DEL 1 Regleringsförhållande mellan kvalitetsvariation och miljö av Cistanche Deserticola i tre ekotyper baserade på markmikrobiomanalys

Miljön påverkar jordmikrobiomets sammansättning och funktion, vilket indirekt påverkar växternas kvalitet. I denna studie användes 16S amplikonsekvensering för att avslöja skillnaderna ijordmikrobiell samhällssammansättning avCistanche deserticolai tre ekotyper (saltlösning-alkalimark, gräsmark och sandmark). genom korrelationsanalys av mikrobiellt samhälleligt överflöd, fenyletanoidglykosidinnehåll och ekologiska faktorer, regleringsförhållandet mellan mikrobiellt samhälle och kvalitetsvariationen avC. deserticolaförklarades. den metaboliska funktionsprofilen för jordmikrobiomet förutspåddes med hjälp av Tax4Fun. Data visade att de mikrobiella marksamhällena i de tre ekotyperna var signifikant olika (AMOVA, P< 0.001),="" and="" the="" alpha="" diversity="" of="" the="" grassland="" soil="" microbial="" community="" was="" the="" highest.="" core="" microbiome="" analysis="" demonstrated="" that="" the="" soil="" microbial="" communities="" of="">C. deserticolahade mestadels torka, salttolerans, alkalibeständighet och stressbeständighet, såsom mikrokocker och bacililler. Biomarkörerna, nämligen oceanospirillor (saltlösning-alkalimark), Sphingomonadales (gräsmark) och propionibacteriales (sandmark), kan skilja tre ekotypmikrobiella samhällen, grävdes ut genom LEfSe och slumpmässig skog. Korrelationsanalysresultat visade att 2′-acetylakteosid är positivt korrelerad med oceanospirililler i saltlösning-alkalisk markjord. De metaboliska funktionsprofilerna visade mycket berikad metabolism (kolhydrat- och aminosyrametabolism) och miljöinformationsbehandling (membrantransport och signaltransduktion) vägar. Sammantaget befanns jordmikrobiomets sammansättning och funktion vara viktiga faktorer för kvalitetsvariationen hosC. deserticolai olika ekotyper. Detta arbete gav ny inblick i regleringsförhållandet mellan miljön, markmikrobiella samhällen och växtkvalitetsvariationer.

För mer information kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

Cistanche deserticolaär en icke-fotosyntetisk parasitväxt som kan växa i torra livsmiljöer, såsom sandmark och torrt floddike, samt under stressiga förhållanden, såsom saltlösning-alkalisk mark1. Denna växt parasiterade på rötterna av psammophyte Haloxylon ammodendron, vilket visar starkt motstånd mot hårda miljöförhållanden2. Växter är beroende av den fördelaktiga interaktionen mellan rötter och mikroorganismer för att få näringsämnen, främja tillväxt och motstå yttre stress3. Samtidigt styr jordmikrobiomet den biogeokemiska cykeln av makron- trienter, mikronäringsämnen och andra element som är avgörande för växttillväxt4. Förhållandet mellanC. deserticolaoch rhizosfärens jordmikroorganismer är fortfarande oklara. Följaktligen presenterar rhizosfärens jordmikrobiom avC. deserticolaär nödvändigt.

C. deserticolaanvänds ofta i Östasien, Centralasien, Nordafrika och andra länder som ett slags mat- och hälsovårdsmedicin för att förbättra minnet, förbättra sexuell funktion och skydda levern5,6. De viktigaste aktiva ingredienserna iC. deserticolaär fenyletoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner och polysackarider. Bland dessa komponenter är fagerna de aktiva komponenterna7. Tidigare studie rapporterade att innehållet av PhGs i olika ekotyper avC. deserticolaavsevärt difered, bland annat 2′-acetylakteosid kan användas som en kemisk markör för att särskiljaC. deserticolaproducerad i Xinjiang och Inre Mongoliet1. Studier av mikrobiella samhällen har visat att mikrobiella samhällen kan reglera metabolismen hos sina värdar8,9. Därför kan en jämförelse av förhållandet mellan mikrobiell gemenskap och metaboliter i rhizosfärens jord avC. deserticolai olika ekotyper är brådskande.16S amplikonsekvensering av växtrhizosfärjordprover har utförts för att utforska mångfalden av mikrobiella samhällen, vilket ger nya insikter i förhållandet mellan växter och markmikrobiella samhällen10,11. Till exempel, Föreningen av distributionen och dynamiken hos endofytiska svampar med C. songaricum och N. tangutorum undersöktes i mikrobiomstudier med användning av sekvensering med hög genomströmning11. I denna studie utförde vi 16S rRNA-amplikonsekvensering för att erhålla jordmikrobiomerna iC. deserticolai olika ekotyper. Skillnaderna i jordmikrobiell gemenskap i olika ekotyper jämfördes också, och de biomarkörer som kunde skilja de tre ekotyperna grävdes ut. Korrelationsanalys beräknades sedanvia det viktigaste mikrobiella samhällets överflöd, innehållet i fager och ekologiska faktorer, och regleringsförhållandet undersöktes. Slutligen funktionen av jordmikrobiom avC. deserticolai olika ekotyper förutspåddes.

