DEL 1 Cistanche Deserticola-polysackarid hämmar OVX-inducerad benförlust hos möss och RANKL-inducerad osteoklastogenes

1. Introduktion

Osteoporos – en sjukdom som kännetecknas av minskad benmassa, onormal benvävnadsmikrostruktur, ökad benskörhet och fraktur (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli och Ginaldi, 2006) – drabbar för närvarande mer än 200 miljoner människor världen över och utgör en betydande medicinsk och socioekonomisk belastning på det moderna samhället (Strom et al., 2011). Den kliniska behandlingen av osteoporos fokuserar huvudsakligen på hormonersättning, bisfosfonat- eller denosumabbehandling. Dessa metoder är effektiva men ger långvariga biverkningar såsom potentiell risk för bröstcancer och atypiska lårbensfrakturer (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). Därför finns det ett akut behov av att utforska läkemedel som inte bara kan hämmaosteoporosmen har också färre oönskade biverkningar.

Cistanche deserticola(CD), ett stärkande och medicinskt livsmedel som ofta används i Kina, känd som "ökenginseng", är den torkade saftiga stjälken med fjällblad avC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) och har olika och effektivafarmakologiskaktivitetersåsom immunreglering, antioxidation och anti-osteoporosegenskaper (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Tidigare studier om de aktiva substanserna i CD på osteoporosbehandling fokuserade främst påfenyletanoidglykosider(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). CD-skivan innehåller dock även andra effektiva komponenter som iridoider, lignaner,polysackarider(Wang, Zhang, & Xie, 2012). Den kliniska tillämpningen av traditionell kinesisk medicin (TCM) är huvudsakligen vattenavkok.Polysackariderär vattenlösliga komponenter och är mest sannolikt de viktigaste farmakodynamiska komponenterna i TCM. Polysackarider extraherade från TCM rapporterades vilt ha en anti-osteoporoseffekt och ett fåtal oönskade biverkningar, som allmänt har använts på kliniker (t.ex. polysackarider utvunna från Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) och Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Därför antog vi detCistanche deserticolapolysackarid(CDP) extraherad från CD kan vara ett potentiellt säkert läkemedel för behandling av osteoporos.

Vanligtvis upprätthåller benresorption och benbildning en dynamisk balans under benremodellering i samordning med flera typer av celler, inklusive osteoklaster, osteoblaster, benbeklädnadsceller och osteocyter (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Ett brott i denna balans kan resultera i en mängd olika benmetaboliska sjukdomar, som t.exosteoporos(Zhu et al., 2018) och osteoskleros (Ihde et al., 2011). Osteoklaster, som änddifferentierade celler härledda från den mononukleära/makrofaglinjen, är de enda cellerna med benresorptionsfunktion (Teitelbaum, 2000). Det finns två nyckelcytokiner som deltar i osteoklastdifferentiering och mognad (Koga et al., 2004): makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptoraktivator av nukleär faktor κB (NF-κB) ligand (RANKL). M-CSF förmedlar differentieringen av hematopoetiska stamceller till osteoklastprogenitorer och främjar differentieringen av osteoklaster genom att uppreglera uttrycket av RANK-receptorn (Takayanagi, 2007). Bindningen av RANKL och RANK på osteoklastcellytan resulterar i följande: (1) rekrytering av signaladaptermolekyler såsom TNF-receptorassocierad faktor 6 (TRAF6); (2) aktivering av flera nedströmsmål, inklusive NF-KB och mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPKs); och (3) uppreglering av expressionsnivåerna av nukleär faktor hos aktiverade T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktiveringen av dessa signalvägar reglerar direkt uttrycket av osteoklastgener, inklusive surt fosfatas 5 (Acp5) [kodar tartratresistent surt fosfatas (TRAcP)], matrismetalloproteinas 9 (MMP9) och katepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet , & Lacey, 2003). Därför är hämningen av RANKL-inducerade osteoklastdifferentieringsrelaterade signalvägar en potentiell terapeutisk metod för osteoporos.

I den här studien syftade vi till att bestämma effekterna av CDP-behandling på ovarieektomiserade (OVX)-induceradeosteoporosmusmodell in vivo och på RANKL-inducerad osteoklastaktivitet in vitro, med fokus på uttrycket av osteoklastspecifika gener och aktiveringen av NFATc1 och NF-KB och MAPKs signalvägar. Våra resultat kan ge nya insikter om potentialen för CDP som ett säkert och effektivt läkemedel för behandling av osteoporos.

För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Polysackarid Cistanche deserticola har många effekter vid osteoporos, klicka här för att veta mer

2. Material och metoder

2.1. Kemikalier och provtagning

CD (nr 180801) köptes från Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Kina) och identifierades av professor Haibo Huang från School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Kina. Estradiolvalerattabletter köptes från Bayer (Leverkusen, Nordrhein-Westfalen, Tyskland). Alfa-modifierat minimalt väsentligt medium

(-MEM) och fetalt bovint serum (FBS) erhölls från Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penicillin/streptomycin och TRAcP-färgningssatsen förvärvades från Solarbio (Peking, Kina). Rekombinant mus M-CSF och rekombinant mus RANKL anskaffades av R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hydroxiapatitbelagda plattor köptes från Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). De primära antikropparna för NFATc1 och CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IKB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK och P-JNK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); och -aktin (CWBIO, Peking, Kina) erhölls också. De andra reagensen som användes i denna studie var av analytisk kvalitet och vattnet renades med Milli-Q vattenreningssystem (Millipore, Bedford, MA, USA).

