Karakterisering av naturliga och alkaliska oxiderade proantocyanidiner i växtextrakt med UHPLC-MS/MS med ultrahög upplösning

För mer information. Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: I denna studie analyserade vi proantocyanidin (PA) sammansättningen av 55 växtextrakt före och efter alkaliskaoxidationav ultrahögupplöst UHPLC-MS/MS. Vi karakteriserade de naturliga PA-strukturerna i detalj och studerade de sofistikerade förändringarna i de modifierade PA-strukturerna och de typiska mönstren och modellerna för reaktioner inom olika PA-klasser på grund av oxidation. De naturliga PA:erna var PC:er av A- och B-typ, PD:er och PC/PD-blandningar. Dessutom upptäckte vi galloylerade PA. PC-datorer av B-typ i olika växtextrakt var ganska stabila och visade ingen eller mindre modifiering på grund avalkalisk oxidation. För vissa prover upptäckte vi de intramolekylära reaktionerna hos PC:er som producerar A-typ eterbindningar. PC-datorer av A-typ var också ganska stabila med ingen eller mindre modifiering, men i vissa anläggningar bildades ytterligare eterkopplingarupptäcktes. PA som innehöll PD-enheter var mer reaktiva. Efter alkalisk oxidation detekterades dessa PA eller deras oxidationsprodukter inte längre av MS även om en annan typ och/eller fördröjd PA-puckel fortfarande detekterades av UV vid 280 nm. Galloylerade PA var ganska stabila under alkalisk oxidation om de var PC-baserade, men vi upptäckte den intramolekylära omvandlingen från B-typ till A-typ. Galloylerade PD:er var mer reaktiva och reagerade på liknande sätt som icke-galloylerade PD:er.

Nyckelord: högupplöst masspektrometri; orbitrap;oxidation; tanniner; UHPLC-DAD-MS/MS

Klicka här för att lära dig fler produkter

1. Introduktion

Proantocyanidiner(PAs, syn. kondenserade tanniner) är oligomerer och polymerer som består av flavan-3-olmonomerenheter (Figur 1). Mångfalden av PA-strukturer härrör huvudsakligen från deras hydroxyleringsmönster, den sekventiella ordningen av flavan-3-olenheterna och graden av polymerisation (DP), förutom skillnader i stereokemi vid C2 och C3 och variation i platsen och stereokemi av interflavanoidobligationer [1]. De vanligaste PA är procyanidiner (PC) som består av (epi)katekinenheter och prodelfinidiner (PDs) som består av (epi)gallokatekinenheter (Figur 1). PA-strukturerna som presenteras i figuren har C4→C8-länkarna. Emellertid kan PA också länkas med C4→C6-bindningar, och vi kan inte separera dessa två länkar från varandra genom masspektrometri.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>flera 100-kiloton per år) och är kemiskt och ekonomiskt mer tilltalande som biopolymer [2-5]. För närvarande används endast ett fåtal resurser, såsom bark eller skog av wattle, mimosa, quebracho, ek, kastanj, mangrove, sumach, myrobalans och tara, för deras produktion och främst för kraven på lädergarvning, vin, mineral flotations- och oljeborrningsindustrier, för framställning av lim, förutom djurfoder [4,6,7]. Men även avfall eller biprodukter från hantering och bearbetning av frukt, grönsaker och skogsresurser från de ovan listade industriella applikationerna kan vara en potentiell källa för naturliga PAs [8-11]. PA:erna kan också modifieras ytterligare för att förbättra deras användbarhet och bioaktiviteter [12,13].

De kemiska egenskaperna hos PA kan modifieras genom derivatiseringsreaktioner [12]. Dessa reaktioner inkluderar till exempel O-acylering genom en reaktion med syraklorider eller anhydrider eller alkylering med alkylhalogenider. Derivatisering modifierar de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos PA för deras kommersiella tillämpningar och reningsteknologier. Men för att verkligen förstå de faktiska reaktionerna som sker måste flera parametrar, såsom reagens och lösningsmedel som används, temperatur, pH och reaktionstid regleras [12]. Ett enkelt och snabbt sätt att förbättra användbarheten av växt-PA är att oxidera dem för att skapa nya PA med förändrade molekylära strukturer. Även om reaktionsbetingelserna för oxidation är välkända och olika reaktionsmekanismer har föreslagits, är motsvarande strukturella förändringar huvudsakligen kända för enskilda små PA [14-18]. Till exempel har oxidations- och omlagringsreaktionerna av olika monomera och dimera flavan-3-oler diskuterats elegant redan för 30 år sedan, vilket visar att kemin hos dessa PA:er vid alkaliskt pH regleras av bildningen av A- och/eller B-ring kinon-metider som mycket reaktiva mellanprodukter som orsakar omlagringsreaktioner och den oxidativa omvandlingen av B-typ till A-typ PAs [15]. Istället är PA-blandningarnas beteende inte känt i växtextrakten, och detta beror med största sannolikhet på svårigheter att analysera strukturellt olika initiala PA, som utmanas ytterligare efter oxidation. I vår tidigare studie testade vi om olika typer av naturliga PA:er kunde modifieras kemiskt för att producera nya typer av PA och studerade effekterna av ospecifik alkalisk oxidation som efterliknar den ofta använda alkaliska extraktionsprocessen för barkavfall [19-23] på 102 PA-innehållande växtextrakt [13]. Resultaten indikerade olika reaktivitet för PC:er och PD:er. Resultatet antydde att växt PAs kunde modifieras vid högt pH, och närvaron av PD-grupper ökade signifikant sannolikheten för modifieringsreaktioner. Den huvudsakliga reaktionsvägen ansågs vara intramolekylär, men för PD-rika och gallovlerade PA, indikerades både intra- och intermolekylära reaktioner [13]. Dessutom har andra studier visat att oxidation av PA inkluderar både intramolekylära och intermolekylära reaktioner [14,15,24,25].

