DEL 1 Antidepressiva-liknande effekter av Cistanche Tubulosa-extrakt på kroniska oförutsägbara stressråttor genom återställande av tarmmikrobiota homeostas

Växande bevis visar att neuropsykiatriska störningar, såsom depression, är kopplade till tarmmikrobiomet genom tarm-hjärnaxeln.Cistanches Herbaär välkänt för behandling av "njur-yang"-brist i traditionell kinesisk medicin (TCM) och har använts för behandling av neurodegenerativa sjukdomar de senaste åren. I denna studie etablerades den kroniska oförutsägbara stress (CUS)-inducerad depressionsmodellen för att utforska effekten avCistanche tubulosaextrakt (CTE) på beteendetester, monoaminneurotransmittorer och neurotrofiska faktorer i hippocampus och kolon, tarmmikrobiotasammansättning och produktion av kortkedjiga fettsyror (SCFA). Dessutom användes korrelationsanalys för att utvärdera det funktionella förhållandet mellan förändrad tarmmikrobiota, förändrade neurotransmittorer och neurotrofiner i hippocampus och kolon, och störd koncentration av SCFA. CTE förbättrade signifikant depressionsliknande beteenden hos råttor under CUS. Hjärnnivån av 5-hydroxitryptamin (5-HT) och hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) uttryck i CUS-råttor återställdes med CTE. Den relativa mängden av tarmmikrobiota och koncentrationerna av acetat och hexansyra kan också moduleras genom CTE-behandling. Vi visade vidare att tillämpningen av CTE i CUS-råttor ledde till en stark korrelation mellan störd tarmmikrobiotasammansättning, hippocampus neurotransmittornivåer och produktion av neuroaktiva metabolit SCFAs. Sammantaget identifierar dessa resultat CTE som en potentiell behandling för depressiva symtom genom att återställa homeostas av tarmmikrobiota för störningar i mikrobiota-tarm-hjärnaxeln, vilket öppnar nya vägar inom området neuropsykofarmakologi.

Nyckelord: Cistanche tubulosa, antidepressivt medel, kronisk oförutsägbar stress, tarmmikrobiota, mikrobiota-tarm-hjärnaaxel

För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

INTRODUKTION

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong på kinesiska) är officiellt registrerat som de torkade saftiga stjälkarna avCistanche deserticola(YC Ma) ochCistanche tubulosa(Schrenk) i Chinese Pharmacopoeia Commission (2015). Det är en välkänd traditionell kinesisk medicin (TCM) för behandling av njurbrist, impotens, kvinnlig infertilitet, sjuklig leukorré, riklig metrorragi,

Echinacosidei cistanche kan främjasårläkning

och senil förstoppning (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015). Tidigare studier har avslöjat flera huvudsakliga kemiska beståndsdelar avCistanches Herbainklusive fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider och iridoidglykosider, lignaner, alditoler, oligosackarider och polysackarider. Farmakologisk analys har visat att Cistanches Herba uppvisar ett brett spektrum av neuroprotektiva, immunmodulerande, antiinflammatoriska och leverskyddande aktiviteter (Jiang och Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhG har betraktats som de viktigaste aktiva komponenterna i Cistanches Herba som har olika farmakologiska aktiviteter, såsom neuroprotektiva, immunmodulerande, antiinflammatoriska, leverskyddande, antioxidativa, etc. (Jiang och Tu, 2009; Fu et al., 2017). Cistanches Herba spelades ursprungligen in i örtmedicinens klassiker ("Shennong Bencao Jing" på kinesiska), en välkänd bok om medicinalväxter skriven mellan cirka 200 och 250 e.Kr., som en "hög ört" som kan reglera "fem (inälvor) ) påfrestningar och sju (överätande, ilska, fukt, kyla, oro, vind och regn och rädsla) funktionsnedsättningar" (Huang, 1982). Nuförtiden är Cistanches Herba allmänt accepterad som en växtbaserad tonic för allmän svaghet (Fu et al., 2017).C. tubulosaglykosidkapslar (Memoregain®) används för behandling av Alzheimers sjukdom (Guo et al., 2013). Ett dysfunktionellt dopaminergt system är en av nyckelpatogeneserna för monoaminhypotesen om depression (Duman et al., 1997; Krishnan och Nestler, 2008). Echinakosid (en av PhGs) och PhG från Cistanche salsa har visat sig skydda dopaminerga neuroner mot dopamin (DA) neurotoxicitet inducerad av 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,{ {8}}tetrahydropyridin (MPTP) som kan öka DA-nivåer i striatum hos C57-möss (Tian och Pu, 2005; Geng et al., 2007). Dessutom är catalpol och geniposid två representativa iridoider i Cistanches Herba, och de har visat sig lindra kronisk oförutsägbar stress (CUS)-inducerat depressionsliknande beteende genom att återställa dysfunktioner i hypotalamus-hypofys-binjureaxeln (HPA) och catalpol kan uppreglera hjärnan. härledd neurotrofisk faktor (BDNF) uttryck (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Dessutom ger den senaste publikationen ett nytt bevis på att Cistanches Herba-avkok avsevärt minskade orörlighetsperioden i mussvansupphängningstestet, vilket starkt tyder på att Cistanches Herba har potentiella antidepressiva-liknande egenskaper (WangD. et al., 2017).

