Del 2: Effekten av Acteosid som ett cellskydd för att producera en klonad hund

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1 , Eun Young Kim1 , Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1 , Kil Woo Han1 , Kang-Sun Park1 , Kyung-Bon Lee2 , Min Kyu Kim1*

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Snälla klicka här till del 1

Snälla klicka här till del 3

Akteosidicistanchehar mångahälsaförmåner

Statistisk analys

Data analyserades med hjälp av IBM SPSS-statistik (SPSS Inc., Chicago, IL USA) med envägs ANOVA och Tukeys ärligt signifikanta skillnadstest. Skillnader ansågs vara statistiskt signifikanta när P-värdet var mindre än 0.05.

Resultat

Effekt av akteosid på cellcykelsynkroniseringen

Effekten avakteosidpå cellcykelsynkronisering undersöktes med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) (tabell 1). Fetala fibroblaster från hund behandlades med olika koncentrationer avakteosid(10, 30, 50 μM) under olika varaktigheter (24, 48, 72 timmar), och cellerna separerades i G0/G1-stadiet, S-stadiet och G2/M-stadiet av FACS. Resultaten av FACS jämfördes med de för cellerna synkroniserade genom serumsvält och kontakthämning. Serumsvält resulterade i den högsta frekvensen av cellcykelsynkronisering (88,2 procent) vid G0/G1-stadiet jämfört med kontaktinhiberingen (84,6 procent) ochakteosidbehandling (80,8–84,5 procent ).Akteosidbehandling under 24 timmar inducerad G0/G1-cellcykelsynkronisering vid lägsta effektivitet (80,8, 81,1 och 82,0 procent).Akteosidvar mest effektiv för att inducera G0/G1-cellcykelsynkronisering vid 30 μM koncentration och behandlingslängd på 48 timmar (84,5 procent). Det fanns dock ingen signifikant skillnad mellan koncentrationer och varaktigheter avakteosidbehandling i induktion av G1/G0 cellcykelsynkronisering. Övergripande,akteosidbehandling visade ingen signifikant skillnad jämfört med serumsvält och kontakthämning när det gäller G{{0}}/G1-cellcykelsynkronisering. Det fanns inte heller någon skillnad i cellcykelsynkronisering på S-stadiet bland de tre grupperna. Dessutom var andelen celler arresterade i G2/M-stadiet liknande den för celler som arresterades vid G0/G1-stadiet.

Tabell 1. Effekt av kontakthämning, serumsvält ochakteosidbehandling av cellcykelsynkronisering i hundfetala fibroblaster.

Fig 1. ROS-nivåer i hundfosterfibroblaster. Cellcykelsynkronisering genom (A) kontakthämning, (B) serumsvält och (C) 30 μM akteosidbehandling i 48 timmar. Histogram visar nivåer av ROS som detekterats i hundfetala fibroblaster.

Effekt av akteosid på ROS och apoptos

Effekten avakteosidpå ROS bestämdes av FACS med användning av karboxi-H2DCFDA, en oxidativ stressindikator som aktiveras i celler när esteraser tar bort acetatgrupper mellan celler (Fig 1). ROS detekterades vid lägre nivåer i akteosidbehandlade celler än i celler synkroniserade genom serumsvält eller kontakthämning. Nivån av ROS var signifikant lägre i akteosidbehandlingsgruppen (42,8 procent) än i kontakthämnings- och serumsvältgruppen (54,3 respektive 99,5 procent) (tabell 2).

För att förstå effekten avakteosidpå cellöverlevnad och död undersöktes apoptos i celler efter induktion av cellcykelsynkronisering. Överlevnaden för akteosidbehandlade celler (94,8 ± 1,2 procent) var signifikant högre än både kontakthämnings- och serumsvältgruppen (87,3 ± 0,5 procent) (Fig 2D). Graden av apoptos i serumsvältgruppen

(52,1 ± 5,3 procent) var signifikant högre än de i kontaktinhiberings- och akteosidbehandlingsgrupperna (Fig 2E). Apoptos som observerades i kontaktinhiberingsgruppen var 10,6 procent, vilket också var signifikant högre än akteosidbehandlingsgruppen (4,2 procent) (Fig 2E). Dessutom fanns det mindre nekros i akteosidbehandlade celler jämfört med den i kontaktinhiberingsgruppen (Fig 2F).

Cistanchedeserticola acteosid kan förstärkaimmunitetoch minskaapoptos

Effekt av akteosid på in vitro-utveckling av nukleära överföringsembryon från hund

För att undersöka effekten av akteosid i SCNT embryonutveckling överfördes kärndonatorceller till hundkärnade oocyter efter cellcykelsynkronisering genomakteosid. Som visas i tabell 3 fanns det inga signifikanta skillnader i tidig embryoutveckling från kärnkraften

Tabell 2. Kvantifiering av ROS

Fig 2. Hastigheter för cellöverlevnad, apoptos och nekros av hundfosterfibroblaster. Apoptotiska celler i (A) kontakthämning, (B) serumsvält och (C) 30 μMakteosidbehandling för 48 timmars grupp bestämdes med FACS; Kvantitativ analys av FACS-resultaten av (D) cellöverlevnad, (E) apoptos och (F) nekros. Detta experiment upprepades fyra gånger oberoende av varandra. (P<>

donatorceller med olika cellcykelsynkroniseringsmetoder för antingen kontakthämning eller akteosidbehandling. Det är dock bara SCNT-embryona från hundar som konstruerats genom att använda kärndonatorcellerna synkroniserade vid G0/G1-stadiet med akteosid som utvecklades bortom 10-cellembryostadiet.

Produktion av en klonad hund med hjälp av celler odlade medakteosid

Femtiosju klonade hundembryon producerade med hjälp av kontaktinhiberade donatorceller överfördes kirurgiskt till äggledarna hos 6 mottagare. Ingen av de 6 mottagarna fick avkomma

Tabell 3. In vitro-utveckling av nukleära överföringsembryon från hund.

Tabell 4. Produktion av en klonad hund med SCNT.

eller till och med blivit gravid. Trettioåtta klonade hundembryon producerade från akteosidbehandlade donatorceller överfördes också kirurgiskt till äggledarna hos tre mottagare. Dräktighet bekräftades hos en av de tre surrogatmödrarna, som så småningom födde, genom kejsarsnitt, en frisk valp som vägde 354 g (tabell 4 och fig 3). För att bestämma genomets ursprung utfördes mikrosatellitamplifiering med generna från den klonade hunden. Mikrosatelliter är korta upprepade tandemsekvenser som används i genomscreeningar för att spåra ärftlighet och länkanalys i familjer. Sju mikrosatellitmarkörer användes för att identifiera ursprunget för genomet i den klonade hunden (tabell 5). De klonade hund- och donatorcellerna som användes för att klona hunden hade samma mikrosatellitmarkörer, medan oocytdonatorn och surrogatet endast delade partiella alleler (tabell 5). I det maternala härkomsttestet hade den klonade hunden och den mottagande oocyten identiska mitokondrie-DNA-sekvenser (mtDNA), vilket visar att mtDNA från den klonade hunden härrörde från oocytdonatorn (tabell 6).

akteosidi cistanche

Diskussion

Synkronisering av donatorcellcykeln är en viktig faktor för att förbättra SCNT-effektiviteten [43]. Hastigheten för SCNT embryonutveckling och effektiviteten av kloning av djurproduktioner

Fig 3. En klonad hund: (A) Ultraljud av fostret i fostervesikeln 32 dagar efter embryoöverföring; (B) Den klonade beagle vid 2 månaders ålder.

akteosidicistanchekan anti-aging