Del 1|Glykogensyntaskinas 3b hyperaktivitet i exfolierade urinceller förutsäger utvecklingen av diabetisk njursjukdom

Xianhui Liang, et al

1Blood Purification Center, Institute of Nephrology, det första anslutna sjukhuset vid Zhengzhou University, Zhengzhou, Kina; 2 Institutionen för medicin, avdelningen för njursjukdomar och högt blodtryck, Rhode Island Hospital, Brown University School of Medicine, Providence, RhodeIsland, USA; och 3 Department of Medicine, Division of Nephrology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio, USA

För mer information vänligen kontakta:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

Växande bevis pekar på glykogensyntaskinas(GSK)3b som en nyckelspelare inom olikanjursjukdomar. Men som en pivotal omvandlare av insulinsignalvägen, spelar GSK3bs roll hos diabetikernjure sjukdomförblir osäker. Hos DB/DB-möss ökade njurexpressionen av totalt och aktiverat GSK3b alltmer. Detta föregick utvecklingen av diabetikernjure sjukdomoch korrelerade med utvecklingen av tecken pådiabetikernjureskada, inklusive albuminuri och extracellulär matrixackumulering i glomeruli och tubulointerstitial. In vitro inducerade exponering av glomerulära podocyter, mesangialceller och tubulära njurceller för en diabetisk miljö GSK3boverexpression och hyperaktivitet, vilket verkar väsentligt och tillräckligt för att framkalladiabetikercellulära skador i njurceller, eftersom den cytopatiska effekten av den diabetiska miljön mildrades av GSK3b knockdown, men efterliknades av ektopiskt uttryck av konstitutivt aktivt GSK3b även i den normala miljön. Inkonsekvens, njurbiopsiprover som tagits från patienter med olika stadier av diabetisk nefropati avslöjade ett förstärkt uttryck av totalt och aktiverat GSK3b i glomeruli och njurtubuli, associerat med svårighetsgraden av diabetisk nefropati. Dessutom, i retrospektiva kohorter av typ 2-diabetespatienter som följdes i över fem år, representerade den relativa aktiviteten av GSK3b i exfolierade urinceller en oberoende riskfaktor för utveckling eller progression av nedsatt njurfunktion. Dessutom visade mottagarens funktionskarakteristiska kurvaanalys att GSK3b-aktivitet i urinexfolierade celler gav mycket bättre kraft än albuminuri hos diabetiker med progressivt nedsatt njurfunktion från de med stabil njurfunktion. Således förstärks njurexpression och aktivitet av GSK3b vid experimentell och klinisk diabetisk nefropati. Därför kan GSK3b i urinexfolierade celler fungera som en ny biomarkör för att förutsäga diabetikernjuresjukdomprogression.

Diabetisk njursjukdom(DKD) fortsätter att vara en ledande orsak till njursvikt i slutstadiet i USA och andra utvecklade länder.1,2 Men inte alla patienter med diabetes mellitus utvecklar diabetisk nefropati (DN), vilket framgår av ett antal lång- term epidemiologiska uppföljningsstudier.3 Orsaken till detta heterogena utfall är inte helt klarlagd, men till synes multifaktoriell, involverande olika orsaksfaktorer, inklusive genetik, miljöer, redan existerandenjuresjukdom, och svårighetsgraden av diabetes.4,5 Dålig glykemisk kontroll har varit en välkänd riskfaktor för albuminuri och DN. Ändå utvecklar en betydande del av patienterna fortfarande DN trots strikt glykemisk kontroll.6 I klinisk praxis är det nödvändigt att använda en känslig och exakt biomarkör för att stratifiera diabetespatienter som riskerar att utvecklas till nedsatt njurfunktion. Albuminuri har i flera år ansetts vara en surrogatmarkör för diabetiska njurkomplikationer.7,8 Ändå tyder en växande mängd bevis på att albuminuri kanske inte är korrekt.9,10 En signifikant disharmoni mellan albuminuri och nedsatt njurfunktion i DN har noterats. 11,12 Enligt data från Förenade kungariket Prospective Diabetes Study13 av de patienter som utvecklade njurfunktionsnedsättning hade 61 procent inte albuminuri i förväg och 39 procent utvecklade aldrig albuminuri under studien. Likaså av de patienter som utvecklade albuminuri utvecklade endast 24 procent senare nedsatt njurfunktion under studien. Med andra ord, för patienter med mikroalbuminuri eller makroalbuminuri kanske den övervägande majoriteten inte utvecklar nedsatt njurfunktion. Dessa data utmanar alltså det klassiska paradigmet albuminuri som alltid föregår njursvikt under progressionen av DKD. Som sådan är det absolut nödvändigt att identifiera nya biomarkörer.

