Del 1 Doxorubicin lindrar paradoxalt tumörinducerad inflammation hos unga möss

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ibrahim Y. Abdelgawad et al

Cistanche tubulosa förhindrar njursjukdom, klicka här för att fåprodukter och Cistanche herba

Abstrakt:

Doxorubicin(DOX) är ett av de mest använda kemoterapeutiska medlen inom pediatrisk onkologi. DOX framkallar ett inflammatoriskt svar i flera organ, vilket bidrar till DOX-inducerade negativa effekter. Cancer i sig orsakar inflammation som leder till flera patologiska tillstånd. Den aktuella studien undersökte det inflammatoriska svaret på DOX ochtumörermed en EL4-lymfom, immunokompetent, juvenil musmodell. Fyra veckor gamla manliga C57BL/6N-möss injicerades subkutant med EL4-lymfomceller (5 × 104 celler/mus) i flankregionen, medantumör-fria möss injicerades med vehikel. Tre dagar efter tumörimplantation injicerades både tumörfria och tumörbärande möss intraperitonealt med antingen DOX (4 mg/kg/vecka) eller koksaltlösning under 3 veckor. En vecka efter den sista DOX-injektionen avlivades mössen och hjärtan, lever,njuraroch serum skördades. Genuttryck och serumkoncentration av inflammatoriska markörer kvantifierades med användning av realtids-PCR respektive ELISA. DOX-behandling avsevärt undertryckttumörtillväxt i tumörbärande möss och orsakade betydande hjärtatrofi hos tumörfria och tumörbärande möss. EL4-tumörer framkallade ett starkt inflammatoriskt svar i hjärtat, levern ochnjure. Påfallande nog förbättrade DOX-behandling tumörinducerad inflammation paradoxalt för effekten av DOX i tumörfria möss, vilket visar en vitt skilda effekt av DOX-behandling i tumörfria kontra tumörbärande möss.

Nyckelord:doxorubicin; tumör; inflammation

1. Introduktion

Doxorubicin (DOX), även känt som Adriamycin, är ett av de mest använda kemoterapeutiska medlen inom pediatrisk klinisk onkologi. Trots dess effektivitet i ett brett spektrum av cancerformer, inklusive lymfom, leukemi och andra pediatriska cancerformer, är DOX:s kliniska användbarhet begränsad på grund av dess multipla organtoxicitet. Förutom dess markanta kardiotoxicitet [1], har DOX visat sig orsaka nefrotoxicitet [2-5] och levertoxicitet [6]. Nästan 50 procent av pediatriska cancerpatienter får DOX som en del av sitt behandlingsprotokoll [7]. På grund av effektiva cancerbehandlingar, inklusive DOX, har 5-årsöverlevnaden för barn som diagnostiserats med cancer ökat från mindre än 60 procent på 1970-talet till mer än 80 procent nu [8,9]. Detta leder till en stor population av barncanceröverlevande (CCS), som uppskattas till cirka 400,000. Tyvärr löper CCS:er hög risk att utveckla långsiktiga biverkningar på grund av cancerbehandling och/eller cancer i sig.

DOX har visat sig utlösa systemisk inflammation [10–12] och inflammatoriskt svar i flera organ inklusive hjärtat [13],njure[14] och lever [15]. Detta inflammatoriska svar har visat sig främja DOX-inducerade biverkningar [16,17]. Majoriteten av dessa studier som rapporterar DOX-inducerad inflammation har utförts itumör-fria djurmodeller som inte efterliknar det kliniska scenariot där pediatriska cancerpatienter får DOX-behandling efter diagnosen cancer. Cancer i sig har också visat sig orsaka inflammation som bidrar till flera patologiska tillstånd som kan förvärra DOX-inducerade toxiciteter [18,19]. Därför finns det ett kritiskt behov av att etablera kliniskt relevanta djurmodeller för att undersöka mekanismerna för DOX-inducerad multipel organtoxicitet hos unga,tumör-bärande möss för att studera samspelet mellan DOX-behandling och cancer i sig för att orsaka sådana toxiciteter.

I den aktuella studien undersökte vi det inflammatoriska svaret på DOX och tumören i en kliniskt relevant syngenisk EL4-lymfom, immunokompetent, juvenil musmodell. Denna modell är väletablerad inom cancerforskning [20] och är kliniskt relevant för pediatriska cancerpatienter eftersom lymfom är en av de vanligaste typerna av pediatrisk cancer [21]. Användningen av syngena möss är avgörande för att studera det inflammatoriska svaret på både DOX och tumören på grund av immunsystemets kritiska roll i patogenesen av inflammation [22]. Mössens ålder var 5 veckor vid administrering av DOX, vilket motsvarar tonårsåldern 10–12 år hos människor [23]. Dessutom är de administrerade DOX-doserna kliniskt relevanta för de doser som tas emot av pediatriska cancerpatienter [24]. Vi bestämde först effekterna av DOX på hjärtfunktionen i tumörfria och tumörbärande möss, eftersom DOX-inducerad kardiotoxicitet anses vara den mest kliniskt relevanta negativa effekten av DOX, bland andra multipla organtoxiciteter. Därefter bestämde vi effekten av DOX, tumören och deras kombination på flera inflammatoriska markörer i hjärtat, levern ochnjureförutom serummarkörer för systemisk inflammation. Vi fann att närvaron av EL4-tumören framkallade ett starkt inflammatoriskt svar i flera organ. Påfallande nog förbättrade DOX-behandling tumörinducerad inflammation paradoxalt mot den tidigare rapporterade effekten av DOX i tumörfria möss.