Den detaljerade karaktäriseringen och förståelsen av naturliga och oxiderade PA:er är utmanande, men de senaste framstegen inom ultrahögpresterande vätskekromatografiska tandemmasspektrometriska (UHPLC-MS/MS) instrumentering med högupplösta massanalysatorer har möjliggjort karaktäriseringen av många olika växt-PA:er [18,26-28]. De populära massanalysatorerna för karakterisering av PA har varit orbitrap [27,28] och quadrupole

time-of-flight(OTOF)[29,30] på grund av deras högupplösta egenskaper, som tillåter bestämning av de exakta massorna och motsvarande molekylära formler för studerade PA i växtextrakt. PA:er som finns i naturen innehåller vanligtvis en blandning av olika oligo- och polymerstrukturer, vilket ger mångfaldigt laddade joner vid elektrosprayjonisering, vilket utökar det använda massområdet [30-32]. Dessutom har PA välkända karakteristiska fragmenteringsmönster, som kan användas för identifiering: dessa inkluderar kinon-metid (QM) klyvning, heterocyklisk ring fission (HRF) och retro-Diels-Alder (RDA) fragmentering [27, 31-33]. Samma fragmenteringsmönster finns vanligtvis för PA-typer av både A- och B-typ, och m/z-värdena som observerats för PA-typer av A-typ med en eterkoppling skiljer sig med 2 Da från motsvarande PA-typer av B-typ [26,{{ 19}}].

I denna studie använde vi UHPLC kombinerat med ultrahögupplöst tandemmasspektrometri för att (a) studera de naturliga PA-strukturerna i 55 PA-rika växtprover i detalj, (b) för att se de sofistikerade förändringarna i de modifierade PA-strukturerna efter luftoxidation under alkaliska förhållanden och (c) att känna igen de typiska mönstren och modellerna av reaktioner inom olika PA-klasser på grund av oxidationen.

2. Resultat och diskussion

Vi valde ut 55 PA-rika växtprover innehållande intressanta men komplexa blandningar av naturliga PA baserat på vår tidigare studie [13]. Dessa växtprover oxiderades på liknande sätt genom luftoxidation under alkaliska förhållanden som i [13] och efter oxidationen var PA ännu mer komplexa. Dessa naturliga och modifierade PA studerades här av UHPLC-DAD kopplad till ultrahögupplöst Q-orbitrap MS/MS för att upptäcka de sofistikerade förändringarna i PA-strukturer. PA identifierades baserat på deras enkel- och/eller multipelladdade joner med motsvarande exakta massor och molekylformel. Analyserna utfördes med omvänd fas LC, och därför var oligomera och polymera PA huvudsakligen närvarande som oupplösta puckelr i UV-kromatogrammen vid 280 nm, se bladextraktet av Ruprechtia salicifolia i figur 2A för ett exempel. I det totala jonkromatogrammet var joniseringen av andra fenoliska föreningar mer intensiv än den för PA, och därför var PA-puckeln inte så uppenbar (Figur 2B). Noggrannheten hos orbitrap gör emellertid tolkningen av MS-resultat lättare eftersom de isotopiska mönstren för flerladdade joner är tydligt definierade, och eventuell överlappning av toppar kan detekteras, vilket möjliggör bestämning av de exakta massorna och molekylformlerna för olika oligo- och polymera PA. Till exempel uppvisar galoylerad(epi)katekin vid m/z 441, galloylerad dimer PCat m/z729 och gallovlerad trimer PC vid m/z 1017 väl separerade toppar i extraherade jonkromatogram (EIC) i figur 2C-E, och de kan lätt detekteras baserat på deras UV- och masspektra, inklusive exakta massor och motsvarande molekylformel. Resultaten som erhölls här överensstämde med tidigare resultat som erhållits av MS/MS, som visade att Ruprechtia salicifolia-bladen innehöll 24 mg/g PA, varav endast 3 procent var PD-innehållande PA, några av dem var galloylerade och mDP hittades att vara 7 [13].