Material och metoder

Beskrivning och provtagning av studieplatsen.Enligt felds undersökningar,C. deserticolahar tre huvudsakliga ekotyper, inklusive saltlösning-alkalimark, gräsmark och sandmark. I april 2017 samlade vi in jordprover som representerar de viktigaste ekotyperna avC. deserticolai Kina. Jordprover av saltlösning-alkalisk mark samlades in från Ebinur Lake (AB1, AB2, AB3) ochBaicheng Beach (BJ1, BJ2, BJ3, BJ4, BJ5) i Xinjiang-provinsen. Gräsmarksprover togs från byn Tula (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5) i Xinjiangprovinsen. Jordprover av sandig mark samlades in från Alxa (AL1, AL2, AL3, AL4, AL5, AL6) i provinsen Inre Mongoliet och Minqin län (GS1, GS2), Changcheng län (GS3, GS4) i Gansu-provinsen. Information om longitud, latitud och höjd för alla provtagningspunkter visas i tabell 1 och fig. På fältplatsen använde vi en cylindrisk borr i rostfritt stål med en diameter på 5 cm för att samla jorden intill den saftiga stammen avC. deserticolaoch dess värd, och förvarade den omedelbart i ett bärbart kylskåp vid -20 ° C. Efter transport till laboratoriet fördes jordproverna genom en 2 mm sil för att avlägsna växtvävnader, rötter, stenar etc. och förvarades vid –20 °C i kylskåp före pälsförsök.

DNA-extraktion och 16S rRNA-sekvensering.Jord-DNA extraherades med hjälp av PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) enligt manualen12. Renheten och kvaliteten på det genomiska DNA: t kontrollerades av 0,8% agarosgeler elektrofores och nanodroppe.

Den hypervariabla V3-V4-regionen av bakteriell 16S rRNA-gen amplifierades med primrar 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) och 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)13. För varje jordprov lades en 10-siffrig streckkodssekvens till i 5′ änden av de främre och omvända primrar (Allwegene Company, Beijing)12. PCR utfördes på en Mastercycler Gradient (Eppendorf, Tyskland) med användning av 25 μl reaktionsvolymer innehållande 12,5 μl KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix, 1 μl framåtriktad primer (5 μM), 1 μl omvänd primer (5 μM), 5 μl DNA (total mallmängd är 30 ng) och 5,5 μl H2O. Cykelparametrarna är följande: 95 °C i 5 min, följt av 28 cykler på 95 °C i 45 s, 55 °C i 50 s och 72 °C i 45 s, med en fnalförlängning vid 72 °C i 10 min. Tre PCR-produkter per prov poolades för att mildra PCR-bias på reaktionsnivå. PCR-produkterna renades med hjälp av ett QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Tyskland) och kvantifierades sedan med PCR14 i realtid.

Djupsekvensering utfördes på en MISeq-plattform vid Allwegene Company (Peking). Efter körningen utfördes bildanalys, basanrop och feluppskattning med Illumina Analysis Pipeline Version 2.614.