för att förutsäga DN eller för tidig diagnos av DN. Under det senaste decenniet har ett antal nya molekyler testats.14–16 Bland dessa har glykogensyntaskinas 3 (GSK3) dykt upp som en attraktiv kandidat. GSK3 är ett mycket konserverat, allestädes närvarande uttryckt serin/treonin-proteinkinas som ursprungligen karakteriserades för att vara en nyckeltransduktor för insulinsignaleringskaskaden och styr glykogenesen. Intresset för GSK3 ökade kraftigt med insikten att det också fungerar som en konvergenspunkt för flera cellsignaleringsvägar involverade iinflammation, immunmodulering, embryogenes, vävnadsskada, reparation och regenerering.17–19 GSK3 finns som 2 isoformer: GSK3a och GSK3b. I olika organvävnader uttrycks de två isoformerna differentiellt. I njurbarken uttrycks b-isoformen övervägande och lokaliserad till glomeruli och proximala tubulära celler.20,21 Renal GSK3b-överaktivitet har associerats med en mängd olika njursjukdomar, inklusive proteinuriska Glo-neuropatier och progressiv kronisk njursjukdom.22 Ändå , som en nyckelomvandlare av insulinsignaleringsvägen, är rollen för GSK3b i patogenesen av DN ännu okänd. Det återstår att avgränsa om GSK3b dysreglering i njuren är involverad i DN. För att lösa detta problem undersökte den här studien uttrycksprofilerna för totalt och aktiverat GSK3b i njurprover som tagits från dB/dB murina modeller av icke-insulinberoende DN och i njurbiopsivävnader från patienter med olika stadier av typ 2 DN. Dessutom, i retrospektiva kohorter av patienter med typ 2-diabetes, mättes uttrycksnivåerna av total och aktiverad GSK3b i urinexfolierade celler, som provtogs som en urinbaserad flytande njurbiopsi. Vi undersökte sambandet mellan expressionsnivåerna av GSK3b eller dess aktiverade form i exfolierade urinexfolierade celler vid baslinjen och utvecklingen eller progressionen av nedsatt njurfunktion hos diabetespatienter.

RESULTAT

GSK3b är överuttryckt och hyperaktivt i njurparenkymceller hos db/db-möss, associerat med progression av albuminuri och diabetisk njurskada

db/db-möss med leptinreceptorbrist är väletablerade modeller för typ 2-diabetes mellitus och DN. Från och med 10 veckors ålder utvecklar db/db möss spontant tidiga tecken pånjurskador, kännetecknad av progressiv albuminuri och matrisackumulering i glomeruli.23 Däremot har åldersmatchade kontrollmöss (db/m) normal glykemi och inga märkbara tecken pånjursjukdom. I ett experiment som började vid 10 veckors ålder, ökade njurexpressionen av totalt (Figur 1) och aktiverad (Figur 2) GSK3b (fosforylerad vid Y216 [p-GSK3B]) i db/db-möss mot kontroll-db/m-möss progressivt ( Figur Ib och 2b). Detta var huvudsakligen lokaliserat till podocyter och mesangiala celler i glomeruli (Figur 1a) och till tubulära epitelceller i tubulointerstitial (Figur 2a), vilket framgår av immunhistokemifärgning. De morfologiska fynden bekräftades genom immunoblotanalys av helnjurhomogenat (Figur 1c och 2c). Regressionsanalys visade att färgningsintensiteten för total (Figur 1d) och aktiverad (Figur 2d) GSK3b i glomeruli positivt korrelerade med urinutsöndringen av albuminuri i db/db-möss vid olika åldrar. Även i det tidiga skedet av diabetes hos db/db-möss, såsom vid 10 eller 14 veckors ålder, var aktiviteten av GSK3b markant förhöjd i njurarna, vilket återspeglas av en signifikant induktion av p-GSK3b (Figur 2). Det verkar som om GSK3b-hyperaktivitet i njurarna hos db/db-möss i det tidiga skedet till stor del berodde på posttranslationella modifieringar, såsom fosforylering vid Y216, men i ett senare skede berodde det främst på ökat uttryck av totalt GSK3b.