2.1.B-typ PC-datorer i de initiala icke-oxiderade växtextrakten

B-typ PCs i växtextrakten detekterades baserat på deras enkel- och multipelladdade molekylära joner utöver de karakteristiska fragmenteringsmönstren. Till exempel är PC i Begonia bower "Nigra"-extrakt uppvisade en distinkt serie av [MH]-joner separerade av 288 Da från m/z289 till m/z 1729 motsvarande B-typ PC från monomer till hexamer och av [M{{ 6}}H]' joner separerade med 144 Da från m/z 1008 till m/z 1296 motsvarande för B-typ PC:er från heptamerer till nonamers (tabell S1). Masspektra för monomera PC, dvs. flavan-3-oler katekin och epikatekin, uppvisade en karakteristisk fragmentjon vid m/z 245 som tidigare rapporterats [3132,36].

I allmänhet visade MS/MS för PC-dimerer av B-typ de karakteristiska fragmenteringsmönstren som gav joner vid m/z 287 och 289 (QM-klyvning), m/z 425 och 407 (RDA-fragmentering och sekventiell vatteneliminering) och m /z 451(HRF; figur 3). RDA-fragmenteringen anses vara det viktigaste fragmenteringsmönstret för karakterisering av PC-dimerer av B-typ och fragmenteringen på förlängningsenheten har ansetts vara energetiskt gynnsammare eftersom den producerar fragmentjoner med ett större π-πhyperkonjugerat system än RDA-fragmentering på terminalenheten [31-33].

2.2. PC-datorer av A-typ i de initiala icke-oxiderade växtextrakten

Närvaron av PA-typ av A i de initiala växtextrakten bekräftades av deras karakteristiska fragmenteringsmönster som liknar PA-typ av B. Som exempel visas och diskuteras de karakteristiska fragmenteringsvägarna och MS/MS-data för A-typ PC-dimer och trimer med en länk av A-typ (figur 4 och 5). Fragmenteringen av PC-dimeren av A-typ producerade fyra fragmentjoner (Figur 4). RDA-fragmenteringen av den terminala enheten producerade en jon vid m/z 423, vilket bekräftar närvaron av en länk av A-typ [26,34,35]. Dessutom föreslår vi att RDA-fragmenteringen av förlängningsenheten och den sekventiella förlusten av vatten skulle kunna producera jonen vid m/z 407. Jonen vid m/z 449 är HRF-produktionen, dvs. resultatet av förlusten av floroglucinolenheten [26]. Jonerna vid m/z 285 och 289 motsvarade QM-klyvning. På liknande sätt uppvisade PC-trimeren av A-typ en molekyljon vid m/z 863 och karakteristiska fragmentjoner i MS/MS vid m/z 711.693.573.559, 451,411 och 289 som tidigare rapporterats av Sui et al. (2016) )[26]. RDA-fragmenteringen av A-typ PC-trimer producerade en jon vid m/z 711, vilket återigen bekräftar närvaron av A-typ koppling enligt den tidigare studien [26] och antyder att A-typ koppling kan vara mellan två förlängningar enheter. Vi föreslår att jonen vid m/z 693 motsvarar den sekventiella förlusten av vatten och stödjer positionen för länkning av A-typ, som visas i figur 5. Dessutom föreslår vi att den ytterligare RDA för den heterocykliska C-ringen i terminal flavan-3-olenhet uppvisar jonen vid m/z559. Denna jon var liten i våra studier. Jonerna vid m/z573 och 289 motsvarade QM-klyvningen av den nedre interflavanoidbindningen [26]. Vi upptäckte även joner vid m/z 575 och 287. Vi föreslår att jonerna vid m/z 451 och 411 skulle kunna motsvara HRF för den heterocykliska C-ringen i den mellersta flavan-3-olenheten som stöder platsen för Länkning av A-typ mellan förlängningsenheterna enligt figur 5.

2.3 Modifieringar av PC-datorer av B-typ i växtextrakt på grund av den alkaliska oxidationen

Efter oxidationen modifierades PC-skivor av B-typ i olika växtextrakt olika. Några av proverna visade inga eller mindre modifieringar; se figur 6A, B, till exempel, för kortare PC-oligomerer av B-typ i bladextraktet av Begonia-bower är "Nigra" före och efter oxidation. När dessa typer av växtextrakt oxiderades var de totala masspektra för de initiala och oxiderade växtextrakten liknande. Emellertid upptäcktes små skillnader i de detaljerade masspektrometriska data. Till exempel kom PC-dimeren vid m/z 577 tillsammans med m/z575, respektive PC-trimern vid m/z865 med m/z 863. När mängden PC var låg före oxidationen, efter oxidationen försvann deras signaler nästan från masspektrat, vilket antydde att de hade omvandlats till oidentifierbara eller försämrades på grund av oxidationen. Detta fenomen observerades till exempel för bladextrakten av Combretum Indicum och Euphorbia characias innehållande låga mängder av få korta PC-oligomerer och stöddes av tidigare MS/MS-data som visade att PA-innehållet minskade från 4 mg/ml till 1 mg /ml respektive 7 mg/ml till 1 mg/ml på grund av oxidationen [13]. Detta fenomen kan vara relaterat till de experimentella förhållandena som användes, vilket innebär att de var allvarligare när det initiala PA-innehållet var lågt. I vissa prover modifierades en del av B-typ PCs mer, se figur 6C, D, till exempel, för kortare B-typ PColigomerer i broschyrextraktet av Cyperus owoaii före och efter oxidation. När dessa typer av växtextrakt oxiderades upptäcktes synliga skillnader i de totala masspektra som visar massskillnaden på 2 Da i jämförelse med initiala PC:er (Figur 6C, D, Tabell S2).