Cistanchetubulosa kan anti-aging

Dataanalys.Rådata screenades frstly och sekvenser avlägsnades baserat på följande kon- siderationer: sekvenser kortare än 200 bp med låg kvalitetspoäng (≤20) och innehöll tvetydiga baser eller matchade inte primersekvenserna och streckkodstaggarna15. Qualifed-läsningar separerades med hjälp av de provspecifc streckkodssekvenserna och trimmades med Illumina Analysis Pipeline Version 2.6. Därefter analyserades dataseten med hjälp av QIIME. Sekvenserna grupperades i operativa taxonomiska enheter (OTU) på en likhetsnivå på 97%16 för att generera sällsynta kurvor och beräkna rikedoms- och mångfaldsindex. Ribosomal Database Project Classifer-verktyget användes för att klassificera alla sekvenser i olika taxonomiska grupper15. Klusteranalyser per- bildades baserat på OTU-informationen från varje prov med hjälp av R för att undersöka likheten mellan olika prover17. UniFracdistances-matrisen mellan mikrobiella samhällen från varje prov beräknades med hjälp av Tayc-coefcienten och representerades som en oviktad pargruppsmetod med aritmetiskt medelvärdesklusterträd, vilket beskriver olikheten (1-likheten) bland de flera proverna18. En Newick-formaterad trädfle genererades också genom denna analys. Alfadiversitet tillämpades i analysen av komplexiteten hos artdiversitet för ett prov med hjälp av fyra index, inklusive Chao1, observerade arter, fylogenetisk mångfald (PD) hela trädet och Shannon mångfaldsindex. Dessa index beräknades med hjälp av QIIME-programvaran (Boulder, CO, USA) i Python (v.1.8.0) (La Jalla, CA, USA)19. Beta-mångfaldsanalys användes för att utvärdera skillnader i prover när det gäller artkomplexitet. Betadiversiteten beräknades med hjälp av den huvudsakliga koordinatanalysen (PCoA) och klusteranalysen i QIIME20. Analysen av molekylär varians (AMOVA) utfördes med användning av mothur. EdgeR användes för att beräkna OTU-diferensen mellan grupper. Heatmap.2 användes för att rita värmekartan, medan Ggplot användes för att rita Manhattan-kartan.

Bestämning av biomarkör och kärnmikrobiom.Metoderna för linjär diskriminant analys (LDA) och ran- dom forest (RF) på webbplatsen Microbiome Analyst21 användes för att bestämma biomarkörmikrobiomet.

Webbplatsen utför för det första icke-parametriska faktoriella Kruskal–Wallis sum-rank-test för att identifiera funktioner med signifikant diferentiell överflöd med tanke på den experimentella faktorn eller klassen av intresse, följt av LDA för att beräkna efektstorleken för varje diferentiellt rikliga egenskaper21. Funktionerna anses vara signifikanta baserat på deras justerade p-värde. Standardvärdet adj.p-värde cutof = 0,05. RF-analys utförs med hjälp av randomForest-paketet5. RF är en övervakad inlärningsalgoritm som är lämplig för högdimensionell dataanalys. Denna metod använder en ensemble av klassificerande träd, som var och en odlas via slumpmässigt funktionsval från ett bootstrap-prov vid varje gren22. Kärnmikrobiomanalys antogs från kärnfunktionen i R-paketet mikrobiom av Microbiome Analyst

korrelationsanalys av viktiga mikrobiella samhällen, PhGs innehåll och ekologiska faktorer.Innehållet i sju fenyletandoidglykosider (PhGs) av de tre ekotyperna av C. deserticola, nämligen echinacosid, cistanosid A, akteosid, isoakteosid, 2′-acetylakteosid, tubulosid A och cistanosid F, bestämdes genom HPLC. De kromatografiska förhållandena involverar en Vatten C18-kolonn (150 mm × 3,9 mm, 4,6 μm), och den mobila fasen består av acetonitril och 0,2% myrsyra. De kromatografiska inställningarna var följande: 0–10 min, 10 %→15 % A; 10–30 min, 15 %→40 % A. Fowhastigheten var 1 ml/min. Absorptionsvåglängden, injektionsvolymen och kolonntemperaturen var 330 nm, 10 μL respektive 27 °C. Metodstudien avser referensgruppens preliminära försöksarbete1.

Denna studie samlade 16 meteorologiska stationer nära de tre ekologiska typerna avC. deserticolaXinjiang Bole 51238, Tacheng 51133, Tori 51241, Karamay 51243, Buxail 51156, Yumin 51137, Emin

51145, Gansu Minqin 52681, Yongchang 52674, Wuwei 52679, Gulang 52784, Inre Mongoliet Suikou 53419, Hangjinhouqi 53420 och Wuhai 53512. Data om sju klimatfaktorer från 1981–2010 fungerade som klimatologiska faktordata för efterföljande korrelationsanalys.