Progressionen av DN har ökande ackumulering av den extracellulära matrisen i både glomeruli och interstitiell. I själva verket, som visas av FL-fluorescerande immunhistokemi-färgning, visade db/db musnjurar progressivt ökat uttryck av fibronektin i både glomeruli och interstitiell (Figur 3a). Detta bekräftades ytterligare genom immunoblotanalys av njurhomogenat för fibronektin och kollagen IV (Figur 3b och c). Dessutom korrelerade uttrycket av totalt och aktiverat GSK3b positivt med det för fibronektin injurvävnader(Figur 3d).

För att ytterligare bestämma om förstärkt GSK3b-aktivering föregår utvecklingen av DKD, följdes db/db och db/m möss upp i ett separat experiment med start vid 4 veckors ålder under prediabetesstadiet. Vid vecka 7 visade db/db-möss uppenbar hyperglykemi (kompletterande figur S1A), vilket tyder på diabetes, men inga tecken på DKD, vilket visas av normal albuminuri (kompletterande figur S1B). Det bör noteras att även i ett så tidigt stadium av diabetes hade njurexpression av GSK3b och p-GSK3b såväl som den relativa aktiviteten av GSK3b uttryckt som p-GSK3b/GSK3b-förhållande, ökat varierande, mätt med immunoblotanalys av njurbiopsivävnader följt av densitometri (kompletterande figur S1C och D). Dessutom visade linjär regressionsanalys att renal GSK3b-aktivitet vid vecka 7 positivt korrelerade med utvecklingen av albuminuri och DKD vid vecka 13 (kompletterande figur S1E). Dessutom visade analys av mottagarens funktionskarakteristik (ROC) kurva att njur GSK3b-aktivitet i db/db möss vid 7 veckors ålder, när det inte fanns några tecken på DKD, gav utmärkt noggrannhet och kraft för att förutsäga utvecklingen av albuminuri och DKD (tilläggsbild) S1F).

Exponering av njurceller för en diabetisk miljö orsakar överuttryck och hyperaktivitet av GSK3b, vilket resulterar i diabetiska cytopatiska förändringar

För att avgöra om diabetestillstånd direkt förbättrar GSK3b-aktivering injurceller, användes in vitro-kulturer av olika njurcellinjer, inklusive murina podocyter, mesangiala celler och tubulära epitelceller, och exponerades för en diabetisk miljö som består av hög omgivande glukos och transformerande tillväxtfaktor (TGF) b1. Exponering av podocyter för den diabetiska miljön resulterade i slående podocytskada, markerad av en förlust av podocytmarkörproteinet synaptopodin. Detta var samtidig ränta med framträdande induktion av totalt och aktiverat GSK3b, vilket framgår av FL-fluorescerande immuncytokemifärgning (Figur 4a och b) och bekräftat genom immunoblotanalys

(Figur 4c och d). I odlade mesangiala celler ökades uttrycket av totalt (Figur 5a) och aktiverat (Figur 5b) GSK3b på samma sätt efter exponering för den diabetiska miljön, parallellt med ökat uttryck av extracellulära matrismolekyler såsom fibronektin (Figur 5). På liknande sätt överuttryckte odlade tubulära njurepitelceller totalt och aktiverat GSK3b efter behandling i diabetisk miljö, och detta åtföljdes av tubulär celldysfunktion och dedifferentiering, märkt av minskat och stört uttryck av epiteliala tight junction-molekyler såsom zonula occludens -1 -1) (Figur 6a–d). Däremot, som en osmolalitetskontroll, resulterade mannitolbehandling av alla njurceller i en effekt som inte var annorlunda än vilken överfördes av den normala miljön innehållande normalt omgivande glukos. Human diabetes involverar inte bara hyperglykemi utan också insulinresistens. Även om det är omöjligt att helt separera hyperglykemi från insulinresistens i djurmodeller eller hos patienter, har in vitro-modeller utnyttjats för att undersöka den isolerade effekten av högt glukos kontra insulinresistens. För att efterlikna tillståndet av insulinresistens slogs b-isoformen av insulinreceptorn ner i odlade podocyter, mesangialceller och njurrörsceller (kompletterande figur S2A–C), och detta förstärkte uttrycket och aktiviteten av GSK3b även i normal miljö, vilket visas genom immunoblotanalys och densitometri. Denna verkan förstärktes efter exponering för den diabetiska miljön, vilket betecknar en synergistisk effekt av insulinresistens och hög glukos på aktivering av GSK3b.