Det är välkänt att oxidationen av o-dihydroxipolyfenoler, dvs katekol-B-ringen av PC, typiskt ger o-kinoner med en massaskillnad på 2 Da. Faktum är att vi har märkt att denna typ av oxidation också kan ske i masspektrometriska analyser. Det kan finnas mindre signaler i masspektrat som har m/z-värdena 2 Da mindre än m/z-värdena för PC:er som motsvarar den möjliga oxidation eller bildning av kinonformer av PC:er under joniseringen (data ej publicerade). Det är möjligt att här i den alkaliska oxidationen bildar o-dihydroxipolyfenoler de första o-kinonerna. Men de bildade 0-kinonformerna är instabila och reagerar troligen snabbt vidare. Ett möjligt resultat kan vara den oxidativa omvandlingen av PC-datorer av B-typ till PC-datorer av A-typ, som tidigare rapporterats i litteraturen [15]. Omvandlingen av B-typ PC till A-typ PC involverar oxidativt avlägsnande av hydridjonen vid C2 i C-ringen som ett första steg: de rådande grundförhållandena inducerar oxidationen av o-dihydroxifunktionaliteten hos B-ringen till en o-kinon, som därefter fungerar som enoxidationsmedelför omvandling av procyanidindimer av B-typ till A-typ ett [15] (Figur 7). Denna kinonmetidmekanism har också påvisats i olika temperaturer, pH och katalytiska förhållanden [37], genom radikaloxidation med användning av 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylradikaler under neutrala förhållanden [38] och genom laccas ( EC1.10.3.2) [39].

När vi studerade de modifierade PC:erna med massskillnaden på 2 Da i de oxiderade extrakten och deras produktioner erhållna av MS/MS, kom de slutsatsen att de liknade A-typ PC:er och deras fragmentjoner (som diskuterats ovan i avsnitt 2.2), visar de karakteristiska fragmenteringsmönstren som ger joner vid m/z 285 och 289 (QM-klyvning), m/z 423 (RDA-fragmentering) och m/z449 (HRF). Som ett exempel visar vi omvandlingen av B-typ PC-dimerer av broschyrextrakt från Microgramma Mauritania till A-typ PC-dimerer i figur 8. Iicke-oxideradextrakt upptäckte vi fyra PC-dimerer av B-typ med m/z-värden 577 (Figur 8A) men inga PC-dimerer av A-typ med m/z-värden 575 (Figur 8B). De små topparna i EIC vid m/z575 motsvarade förmodligen oxidationen av B-typ PCs i jonkällan eftersom retentionstiderna är exakt desamma som för B-typ PCs. I det oxiderade extraktet upptäckte vi endast spår av de initiala PC-datorerna av B-typ vid m/z 577 (Figur 8C), men istället upptäckte vi intensiva toppar vid senare retentionstider motsvarande PC-datorer av A-typ vid m/z 575 (Figur 8C). 8D). De små topparna i EIC vid m/z577 med exakt samma retentionstider motsvarade de isotopiska signalerna för m/z 575. Det måste noteras att denna studie var kvalitativ, vilket innebär att mängden joner inte kan vara jämfört som sådan. Dessutom måste det noteras att konverteringen av B-typ PC till A-typ PC inte alltid var så komplett som i detta exempel och att alla B-typ PC inte konverterades till A-typ PC. grovt uppskattade mängderna av joner av PC-oligomerer av A-typ och B-typ var lika. Å andra sidan, i vissa prover upptäckte vi fler skillnader på 2 Da; till exempel skulle PC-heptameren vid m/z 2017 kunna kompletteras med joner vid m/z2015 och 2013, vilket tyder på bildandet av en respektive två länkar av A-typ.

Även om omvandlingen av PC-datorer av B-typ till A-typ verkade vara huvudreaktionsmekanismen, kan vi inte helt utesluta andra modifieringsreaktioner. PA var närvarande som komplexa blandningar i de initiala icke-oxiderade extrakten, och dessa blandningar var ännu mer komplexa efter den alkaliska oxidationen och producerade en enorm mängd MS-data. Till exempel har tidigare studier på baskatalyserad oxidation och omlagringsreaktioner av PA:er visat att PC-dimerer kan omvandlas till olika produkter av C-ringisomerisering, inklusive tetrahydroxipyranokromener, även kända som florotanniner [15]. Dessa produkter skulle uppvisa mycket liknande m/z-värden vid 577 men olika retentionstider i LC och olika fragmenteringsmönster i MS. Baserat på EIC vid m/z 577 upptäckte vi inte omarrangemang av detta slag i de använda reaktionsförhållandena. Omarrangemang och öppning av den heterocykliska C-ringen kan också producera andra produkter via regioisomerisering, epimerisering eller 13-arylmigrering [15]. Epimeriseringen har främst varit relaterad till tillverkningsprocesser och till exempel leder de höga temperaturerna i samband med rostning av kakao till flavan-3-olförluster, men också till epimeriseringen av flavan-3-olmonomerer, dimerer och trimerer [40]. Dessutom har det rapporterats att polyfenoloxidas i bananfruktkött orsakade epimeriseringen av (-)-epigallokatekin till (-)-gallokatekin[41]. Vi tittade på möjlig epimerisering av flavan-3-oler med hjälp av EIC vid m/z289, och i allmänhet upptäckte vi ingen signifikant epimerisering orsakad av den använda alkaliska oxidationen. Vi kan dock inte helt utesluta epimeriseringen eftersom vi upptäckte högre mängder (plus)-katekin i förhållande till (-)-epicatekin i det oxiderade extraktet av Pavonia blomkålsblommor än i det initiala icke-oxiderade extraktet (Figur S1). Det måste också noteras att de oxiderade extrakten neutraliserades före UHPLC-MS/MS, vilket kan ha orsakat redoxreaktioner. I de oxiderade formerna är kinoner elektrofiler som kan reagera med det nukleofila vattnet som finns, och detta kan helt enkelt resultera i att reduktionsreaktionen ger PC-datorer av B-typ, vilket också kan förklara varför vissa av B-typ-PC:erna verkade vara opåverkade.