Redundansanalys av diferentiella metaboliter och bioklimatiska faktorer utfördes med hjälp av Programvaran Canoco 523. Pearson korrelation coefcient beräknades för biomarkör mikrobiom överflöd, sammansatt kon- tent och ekologisk faktor data integration. I denna studie utfördes log2-datakonverteringen enhetligt före analysen. SPSS användes för att beräkna Pearson-korrelationen av de sex biomarkörerna, sex kärnmikrobiomer, sju huvudsakliga aktiva komponenter i C. deserticola och de ekologiska faktorerna i de tre livsmiljöerna, och screeningstandarden var följande: pearson korrelation coefcient (r) >0,5 och p värde< 0.05.="" the="" relationships="" amongst="" the="" above="" factors="" were="" visualised="" using="" cytoscape24="" (the="" cytoscape="" consortium,="" san="" diego,="" ca,="" usa,="" version="" 3.7.0)="" and="" pheatmap="" (r="">

Förutsägelse av mikrobiomets mikrobiella funktionella profles.Tax4Fun25 (R-paketet, http:// tax4fun.gobics.de/) användes för att förutsäga mikrobiomernas mikrobiomers mikrobiomer i jordproverna. OTU Biom-tabellen över jordmikrobiom användes som en ingångsfle för metagenomets imputering av C. deserticola jordprover. Därefter analyserades de förutsagda genklassöverflöden på KEGG Orthology (KO) gruppnivå 3. Resultaten från Tax4Fun analyserades i doBy (R-paketet)26.

Resultat

Mikrobiell samhällssammansättning.16S rRNA-sekvenseringen resulterade i 834 323 råläsningar, varav 522 929 passerade kvalitets- och längdfltningen. Datauppsättningen omfattade 20 511–48 337 (medelvärde: 33 994) sekvenser per prov. De högkvalitativa läsningarna grupperades med hjälp av >97% sekvensidentitet i 3541 mikrobiella OTU: er (tabell 1).

Det mikrobiella samhället kategoriserades i allmänhet i 19 phyla, 46 klasser och 87 ordningar (fig. 2a, b och S1–S3). På fylumnivå var aktinobakterier (35%), proteobakterier (31%) och firmicutes (15%) dominerande i saltlösning-alkalimark. Gräsmarken dominerades av aktinobakterier (37%), proteobakterier (29%) och Bacteroidetes (9%). I sandmark var aktinobakterier (42%), proteobakterier (33%) och firmikuter (6%) dominerande. På klassnivå var aktinobakterier (25 %), gammaproteobakterier (21 %) och baciller (15 %) dominerande i saltlösningsalkalimark, medan aktinobakterier (22 %), alfaproteobakterier (16 %) och baciller (8 %) var dominerande i gräsmark. I sandmark dominerade aktinobakterier (23%), alfaproteobakterier (20%) och gammaproteobakterier (9%). På ordernivå (fig. 2c–e) var Micrococcales (22%), Oceanospirillales (15%) och Bacillales (15%) dominerande i saltlösning-alkaliskt land. Micrococcales (11%) och Bacillales (8%) dominerade i gräsmark. Således var de mest dominerande bakterieordningarna Micrococcales (10%) och Acidimicrobiales (7%).

Mångfald av jordbakterier i de tre ekotyperna av C. deserticola.Måtten på mångfald inom urvalet (α mångfald) avslöjade en mångfaldsgradient bland de tre livsmiljöerna (fig. 2f och tabell S1). Alfadiversiteten i det jordbakteriella mikrobiella samhället i varje prov uppskattades med hjälp av samhällets rikedom (Chao 1, som uttrycktes som det projicerade totala antalet OTU i varje prov), observerade arter, PD hela träd och Shannon mångfaldsindex. De observerade arterna, Chao 1 och PD hela trädindex föreslog att gräsmarksjordsamhällen hade den högsta α mångfalden, medan den α mångfalden av saltlösning-alkali och sandiga markjordar är liknande. Resultaten av sällsynthetskurvorna (Fig. S1) liknar ovanstående resultat.