GSK3b-hyperaktivitet är väsentlig och tillräcklig för njurcellsskada och dysfunktion framkallad av diabetikermiljön

För att undersöka om GSK3b-hyperaktivitet är involverad i cytopatiska förändringar i njurceller, GSK3b-aktivitet iodlad njureceller manipulerades artificiellt genom RNA-interferens

(RNAi) eller genöveruttryck. Såsom visas i figur 7a påverkar RNAi som använder små störande RNA förvränga knappt den cytopatiska effekten av den diabetiska miljön i alla njurceller. Däremot upphävde GSK3b-tystnad avsevärt den diabetiska miljö-instiftade synaptopodin-undertryckningen i podocyter, fibronektin-induktion i mesangiala celler och ZO-1-störning i njurtubulära celler, vilket antyder att GSK3b sannolikt är avgörande för att utlösa diabetesrelaterade cytopatiska förändringar i njurceller. För att urskilja om GSK3b-överuttryck och hyperaktivitet är tillräckliga för de cytopatiska effekterna inducerade av den diabetiska miljön, transfekterades celler övergående med antingen en tom vektor eller en vektor som kodar för den konstitutivt aktiva mutanten av GSK3b (S9A). Även om tom vektortransfektion knappt utövade några effekter, resulterade ektopiskt överuttryck av S9A i förlust av synaptopodin-uttryck i podocyter, förhöjd fibronektinproduktion i mesangiala celler och minskat ZO-1-uttryck i njurrörsceller även i normal miljö (Figur 7b), som påminner om den cytopatiska effekten av den diabetiska miljön.

Progression av humant DN sammanfaller med GSK3b-överuttryck och hyperaktivitet i renala glomeruli och tubuli

För att ytterligare validera om ovanstående fynd i djur- och cellodlingsmodeller också är tillämpliga på klinisk DN, bearbetades arkiverade njurbiopsivävnader från normala försökspersoner och patienter med olika stadier av DN för peroxidasimmunhistokemifärgning för GSK3b och p-GSK3b. Egenskaperna hos kontrollpersoner och patienter sammanfattas i tilläggstabell S1. Som visas i figur 8a, renal

uttryck av totalt och aktiverat GSK3b ökades alltmer tillsammans med DN-progression enligt den patologiska klassificeringen baserad på periodic acid-Schiff-färgning. Detta överensstämmer med Nephroseq-data, som också visar ett signifikant ökat GSK3b-uttryck i njurbiopsivävnader från patienter med DN (kompletterande figur S3). Det ökade uttrycket av totalt och aktiverat GSK3b var övervägande lokaliserat till podocyter och mesangialceller i glomeruli och till renala tubulära epitelceller i tubulointerstitial (Figur 8a), i överensstämmelse med fynden i db/db-möss. De morfologiska resultaten bekräftades ytterligare av datoriserad morfometrisk analys, som avslöjade ett positivt samband mellan uttrycksnivåerna för total (Figur 8b) eller aktiverad (Figur 8c) GSK3b och svårighetsgraden av DN.

GSK3b är hyperaktivt i urinexfolierade celler som samlats in från diabetespatienter och förutsäger utvecklingen av nedsatt njurfunktion Under både fysiologiska och sjukdomstillstånd sker omsättning och utsöndring av njurepitelceller, såsom glomerulära podocyter och tubulära epitelceller, konstant, vilket leder till kontinuerlig utsöndring av njurparenkymceller i urinen. Urinexfolierade celler har framgångsrikt utnyttjats som urinbaserad icke-invasiv flytande njurbiopsi för forsknings- och diagnostiska syften.24,25 Förutsatt de ovannämnda fynden att uttryck av totalt och aktiverat GSK3b ökar i njurparenkymceller hos patienter med DN och i DB/DB möss redan i ett tidigt skede innan albuminuri manifesterade sig, undrade vi om mätning av GSK3b i urinexfolierade celler kunde utnyttjas för att förutsäga