2.4. Modifieringar av PC-datorer av A-typ i växtextrakt på grund av den alkaliska oxidationen

A-typ PC i olika växtextrakt reagerade olika på grund av den alkaliska oxidationen. Några av proverna visade inga eller mindre modifieringar. När dessa typer av växtextrakt utsattes för alkalisk oxidation upptäcktes inga signifikanta skillnader i de totala masspektra (se till exempel tabell S3 för de viktigaste jonerna som observerats i bladextraktet av Aglaonema commutatum var. maculatum före och efter oxidation). Emellertid kunde små skillnader detekteras i de detaljerade masspektrometriska data med massskillnaden på 2 Da och antyder att ytterligare eterbindningar av A-typ skulle kunna bildas. Detta fenomen var mer uppenbart för några av proverna med datorer av A-typ; Dessa PC-enheter av A-typ märktes bilda ytterligare eterbindningar av A-typ på grund av den alkaliska oxidationen (Figur 9). När dessa typer av växtextrakt oxiderades detekterades distinkta skillnader i de totala masspektra som visade massskillnaden på 2 Da i jämförelse med initiala PC-datorer av A-typ. [MH]-jonen vid m/z 863 motsvarade en PC-trimer med en eterbindning av A-typ och jonen vid m/z 861 för en PC-trimer med två eterkopplingar (Figur 9A ). På liknande sätt detekterades tetramera PC med en, två och tre eterbindningar av [M-H]-jonerna vid m/z 1151, 1149 respektive 1147 (Figur 9B). I proportion, pentamera och hexamera PC:er med en , två och tre eterbindningar detekterades av [M-H]-jonerna vid m/z 1439, 1437 och 1435 och vid m/z 1727, 1725 respektive 1723 (Figur 9C, D; [M -2H]2-jonen vid m/z 861 av en PC-hexamer var uttryckligen rikligare än [MH]-jonen vid m/z 1723 och visas därför i figur).

Bildandet av ytterligare bindningar av A-typ påverkade också retentionstiderna för dessa oligomerer. Antalet ytterligare eterbindningar verkade i viss utsträckning öka när polymerisationsgraden för PC ökade, vilket förväntas eftersom det finns fler positioner för de ytterligare bindningarna. Det måste dock också noteras att det kan förekomma mindre signaler med en massaskillnad på 2 Da som motsvarar eventuell oxidation eller bildning av kinonformer av PC:er under joniseringen, som diskuterats ovan. Dessa toppar är också synliga i masspektra i figur 9 före huvudtopparna som motsvarar A-typ PC. Jonernas överflöd, formerna på de isotopiska mönstren och de karakteristiska fragmentjonerna erhållna av MS/MS bekräftade observationen av ytterligare eterbindningar av A-typ. Det är också viktigt att notera att dessa observerade intramolekylära reaktioner inte verkade påverka medelgraden av polymerisation eftersom oligomererna eller polymererna med högre PA inte detekterades i de oxiderade extrakten i jämförelse med icke-oxiderade extrakt. Observationen stöds av Mouls och Fulcrand (2012) [14].

