmågan hos CEE/fraktioner såväl som VC vid olika doser på DPPH*fri radikal studerades. Figur 2A visar att alla fraktioner uppvisade uppenbar DPPH·fångande aktivitet på ett dosberoende sätt i intervallet 0,1 till 1 mg/ml. Vid en dos av 1 mg/ml, 64,32, 44,1{{22} },67.24,86.63,80.95,51.37 och 99.62 procent av DPPH"-radikalerna släcktes av CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF respektive VC. Den lägsta IC50 för rensning av DPPH"bland alla fraktioner visades av EAF(0.116±{{30}}.015 mg/mL )följd av WBF (0.175 ± 0.03 mg/mL),CEE (0.23 ± 0.065 mg/mL) och DMF (0.297 ±0,044 mg/ml). WF och HF visade jämförelsevis högre IC50-värden (0,964±0,178 respektive 1,245±0,105 mg/ml).

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

IC50-värdet för DPPH-radikalrening var signifikant positivt korrelerat med både TP-innehållet (r=0.963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· plus rensningsaktivitet

ABTS-avskiljningsanalysen används i stor utsträckning som ett index för att informera och undersöka antioxidantkapaciteten hos rena föreningar såväl som naturliga extrakt [32,33]. Att den blå/gröna färgen av ABTS*-kromoforen bleknar vid 734 i närvaro av växtextrakt kan indikera en antioxidantaktivitet.

Såsom visas i figur 2B uppvisade rensningskurvan för CEE/fraktioner på ABTS* plus en uppåtgående trend när koncentrationen ökade. Vid 1 mg/ml var renshastigheten för CEE, HF, DMF, WBF, EAF, WF och VC 80.31,40.54,88.76, 9{{2{ {22}}}}.11,82.97, 67.36 respektive 94.90 procent. Bland alla fraktioner visades det lägsta ICs0-värdet av EAF(0.11{{30}}±0.014 mg/ mL) fortlöpande av DMF(0.196±0.023 mg/mL),WBF (0.277±0.031 mg/ml), CEE(0.429 ± 0,039 mg/ml) och WF(0,654±0,043 mg/ml), medan HF visade det högsta ICs0-värdet (1,314±0,104 mg/ml). Sammantaget överensstämde detta fynd med det av Kaewseejan och Siriamornpun [29]. Jämförelse med den inhiberande kapaciteten hos VC (0,025±0,005 mg/ml) visade att rensande aktiviteten hos CEE och dess fraktioner var något svag.

Som presenteras i tabell 5, en mycket signifikant korrelation mellan ABTS radikal rensning med TP-innehåll (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. H2O2-rensande aktivitet

Eftersom H2O2 är en främsta bidragsgivare till oxidativ stress, diffunderar H2O2 lätt genom celler över membranet som en budbärarmolekyl [34]. Sammantaget är H2O2 i sig inte farligt [35], men det kan reagera med Fe2 genom Fenton-reaktion och ger upphov till den mycket reaktiva hydroxylradikalen (OH*)[36]. Således är det den mest skadliga av ROS för biomolekyler. Det är därför nödvändigt att utvärdera förmågan hos CCE och dess olika fraktioner att ta bort H2O2.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF och motsvarande rensningsförmåga vid 1,0 mg/ml var 84,56,75,24, 67,17,56,18, 50,19 respektive 34,95 procent, vilket var mycket lägre än VC (98,03 procent).

Bland alla fraktioner visade EAF det lägsta IC50-värdet (ICs0= 0.098±0.013 mg/mL), och det var signifikant högre än det för VC (0,024±0,006 mg/ml). Detta kan bero på närvaron av höga fenol- och flavonoidföreningar i EAF, som är allmänt kända för att spela en avgörande roll som antioxidanter i biologiska system. I vår senaste studie visade vi kapaciteten hos EAF från E.fragilis att skydda Tetrahymena pyriformis mot H2O2-inducerad oxidativ skada [37].