Acteosideicistanchehar goda effekter pånjure

AMOVA-resultaten (tabell S2) visade att p< 0.001,="" which="" indicates="" a="" signifcant="" diference="" amongst="" the="" three="" habitats.="" the="" bray="" distance="" diversity="" tree="" clustering="" results="" (fig.="" s2)="" of="" the="" three="" habitat="" soil="" samples="" demon-="" strated="" that="" the="" saline-alkali="" soil="" samples="" were="" closely="" clustered,="" and="" the="" distance="" between="" the="" grassland="" and="" sandy="" soil="" samples="" was="" close.="" the="" results="" of="" the="" unconstrained="" pcoas="" of="" unweighted="" unifrac="" distance="" 2d="" plots="" (fig.="" 2g)="" showed="" that="" the="" diferent="" soil="" samples="" of="" bacterial="" microbial="" community="" from="" diferent="" habitats="" were="">

jämförelse av jordbakteriella samhällen av de tre ekotyperna av c. deserticola.Diferenta OTU-överflödsvärmekartor och vulkankarta (fig. 3b, e, d, h och tabell S3) indikerade att jämfört med sandiga markprover var 24 respektive 17 OTU: er berikade och utarmade i saltlösningsalkalimark på ordernivå. Dessutom, jämfört med sandiga markprover, berikades och utarmades 8 respektive 11 OTU i gräsmarken. Venndiagrammet (fig. 3c,f) illustrerade att 216 OTU var utarmade i sandmark, 8 var utarmade i saltlösning-alkali

mark och 1 OTU överlappade mellan saltlösning-alkali och sandiga marker. Dessutom berikades 3 OTU:er med gräsmark, medan 161 berikades med sandmark, inklusive 6 OTU:er som överlappade mellan gräsmark och sandmark. Manhattan-tomterna (fig. 3a) visade att Xanthomonadales var mer berikade och utarmade i saltlösning-alkalisk mark än de i sandmark, medan Xanthomonadaceae-bakterien WWH73, WD2101 jordgrupp, Vibrionales och Verrucomicrobiales var signifikant utarmade på ordernivå. Att jämföra gräsmark med sandmark, Xanthomonadales, WD2101 jordgrupp, Vibrionales och Verrucomicrobiales var signifikant utarmade.

Cistanchedeserticola har många effekter på behandlingendiabetes

Bestämning av biomarkör och kärnmikrobiom i de tre ekotyperna av C. deserticola.LEfSe- och RF-metoderna (fig. 4a, b, d) användes för att identifiera egenskaper med signifikant diferentiell överflöd över jordproverna, beräkna efektstorleken för varje diferentiellt rikliga egenskaper och bestämma biomarkörens bakteriella mikrobiom i de tre livsmiljöerna på ordernivå. Resultaten som presenterades i tabell S4 visade att LDA-poängen för Oceanospirillales, Bacillales och Flavobacteriales var den högsta bland dem i saltlösningsalkalilandet, medan Sphingomonadales, Gaiellales, Rubrobacterales, Burkholderiales och Sphingobacteriales var den högsta bland dem i gräsmark. LDA-poängen för Propionibacteriales, Rhodospirillales, Solirubrobacterales, Rhizobiales, Xanthomonadales och Pseudonocardiales var dominerande i sandmark. Med undantag för ode- fned och duplicerade order klassades dessa OTU: er i sex ordningar, och deras överflöd ritades i en värmekarta (fig. 4c).

Persistensmetoden antogs från kärnfunktionen i R-paketets mikrobiom för att identifiera kärnmikrobiomet i de tre ekotyperna av C. deserticola. Denna kärnbakteriella mikrobiom innehöll sex ordningar, ingående mikrokocker, bacillärer, rhizobiales, acidimicrobiales, Streptomycetales ochSphingomonadales. Med undantag för oinrättade och duplicerade order klassades dessa OTU: er i sex ordningar, och deras överflöd drogs i en värmekarta (fig. 2h).

Persistensmetoden antogs från kärnfunktionen i R-paketets mikrobiom för att identifiera kärnmikrobiomet i de tre ekotyperna av C. deserticola. Denna kärnbakteriella mikrobiom innehöll sex ordningar, ingående mikrokocker, bacillärer, rhizobiales, acidimicrobiales, Streptomycetales ochSphingomonadales. Med undantag för oinrättade och duplicerade order klassades dessa OTU: er i sex ordningar, och deras överflöd drogs i en värmekarta (fig. 2h).