2.5. Växtextrakt med PA som har både PC- och PD-subenheter och deras modifieringar på grund av den akaline oxidationen

Många av proverna innehöll PA med både (epi)katekin- och (epi)gallokatekinenheter, dvs. PA var PC/PD-blandningar. Ödet för dessa PC/PD-blandningar på grund av modifieringen via alkalisk oxidation var annorlunda jämfört med PC. PC/PD-blandningar detekterades tydligt i växtextrakten före oxidationen både av UV och MS; se till exempel de små PA-oligomererna i det initiala bladextraktet av Podocarpus macrophyllus (Figur 10A och Tabell S4). Efter oxidationen detekterades de modifierade PA fortfarande av UVat 280 nm som en annan typ och/eller fördröjd puckel (Figur S2), men de upptäcktes inte längre av MS, se till exempel de saknade PA-oligomererna i det oxiderade bladet extrakt av Podocarpus microphallus (Figur 10B och Tabell S4). Vi upptäckte varken några andra signaler som kunde motsvara de modifierade PC/PD-blandningarna eller deras eventuella nedbrytningsprodukter. Till exempel, för PC-dimeren vid m/z 577, kunde vi detektera motsvarande A-typ PC-dimer vid m/z 575 i det oxiderade extraktet, men liknande distinkta observationer kunde inte göras för PC/PD-dimerer eller trimerer (Figur 10B). Orsaken till förlusten av detekterbara PC/PD-oligomerer i ESI-MS kan till exempel vara intermolekylära reaktioner mellan PAs [13-15,24,25]. De intermolekylära reaktionerna är kända för att resultera i bildandet av modifierade PA genom anslutning av två distinkta oligomera kedjor, och typiskt leder de till en ökning av medelgraden av polymerisation [14]. Till exempel, Vernhet et al. (2014) har märkt av småvinklar röntgenspridningsexperiment att om PA:er oxideras i koncentrerade lösningar, är de modifierade PA:erna högpolymerer med långa linjära eller grenade kedjor [25]. Ytterligare oxidation kan också leda till cyklisering mellan A- och B-ringar av olika PA [24]. Dessutom har det noterats att dessa nya bindningar och strukturer är resistenta mot syrakatalyserad klyvning, och därför kan ökningen av medelgraden av polymerisation endast uppskattas genom icke-depolymeriserande metoder [14,24. Våra resultat visade dock att dessa modifierade PA:er inte heller detekteras under standard ESI-MS-villkoren som används för PA:er (Figur 10). I vår tidigare studie använde vi en metod baserad på utvald reaktionsövervakning med trippelkvadrupol för att detektera PA i icke-oxiderade och oxiderade prover och märkte att subenhetssammansättningen förändrades på grund av den alkaliska oxidationen så att metoden inte längre kunde detektera de modifierade PAs [13]. De nuvarande högupplösta MS-resultaten stöder våra tidigare observationer med trippelkvadrupol att de modifierade PA i de oxiderade extrakten är mycket mer komplexa än de initiala PA i de icke-oxiderade extrakten och att de inte detekteras under liknande UPLC-MS/MS-förhållanden [13].

De metoder som används för oxidation av PA i litteraturen skiljer sig ganska mycket från vår metod, och därför är resultaten kanske inte direkt jämförbara [14,24,25]. I tidigare studier har oxidationen utförts i vatten surgjort med trifluorättiksyra vid pH 3,5 för att efterlikna vinets pH, och själva oxidationen har erhållits genom att provet rörs om i närvaro av luft i flera dagar [14,24, 25]. Vi använde alkalisk oxidation med karbonatbuffert vid pH 10 endast under en timme.

De flesta av växtextrakten involverade PA med både PC- och PD-subenheter, och endast i två prover kunde PA:erna anses vara nästan PD-rena. Dessa två prover var extrakten av Callisia gentlei varelegans och Pellaea oata. PD av B-typ detekterades i Callisia gentle var. Elegans extrakt före oxidationen; se till exempel de små PD-oligomererna i tabell S5, men efter oxidationen upptäcktes dessa PD inte längre av MS. Vi upptäckte varken några andra signaler som kunde motsvara de modifierade PD:erna eller deras eventuella nedbrytningsprodukter. Men några av de modifierade PA:erna detekterades fortfarande av UV vid 280 nm som en lägre och fördröjd puckel (Figur S3). Intressant nog, före oxidationen upptäcktes trimera PD:er av A-typ i Pellaea-dataextraktet, och efter oxidationen var dessa signaler fortfarande närvarande, men deras intensitet var betydligt lägre

av MS och dessutom detekterades m/z-värden som motsvarar bildandet av ytterligare länkar av A-typ i PD-trimerer på samma sätt som PC-datorer av A-typ (tabell S6). Detta kan indikera att förutom intermolekylära reaktioner som observerats för B-typ homo- och heterogena PD, kan A-typ PD också ha liknande intramolekylära reaktioner som detekterades för A-typ PC.

2.6. Gallulerade PA i växtextrakt och deras modifieringar på grund av den alkaliska oxidationen

Några av växterna innehöll galloylerade PA. Närvaron av allokerade PC:er, PD:er och PC/PD:er i växtextrakt bekräftades av deras karakteristiska fragmenteringsmönster. I allmänhet inträffade fragmenteringen av gallovlerade PA i MS-analys på liknande sätt via RDA., HRF och QM-mekanismer som diskuterats ovan [31-33]. Som ett exempel visas och diskuteras den karakteristiska fragmenteringsvägen och MS/MS-data för en galloylerad PC-dimer i bladextraktet av Ruprechtia salicifolia (Figur 11). Galloylgruppens position är endast indikativ, och den kan vara fäst vid vilken annan fri hydroxylgrupp som helst i den terminala enheten. Jonen vid m/z603 är HRF-produktionen. Jonerna vid m/z 287 och 441 motsvarade QM-klyvning. Dessutom upptäckte vi klyvningen av galloylgruppen vilket resulterade i jonen som motsvarar PC-dimer vid m/z577 och den efterföljande RDA-fragmenteringen med en jon vid m/z425 och den ytterligare klyvningen av vatten med en jon vid m/z 407. HRF av m/z 577 producerade fragmentjonen vid m/z 451. Dessutom upptäckte vi små fragmentjoner vid m/z 109,123 och 125, motsvarande de aromatiska ringarna. De galloylerade PA kan innehålla flera galloylgrupper i sina strukturer (tabell S7).