Vår dataanalys visade att, när det gäller DPPH"- och ABTS* plus-resultaten, en stark positiv korrelation mellan ICs0-värdet för H2O2-rening noterades med både TP-innehåll (r=0.926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Minska kraft

Den reducerande kraften hos ett extrakt fungerar som en indikator på dess potentiella antioxidantaktivitet [39, A40]. Antioxidantpotentialen uppskattas av antioxidanternas förmåga att reducera järn(Fe3) i järn(III)klorid till järn(Fe2 plus). Generellt hänförs de reducerande egenskaperna till närvaron i växtextrakt av reduktoner, som anses utöva sin verkan genom att bryta den fria radikalkedjan genom att donera en väteatom [41].

Figur 2D visar dos-responskurvan för den reducerande kraften hos E. fragilis-extrakt. Det är känt att ju högre absorbans vid 700 nm, desto större reduktionsförmåga. I den aktuella studien uppvisade CEE och dess fem fraktioner avsevärd reducerande kraft på ett koncentrationsberoende sätt.

EAF visade maximal antioxidantaktivitet (EC{{0}}.136± 0.{{10}}13 mg/mL) i jämförelse med VC(EC{{4) }}.083± 0.005 mg/mL). Detta följdes tätt av WBF (EC50=0.180 ± 0,028 mg/mL), DMF (EC50=0.319 ± 0.031 mg/mL), CEE (EC50=0.334±0.029mg/mL) och WF(EC50=0.398±0.064 mg/ml) .HF släpade efter och visade minimal reducerande effektaktivitet (EC5s0 =0.626±0,068 mg/ml) jämfört med andra fraktioner. Dessa fynd tyder på att EAF kan innehålla olika individuella föreningar som har en effektiv och kraftfull reducerande kraftaktivitet. Forskare har funnit att etylacetatextrakt kan fungera som starka antioxidanter [42].

Positiv korrelation observerades mellan reducerande effekt och både TP- och TF-innehåll (r=0.975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Fosfomolybdenanalys

TAC för CEE och dess fraktioner samt VC utvärderades med hjälp av fosfo-molybdenanalysen och uttrycktes som ECs0, vilket är koncentrationen som ger 0.5 av absorbans. Metoden baserades på reduktion av Mo(VI) till Mo(V) genom extrakt för att bilda ett grönt fosfat/Mo(V)-komplex vid surt pH med maximal absorption vid 695 nm [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(sid<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

En mycket signifikant korrelation observerades mellan total antioxidantaktivitet och både TP-innehåll och TF-innehåll (r=0.978 för båda;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. -Karoten-linoleat modellsystem

I -karoten-linolsyramodellen genomgår de mycket omättade -karotenmolekylerna snabb missfärgning på grund av linoleatfria radikaler som genereras av oxidation av linolsyra [44]. Tillskott med antioxidanter skulle kunna minimera -karotenoxidation genom att neutralisera linoleatfria radikaler och därmed hämma -karotenblekning [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF visade det lägsta IC50-värdet(IC50=0.127 ± 0.{{10}}42 mg/mL) i jämförelse med BHT (ICs { {5}}.049 ± 0.001 mg/ml). WBF. CCE. DME. VI. och HF visade jämförelsevis högre ICs0-värden på 0,5±0,111 mg/mL, 0,998 ± 0,101 mg/mL, 1,073± 0,084 mg/ml, 1,402±0,058 mg/mL, och 2,209±0,081 mg/ml, respektive.

En signifikant korrelation på ett positivt sätt observerades mellan -karotenoxidationsfångning och både TP-innehåll (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC och -karoten. Därför visade vi att de potenta antioxidantaktiviteterna hos CEE och dess fraktioner uppvisade högre rensningsaktiviteter, och detta kan starkt bero på deras sammansättning från fenolsyra och flavonoider som gallussyra, rutin och quercetin.