utvecklingen eller progressionen av mänsklig DKD. För detta ändamål använde vi biobanken för diabetes och genomförde en retrospektiv kohortstudie. Totalt screenades 127 patienter med typ 2-diabetes mellitus, som hade följts upp på First Affiliated Hospital vid Zhengzhou University sedan 2010 med samlade prover av fraktionerad urin, för inkludering i denna studie. Av dessa patienter exkluderades 67, med 10 förlorade för uppföljning, 52 hade njurdysfunktion eller uppenbar proteinuri i början av sjukdomen och 5 diagnostiserades senare som andra njursjukdomar genom njurbiopsi eller bildbehandling. I slutändan inkluderades 60 patienter i denna retrospektiva kohortstudie (Figur 9). De demografiska och kliniska egenskaperna hos dessa patienter vid baslinjen sammanfattas i tabell 1. Ingen av patienterna hade njurdysfunktion eller öppen proteinuri vid baslinjen, och ingen påbörjade dialysbehandling under uppföljningsperioden. Beroende på omfattningen av albuminuri kategoriserades patienterna i två undergrupper: normoalbuminuri och mikroalbuminurigrupper. Med undantag för nivåerna av albuminutsöndring i urin (UAE) var de två undergrupperna av patienter inte statistiskt olika vid baslinjen i alla andra kliniska, biokemiska och fysiologiska parametrar, inklusive diabetesvaraktighet, glykerat hemoglobinnivå, njurfunktion, blodtryck och ordinerade behandlingar . Efter 5 års uppföljning uppvisade 29 av de 60 patienterna progressionen av nedsatt njurfunktion, vilket definierades som antingen en minskning med 25 procent av uppskattad glomerulär filtrationshastighet (eGFR) eller progression av albuminuristatus som indikeras av eskaleringen av svårighetsgraden av albuminuri längs olika kliniska stadier av DN, det vill säga normoalbuminuri, mikroalbuminuri, mikroalbuminuri eller öppen proteinuri. Däremot uppvisade de återstående 31 patienterna inga tecken på njursjukdomsprogression (Figur 9). Patienternas baslinjedata stratifierades enligt progressionsstatus för nedsatt njurfunktion efter 5 års uppföljning (tabell 2). Patienter med progression av nedsatt njurfunktion, jämfört med patienter utan progression, uppvisade en signifikant minskning av eGFR och en markant ökning av UAE. För att avgöra om GSK3b överuttrycktes eller överaktiverades i njurceller och

mätt för att utvärdera känsligheten och specificiteten för GSK3b-aktivitet i urinexfolierade celler i förhållande till baslinjealbuminuri för att förutsäga utvecklingen av nedsatt njurfunktion. Som visas i figur 11 visade den relativa aktiviteten av GSK3b i urinexfolierade celler, uttryckt som p-GSK3b/GSK3b-förhållande, utmärkt noggrannhet och kraft vid att skilja patienter med progressiv njurfunktion från de med stabil njurfunktion, med området under ROC kurvan är 0.844 (95 procents konfidensintervall, 0.747–0.941; P ¼ 0.001 ), vilket var mycket bättre än arean under ROC-kurvan för baslinje Ln(UAE) ({{20}}.750; 95 procents konfidensintervall, 0,626–0,874). Gränsvärdet som maximerade Youdens index var 1,24 för p-GSK3b/GSK3b-förhållandet och 76 mg/24 timmar för UAE. Vid dessa cutoffs var sensitiviteten och specificiteten 69 procent och 87,1 procent för p-GSK3b/GSK3b-förhållandet och 69 procent och 77,4 procent för Ln(UAE). Dessutom förbättrade kombinationen av p-GSK3b/GSK3b-förhållandet med den totala GSK3b-nivån i urinexfolierade celler signifikant urskiljningsförmågan, med arean under ROC-kurvan var 0,971 (95 procents konfidensintervall, 0,931–1.{{48} }). Dessa resultat tyder på att mätningar av GSK3b-aktivitet i urinexfolierade celler kan ge mycket bättre noggrannhet än UAE när det gäller att förutsäga utvecklingen av njurfunktionsnedsättning hos diabetespatienter.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 timmar). Urinexfolierade celler samlade vid baslinjen hämtades och undersöktes genom immunoblotanalys för GSK3b och p-GSK3b (kompletterande figur S4A och B). Aktiviteten hos GSK3b uppskattades av de densitometriska förhållandena mellan p-GSK3b och totalt GSK3b för varje prov i förhållande till värdet av kontrollprover (kompletterande figur S4C).

Bland olika kliniska/biokemiska variabler noterades GSK3b-aktivitet (p-GSK3b/GSK3b-förhållande) i urinexfolierade baslinjeceller vara signifikant högre hos patienter som utvecklade DKD än hos de som inte gjorde det (kompletterande tabell S3). Dessutom antyder ROC-kurvaanalys att den relativa aktiviteten av GSK3b (p-GSK3b/GSK3b-förhållande) i urinexfolierade celler gav utmärkt noggrannhet och kraft för att förutsäga utvecklingen av DKD hos diabetespatienter i tidigt stadium (kompletterande figur S4D).