De olika galloylerade PA:erna uppförde sig olika under luftoxidationen under alkaliska förhållanden. Galloylerade PC:er var ganska stabila och reagerade på liknande sätt som icke-galloylerade PC:er. Till exempel upptäcktes inga anmärkningsvärda förändringar för de galloylerade PC:erna med en galloylgrupp i sina strukturer i det oxiderade bladextraktet av Nepenthes maxima (tabell S7). Det måste dock noteras att intensiteten av jonerna för de galloylerade PC med två eller flera galloylgrupper var lägre i det oxiderade extraktet av Nepenthes maxima och till exempel var de galoylerade PC-pentamererna med flera köksgrupper inte längre detekterbara (tabell S7). Heltalsm/z-värdena för vissa galloylerade datorer liknar m/z-värdena för PC/PD:er och därför krävs en ultrahögupplöst MS. Till exempel motsvarar m/z 881 en trimer PA som består av två PC och en PD-enhet (C4sH3; O19, mberäknad 882.20074) och en galoylerad PC-dimer med två galloylgrupper (C44H34O20, mberäknad, 882.16435). I vissa prover. såsom i det oxiderade bladextraktet av Coccoloba uvifera, omvandlades galloylerade PC:er till A-typ galloylerade PC:er på grund av oxidation, även om de galoylerade PA:erna i det initiala extraktet verkade likna dem i Nepenthes maxima. Till exempel var den tilldelade PC-dimeren med en galloylgrupp och uppvisande en jon m/z 729 (tabell S7) stabil under den alkaliska oxidationen i bladextraktet av Nepenthes maxima men delvis modifierad i bladextraktet av Coccoloba ugifera som uppvisade joner både vid m /z 727 och 729. Den förstnämnda jonen motsvarade en galloylerad PCdimer av A-typ (m/z727.13148, C37H2O16) och uppvisade karakteristiska MS/MS-fragment som stödde länkningen av A-typ:m/z601 (HRF-produkt av m/z 727). (QM av m/z575, se figur 4), 169 (gallsyra), 125 (se figur 11) och 109 (se figur 11). En anledning till dessa skillnader i liknande PA mellan växtextrakt kan vara de andra föreningarna som finns i extrakten och som påverkar reaktionerna hos PA:er.

Galloylerade PC/PD-blandningar och PD:er var reaktiva och modifierades på liknande sätt som de icke-galloylerade PC/PD-blandningarna och PD:er. Efter oxidation upptäcktes inte dessa PA av MS även om de fortfarande var synliga vid UV vid 280 nm. Vi upptäckte varken några andra signaler som kunde motsvara dessa modifierade PA eller deras eventuella nedbrytningsprodukter. I ett prov, nämligen i Acacia karroo-blad, detekterades inte heller de modifierade galloylerade och icke-galloylerade PD:erna med UV vid 280 nm.

I vår tidigare studie [13], där PA i icke-oxiderade och oxiderade extrakt analyserades med utvalda reaktionsövervakningsmetoder, märkte vi att en tydlig galloylpuckel detekterades med den galloylspecifika MS/MS-metoden i de oxiderade proverna, men formen av puckeln hade förändrats och skiftat i enlighet med den observerade puckeln i UV-kromatogrammet. De ursprungliga gallovlerade PA:erna hade modifierats på ett sätt att galloylgruppen fortfarande kunde detekteras med den valda reaktionsövervakningsmetoden [13]. Tidigare studier på (-)-epigallocatechin gallat och (-)-epigallocatechin har visat att trihydroxifenyl B-ringen är det huvudsakliga verkningsstället för oxidation och att det inte finns några detekterbara produkter från oxidationen av galloyldelen [42]. De använda reaktionsbetingelserna och de erhållna oxidationsprodukterna var dock ganska olika i jämförelse med vår studie eftersom oxidationen utfördes med peroxylradikaler som genererades genom termolys av azoinitiatorn 2,2'-azobis(2,4-dimetylvaleronitril) [42].

Förutom galloylerade PA, två prover, nämligen Cephalotaxus harringtomia subsp. drupaceous broschyrer och Laurus nobilis-blad verkade innehålla glykosylerade PC med en sockerenhet ansluten till en PC-struktur. Vissa av dessa glykosylerade B-typ PCs omvandlades till glykosylerade A-typ PCs under den alkaliska oxidationen utan klyvning av sockerenheten. Dessutom detekterades bildandet av ytterligare eterbindningar till PC-datorer av A-typ.