2.2. CDP-extraktion

CD-skivan maldes till ett fint pulver och blandades med petroleumeter tre gånger för att besegra den. Den fasta återstoden uppsamlades genom filtrering och torkades sedan vid rumstemperatur. Depolysackariderextraherades från de förbehandlade proverna tre gånger med vatten i 2 timmar, koncentrerades, fälldes ut genom tillsats av vattenfri etanol till en slutlig koncentration av 80 % (v/v) och lagrades vid 4 ◦C i 24 timmar. Fällningarna samlades upp genom centrifugering vid 3000 rpm i 20 minuter, löstes i destillerat vatten och renades (borttagning av fria proteiner) med Sevag-metoden (Zhao et al., 2019). Den återvunnapolysackariderdialyserades, torkades och lagrades tills vidare användning. Dessutom visade de kemiska sammansättningsresultaten att det totala innehållet av socker, uronsyra, sulfat och protein i CDP var 67.63 0.98 procent , 21.05 0.49 procent , 1.{{7 }}.24 procent och 8.81 0.36 procent .

Monosackaridsammansättningen och Fourier-transformationsinfrarödanalys av CDP visades i tilläggsfigurerna 1 och 2.

2.3. OVX-inducerad osteoporosmusmodell

Alla djurförsök godkändes av Animal Ethics Committee vid Guangzhou University of Chinese Medicine (godkänd SYXK 2019-0202). Trettio 6-veckor gamla C57BL/6-möss av honkön levererades av Experiment Animal Center vid Guangzhou University of Chinese Medicine. Efter acklimatisering i 1 vecka fick en grupp möss en skenoperation (Sham-gruppen), medan de återstående mössen utsattes för en ovariektomioperation (OVX-gruppen). Efter operationen fick mössen återhämta sig i 1-vecka. Sedan, framgångsrikt modellerade möss delades slumpmässigt in i 5 grupper, med 6 möss per grupp:

(1) Skumgrupp: behandlad med destillerat vatten, (2) OVX-grupp: behandlad med destillerat vatten, (3) OVX E2-grupp (E2): behandlad med 0.13 mg/kg östradiolvalerattabletter, (4) ) OVX CDP lågdosgrupp (CDP-L): behandlad med 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP högdosgrupp (CDP-H): behandlad med 600 mg/kg CDP. Destillerat vatten, E2 eller CDP administrerades genom sondmatning en gång dagligen. Alla möss avlivades efter 12- veckors behandlingsperiod (Fig. 1A). Livmodern uppsamlades och vägdes och det vänstra skenbenet samlades in för efterföljande undersökningar. Helblodsprover samlades in och centrifugerades vid 5000 rpm för

15 min vid 4 ◦C. Serumsupernatanterna aspirerades och lagrades vid

—80 ◦C tills vidare analys.

2.4. Mikrodatortomografi (micro-CT) analys och benhistomorfometri

Det vänstra skenbenet fixerades med 4 procent paraformaldehyd i 48 timmar och placerades därefter i centrifugrör innehållande normal koksaltlösning. De fasta proverna skannades med Skyscan 1172 mikro-CT-instrument (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgien) med följande inställningar: spänning, 80 kV; källström, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; pixel

storlek, 9,76 μm; och rotationssteg, 0.6◦. Flera parametrar av

trabekulärt ben, inklusive benmineraldensitet (BMD), benvolymsfraktion (BV/TV), benyta per total volym (BS/TV), trabekulärt antal (Tb. N) och trabekulärt avstånd (Tb. Sp) mättes med användning av CT- Analyser® programvara (Bruker micro-CT, Skyscan). Tredimensionella bilder genererades med användning av programvaran CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).

Efter mikro-CT-analys avkalkades det vänstra skenbenet i 14 procent EDTA-lösning och bäddades in i paraffin för sektionering. Proverna skars i 5 µm sektioner med användning av en mikrotom före hematoxylin- och eosin- (H&E) och TRAcP-färgningsexperimenten. De färgade sektionerna undersöktes och dokumenterades med Olympus CX 31-mikroskop (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan).

Cistanchekan förbättra bentätheten och lindra osteoporos

2.5. Serumanalys

Koncentrationerna av kalcium (Ca) och fosfor (P) bestämdes enligt kitinstruktionerna utformade av Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). TRAcP-5b- och RANKL-nivåer i serumet analyserades med användning av TRAcP-5b ELISA-kit (CUSABIO, Wuhan, Kina) respektive RANKL ELISA-kit (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Kina).