2. Resultat

2.1. Effekter av DOX på kroppsvikt och tumörtillväxt

Den aktuella studien etablerades i juvenila möss för att efterlikna det kliniska scenariot hos pediatriska cancerpatienter som beskrivs i figur 1A. Ingen signifikant morbiditet eller dödlighet observerades hos vare sig tumörfria eller tumörbärande möss efter exponering för DOX (4 mg/kg/vecka i 3 veckor), vilket är i överensstämmelse med vår tidigare studie med samma dos [25]. Ungdomsexponering för DOX resulterade dock i en signifikant minskad kroppsviktsökning jämfört med saltlösningsbehandlade möss (Figur 1B). För att bedöma anticancereffekten av DOX i denna EL4-lymfommodell mätte vi tumörvikterna efter möss obduktion. Kronisk DOX-administrering i tumörbärande möss hämmade signifikant EL4-tumörtillväxten, vilket visar anticancereffekten av denna dosregim av DOX (Figur 1C).

2.2. Effekt av DOX-administration på hjärtfunktion och morfometri hos tumörfria och tumörbärande möss

DOX orsakade hjärtatrofi, vilket framgår av en signifikant minskning av hjärtvikten till tibialängden (HW/TL) (Figur 1D). Anmärkningsvärt nog förstärktes hjärtatrofi orsakad av DOX i tumörbärande möss (Figur 1D). Effekterna av DOX, tumör och kombinationen av båda på hjärtfunktion och morfologi bedömdes med hjälp av transthorax ekokardiografi. Representativa M-Mode-bilder från varje grupp visas i figur 2A. Varken DOX eller tumören orsakade signifikanta förändringar i ejektionsfraktion (Figur 2B), hjärtminutvolym (Figur 2C), fraktionerad förkortning (Figur 2D), vänster ventrikulär (LV) massa (Figur 2E), LV bakre väggtjocklek i diastole (LVPW' d) (Figur 2F), eller LV bakre väggtjocklek i systole (LVPW) (Figur 2G).

2.3. Effekt av DOX-administration på genuttryck av inflammatoriska markörer i hjärtat av tumörbärande och tumörfria möss

Hjärtan skördades från både tumörfria och EL4-lymfomtumörbärande juvenila C57BL/6N-möss en vecka efter administrering av 4 mg/kg/vecka av DOX eller motsvarande volym steril koksaltlösning under 3 veckor (n=8 per vecka) grupp). Efter extraktion av totalt RNA, uttryck av hjärt-mRNA av inflammatoriska markörer interleukin-1 alfa (IL-1), interleukin-1 beta (IL-1), interleukin{{12} } (IL-6), tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-), inflammatoriska kemokiner monocyt kemoattraherande protein-1 (Mcp-1), och CX C-motiv kemokiner (Cxcl1, Cxcl9 och Cxcl10) bestämdes genom realtids-PCR. Genuttrycket av flera inflammatoriska markörer i hjärtat uppreglerades signifikant i tumörbärande möss jämfört med tumörfria möss, inklusive de pro-inflammatoriska cytokinerna IL-1 (Figur 3A), IL-1 ( Figur 3B), IL-6 (Figur 3C) och TNF- (Figur 3D) och de inflammatoriska kemokinerna Mcp-1 (Figur 3E), Cxcl1 (Figur 3F) och Cxcl10 (Figur 3H). Medan administrering av DOX i tumörfria möss inte resulterade i signifikanta förändringar i uttrycket av inflammatoriska markörer i hjärtat, upphävde administrering av DOX signifikant den tumörinducerade uppregleringen av IL-1 (Figur 3B), Mcp{{44} } (Figur 3E), Cxcl9 (Figur 3G) och Cxcl10 (Figur 3H). Viktigt, tvåvägs ANOVA visade en signifikant interaktionseffekt i alla markörer utom Cxcl1, Cxcl9 och Cxcl10, vilket visar de divergerande effekter som DOX har på hjärtinflammatoriska markörer hos tumörbärande jämfört med tumörfria möss.