3. Material och metoder

Insamlingen av växtmaterial, deras bearbetning och extraktion, förutom oxidation vid pH 1{{10}}, utfördes som tidigare rapporterats [13]. Den första studien innehöll 102 prover, av vilka vi analyserade ytterligare totalt 55 prover (tabell S8). För luftoxidationen oxiderades 20μL av varje extrakt med 18{{40}}uL pH 1{{60}}buffert under 1 timme vid rumstemperatur. Oxidationen stoppades genom tillsats av 100 ul 0,6% vattenhaltig HCOOH. Dessutom tillsattes 280 μL vatten till 20 μL av det initiala ooxiderade innan analysen för att få slutvolymen på 300 ul för både icke-oxiderade och oxiderade prover. Den ultrahögupplösta masspektrometriska analysen utfördes av en UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS. Instrumentet bestod av ett Acquity UPLC-system (Waters Corp., Milford, MA, USA) kopplat med en quadrupole-Orbitrap masspektrometer (QExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen, Tyskland). Kolonnen som användes var en Acquity UPLC BEH Phenyl-kolonn (2,1 x 100 mm, 1,7 um, Waters Corp., Wexford, Irland). Eluenterna var A= acetonitril och B=0,1 procent HCOOH. En flödeshastighet på 0,5 mLmin-1 användes och elueringsprofilen var följande:0-0. 5 min,0,1 procent A i B(isokratisk);0.5-5 min,0.1-30 procent A i B(linjär gradient);5-6min,30 procent {{44} } procent A i B(linjär gradient);6-6.1 min, 35-90 procent A i B(linjär gradient); 6.1-9.5 min, kolonntvätt och återutjämning. Injektionsvolymen var 5μL. UV (λ=190-500nm) och MS-data registrerades under hela analysen. Negativ jonisering användes i en uppvärmd ESI-källa med en sprayspänning på -3,0 kV, flödeshastighet för mantelgas (N2) på 60, ​​hjälpgas (N2)flöde på 20, svepgasflöde på 0, kapillärtemperaturen på plus 380 grader och in-source collision-induced dissociation (CID) på 30 eV. För full scan MS var massområdet för orbitrap m/z150-2250, upplösningen 35,000 och den automatiska förstärkningskontrollen 3×10*. För MS/MS-analyser, nämligen dd-MS2(TopN), var parametrarna följande: TopN 3; de stegvis normaliserade kollisionsenergierna 20, 50 och 80 eV, upplösningen 17 500 och den automatiska förstärkningskontrollen 1×105. Kalibreringen utfördes av Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc., Waltham, MA, USA). Uppgifterna bearbetades med Thermo Xcalibur Oral Browser-programvara (Version 3.0.63, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Eftersom de oxiderade proverna erhölls med användning av natriumkarbonatbuffert (pH 10), bildade natrium klusterjoner med myrsyra under UHPLC-MS/MS-analysen. Därför upptäcktes i början av varje totalt jonkromatogram av oxiderade prover en stark topp av natriumformiatkluster (tabell S9). Mönstret var lätt att upptäcka och påverkade inte analysen av PA. MS/MS-fragmentjoner av små PA-oligomerer presenteras i Tabell S10.

4. Sammanfattningar

I denna studie analyserade vi PA-sammansättningen av 55 växtextrakt före och efter alkalisk oxidation med ultrahögupplöst UHPLC-MS/MS (tabell S8). De naturliga PA-strukturerna innehöll A- och B-typ PC:er, PD:er och PC/PD-blandningar förutom tilldelade sådana. PA-kompositionerna var komplexa och den ultrahögupplösta MS behövdes för att mäta de exakta massorna och motsvarande molekylformler för olika PA. B-typ PC i olika växtextrakt var ganska stabila och visade ingen eller mindre modifiering på grund av den alkaliska oxidationen. För vissa prover upptäckte vi de intramolekylära reaktionerna hos PC:er som producerar A-typ eterbindningar. PC:er av A-typ var också ganska stabila med ingen eller mindre modifiering, men i vissa anläggningar upptäcktes bildandet av ytterligare eterbindningar. Växtextrakt som innehöll PD-enheter i PA (antingen rena PD eller PC/PD-blandningar) var mer reaktiva. Efter alkalisk oxidation detekterades inte längre dessa PA eller deras oxidationsprodukter av MS även om en annan typ och/eller fördröjd PA-puckel fortfarande detekterades av UV vid 280 nm. De intermolekylära reaktionerna mellan PA modifierade förmodligen dessa PA så att de inte detekterades under standard ESI-MS-förhållanden. Tidigare studier har visat att dessa modifierade PA inte heller kan studeras med nedbrytningsmetoder. Därför skulle en ny analysmetod behövas för att identifiera och karakterisera dem. Galloylerade PA:er var relativt stabila under alkalisk oxidation om de var PC-baserade, men ytterligare eterbindningar bildades som stödde omvandlingen av galloylerade B-typ PA till galloylerade A-typ PA. PA innehållande två eller flera galloylgrupper var mer reaktiva än de som endast innehöll en grupp. Gallovlerade PC/PD-blandningar och PD var mer reaktiva och reagerade på liknande sätt som icke-galloylerade. Det måste dock noteras att de intra- och intermolekylära reaktionerna inte var uteslutande, och dessa reaktioner kunde inträffa samtidigt. Dessutom påverkade växtmatrisen och andra närvarande föreningar dessa interaktioner.