2.6. In vitro osteoklastogenesanalys

BMM isolerades från skenbenet och lårbenet på 6-veckogamla C57BL/6 honmöss. De isolerade cellerna odlades i -MEM-medium innehållande 25 ng/ml M-CSF, 10 procent FBS och 1 procent penicillin/streptomycin. När de nådde sammanflödet såddes BMM (1 104 celler/brunn) i 96-brunnsplattor och behandlades med CDP i närvaro av 50 ng/ml RANKL. Mediet och CDP ersattes varannan dag. Efter 7 dagar fixerades cellerna med 4 procent paraformaldehyd och färgades med avseende på närvaro av TRAcP. Antalet osteoklaster, definierade som TRAcP-positiva celler med tre eller fler kärnor, räknades och dokumenterades med hjälp av ett ljusmikroskop.

2.7. Cellproliferationsanalys

BMM:erna (1 × 104 celler/brunn) såddes i en 96-brunnsplatta och inkuberades över natten. Efter detta behandlades cellerna med olika koncentrationer av CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 och 40 µg/ml) i 48 timmar. Cellsammanflödet detekterades och analyserades med hjälp av IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), ett långsiktigt, dynamiskt realtidscellsavbildningssystem.

2.8. Hydroxiapatitresorptionsanalys

BMM ({{0}} celler/brunn) såddes i en hydroxyapatitbelagd platta, behandlades med CDP vid de angivna koncentrationerna (0, 5 och 10 µg/mL) och odlades i komplett -MEM innehållande 25 ng/ml M-CSF och 50 ng/ml RANKL. Efter 7 dagar tvättades cellerna med en 10-procentig bleklösning för att avlägsna cellkomponenterna. Bilderna av hydroxyapatitresorptionsområden togs med hjälp av IncuCyte ZOOM® och analyserades med hjälp av ImageJ-programvara (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).

2.9. RNA-isolering och omvänd transkription-kvantitativ PCR-analys (RT-qPCR) i realtid

BMM ({{0}} celler/brunn) såddes i en 6-brunnsplatta och stimulerades med RANKL och M-CSF i närvaro av CDP i olika koncentrationer (0, 5 och 10) µg/ml) i 5 dagar. Totalt RNA isolerades från cellerna eller benvävnaden hos möss med användning av TRIzol-reagens (Sigma-Aldrich). Komplementärt DNA syntetiserades från 2 µg totalt RNA med användning av ett kit för omvänt transkriptas (TransGen Biotech, Peking, Kina). RT-qPCR-reaktionerna framställdes med hjälp av PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) och detekterades av ABI 7500-systemet (Applied

Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Cykelparametrarna för PCR ställdes in enligt följande: 95 ◦C i 5 minuter, följt av 40 cykler på 95 ◦C i 15 s och 60 ◦C i 30 s. De specifika primrarna som används visas i tabell 1, och kvantiteten av varje målgen normaliserades till GAPDH (intern kontroll).

2.10. Western blot-analys

BMM ({{0}} celler/brunn) såddes i en 6-brunnsplatta. För korta tidsförloppsexperiment förinkuberades cellerna med de olika koncentrationerna av CDP (0, 5 och 10 µg/mL) i 1 timme och behandlades sedan med 50 ng/ml RANKL i 30 min. . Under en lång tidsperiod stimulerades cellerna med 50 ng/ml RANKL på dagarna 3, 5 och 7 i närvaro av CDP (0, 5 och 10 µg/ml). Totala proteiner extraherades med användning av RIPA-lysbufferten (CWBIO). Proteiner separerades med 10 procent SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran. Membranen blockerades med 5 procent skummjölk vid rumstemperatur under 2 timmar, inkuberades med primär

antikroppar över natten vid 4 ◦C och sedan med motsvarande sekundära

antikroppar i 1,5 timme. Membranen utvecklades med användning av ECL-reagens (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), och bilder togs med Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, Kina).

Cistanchekan öka bentätheten

2.11. Detektion av NFATc1-translokation med hjälp av immunfluorescenstest

BMM:erna såddes på {{0}}brunns täckglas, stimulerades med RANKL och M-CSF och behandlades med 10 µg/ml CDP under 5 dagar. Cellerna fixerades med 4 procent paraformaldehyd under 15 minuter, tvättades tre gånger med PBS och permeabiliserades med 0,1 procent Triton X-100 under 10 minuter. Cellerna blandades med 10 procent getserum (CWBIO) och inkuberades i 2 timmar. Därefter inkuberades cellerna med den primära antikroppen över natten vid 4 ◦C och sedan med Alexa Fluor 488 get-anti-mus sekundär antikropp (Abcam, Cambridge, MA, USA) i mörker under 1 timme. Täckglasen tvättades med PBS, monterade i Prolong Gold Antifade Reagent med 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar) och

inspekterade med Zeiss LSM 800 med Airyscan konfokalmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

2.12. Statistisk analys

Alla experimentella data analyserades med SPSS 25.0 statistisk programvara (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Data för djur- och cellstudier uttrycks som medelvärden ± SEM respektive medelvärden ± SD. Resultaten använder envägsanalys av varians eller Students t-test. Värden på p < 0.05="" ansågs="" vara="" statistiskt="">

Cistanchekan minskaapoptosoch förbättra bendensitet