2.4. Effekt av DOX-administration på genuttryck av inflammatoriska markörer i levern hos tumörfria och tumörbärande möss

Lever skördades från både tumörfria och EL4-lymfomtumörbärande juvenila C57BL/6N-möss en vecka efter administrering av 4 mg/kg/vecka av DOX eller motsvarande volym steril koksaltlösning under 3 veckor (n=8 per vecka) grupp). Efter extraktion av totalt RNA, uttryck av hepatisk mRNA av inflammatoriska markörer IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 och Cxcl10 bestämdes genom realtids-PCR. Tumörbärande möss hade signifikant förhöjt leveruttryck av de pro-inflammatoriska cytokinerna IL-1 (Figur 4A), IL-1 (Figur 4B), TNF- (Figur 4D), Cxcl9 (Figur 4G), och Cxcl10 (Figur 4H) jämfört med tumörfria möss. Även om det är mindre anmärkningsvärt, visar tvåvägs ANOVA en signifikant effekt av tumören på det hepatiska genuttrycket av IL-6 (Figur 4C). Tvåvägs ANOVA visade en signifikant interaktionseffekt mellan tumören och DOX i Cxcl10 (Figur 4H). DOX-administration minskade tumörinducerad uppreglering av IL-1 och TNF- (Figur 4B, D). Varken DOX eller tumören hade någon signifikant effekt på det hepatiska uttrycket av inflammatoriska kemokiner Mcp-1 och Cxcl1 (Figur 4E, F).

2.5. Effekt av DOX-administration på genuttryck av inflammatoriska markörer i njurarna hos tumörfria och tumörbärande möss

Njurar skördades från både tumörfria och EL4-lymfomtumörbärande juvenila C57BL/6N-möss en vecka efter administrering av 4 mg/kg/vecka av DOX eller motsvarande volym steril koksaltlösning under 3 veckor (n=8 per grupp). Efter extraktion av totalt RNA, uttryck av njur-mRNA av inflammatoriska markörer IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 och Cxcl10 bestämdes genom realtids-PCR. I linje med de observerade förändringarna i hjärtat och levern hade tumörbärande möss signifikant ökat renalt uttryck av de proinflammatoriska cytokinerna IL-1 (Figur 5A), IL-1 (Figur 5B), TNF- (Figur 5D) och Mcp-1 (Figur 5E) jämfört med tumörfria möss. Dessutom visar tvåvägs ANOVA en signifikant effekt av tumören på det renala genuttrycket av Cxcl1 (Figur 5F), Cxcl9 (Figur 5G) och Cxcl10 (Figur 5H). DOX-administration i tumörbärande möss förbättrade signifikant den tumörinducerade uppregleringen av IL-1 (Figur 5B), IL-6 (Figur 5C), TNF- (Figur 5D) och Mcp{{43} } (Figur 5E). Inom dessa markörer visade tvåvägs ANOVA också en signifikant interaktion mellan DOX och tumören, vilket visar de olika effekterna som DOX har på njurinflammatoriska markörer hos tumörbärande jämfört med tumörfria möss.

2.6. Effekt av DOX-administration på histopatologiska egenskaper i hjärtat, levern och njurarna hos tumörfria och tumörbärande möss

Hjärtan, lever och njurar skördades från en kohort av tumörfria och EL4-lymfomtumörbärande juvenila C57BL/6N-möss en vecka efter administrering av 4 mg/kg/vecka av DOX eller motsvarande volym steril koksaltlösning under 3 veckor ( n=4 per grupp). Den histopatologiska utvärderingen visade inga större patologiska förändringar i hjärtat (Figur 6A). Endast minimal inflammatorisk cellinfiltration, påvisad som sällsynta foci av minimalt cellulär blandad (mononukleär och neutrofil) inflammation, observerades i levervävnaderna skördade från DOX-behandlade tumörfria (tre av fyra möss), saltlösningsbehandlade tumörbärande ( två av fyra möss) och DOX-behandlade tumörbärande möss (tre av fyra möss) (Figur 6B). Histopatologisk utvärdering av njurarna visade inga större patologiska förändringar i alla grupper utom DOX-behandlade tumörbärande möss (Figur 6C), med två av de fyra mössen i denna grupp som uppvisade regioner av fulltjock tubulär regenerering, fibros och mild interstitiell inflammation som påverkar cirka 5 procent av den totala vävnadsytan.

2.7. Divergerande effekter av DOX på seruminflammatoriska cytokiner i tumörfria kontra tumörbärande möss

Vi har tidigare rapporterat att akut DOX-administration framkallade ett systemiskt inflammatoriskt svar hos vuxna C57BL/6N-möss [11]. Häri bestämde vi effekten av kronisk DOX-administrering på serumnivåer av de inflammatoriska markörerna IL-6 och TNF-, i juvenila tumörfria och tumörbärande möss. Saltlösningsbehandlade tumörbärande möss visade en markant, om än statistiskt insignifikant, ökning av serum IL-6 (Figur 7A) och TNF- (Figur 7B) jämfört med tumörfria möss. Viktigt är att tvåvägs ANOVA visade en signifikant interaktion mellan DOX-administrering och tumören på serumnivåerna av IL-6 och TNF-. DOX-administration normaliserade faktiskt tumörinducerad uppreglering av IL-6 till en liknande nivå som kontrolltumörfria möss (Figur 7A).