Traditionell kinesisk medicin väcker ökad uppmärksamhet som behandling av depression på grund av dess jämförelsevis måttliga biverkningar (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Olika typer av TCM, såsom enskilda föreningar från råläkemedlen (ginsenosid Rb1, ginsenosid Rg3 och Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), enstaka kinesiska medicinska material (Panax ginsengrot, Acorus tatarinowii rhizom och Morinda Officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) och TCM-avkok (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan och Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) har studerats djupt och visats för att vända eller lindra depressionsliknande symtom. Till exempel visade sig Kai-Xin-San markant lindra symtom på CUS-inducerade depressiva råttor genom att öka antalet neurotransmittorer, neurotrofiska faktorer och deras motsvarande receptorer, och främja uttrycket av synaptotagmin och dendritisk ryggradsdensitet (Yan et al. , 2016).

Ändå förlitar sig tidigare studier av TCM på resultat i depressiva beteendetester och fokuserar på den konventionella farmakologiska verkningsmekanismen. Sambandet mellan den antidepressiva effekten av oralt administrerad TCM och tarmmikrobiota är inte väl förstått. Växande bevis stöder att tarmmikrobiota spelar en avgörande roll för att reglera hjärnans funktioner, särskilt depression och andra stressrelaterade störningar (Foster och Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Till exempel resulterar kronisk stress i dysreglering av råtttarmens mikrobiella struktur, med en minskning av Firmicutes/Bacteroidetes-förhållandet, och mer specifikt, minskning av det relativa överflödet av Lactobacillus och ökning av Oscillibacter (Meng et al., 2017). Dessutom gav fekal transplantation av dysreglerad mikrobiota från deprimerade patienter till bakteriefria möss en depressionsliknande fenotyp hos dessa djur, vilket indikerar att dysregulerad tarmmikrobiota orsakar beteendemässiga och fysiologiska symtom på depression och ångest (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). I djurförsök visade sig vissa mikrobiotamodulatorer som probiotika och prebiotika förbättra depressionsliknande beteende hos kroniskt stressade möss genom att förbättra tarmmikrobiotan (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017 ).

Med tanke på sambandet mellan tarmmikrobiota och sjukdomsutveckling, såväl som plasticiteten i tarmmikrobiotans struktur, bestämde vi oss för att undersöka effekterna av tarmmikrobiota för att förmedla depression väckte vår uppmärksamhet och undersöktes (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). För att uppnå detta utfördes 16S rRNA-gensekvensering kombinerad metastatistikanalys (White et al., 2009) för att analysera tarmmikrobiotans sammansättning. I föreliggande studie,C. tubulosavaldes ut för att utvärdera dess antidepressiva-liknande effekter eftersom den har en högre nivå av PhG jämfört medC. deserticola. En CUS-inducerad depressionsmodell från råtta etablerades för att utforska effekten avC. tubulosa extrakt(CTE, bestående av 48,6 procent PhG, 6,9 procent iridoidglykosider och 20,0 procent totala sackarider) på beteendetester, monoamin-neurotransmittorer och neurotrofiska faktorer i hippocampus och kolon, tarmmikrobiotans sammansättning och kortkedjad fettsyra (SCFA) produktion. Dessutom förändrade det funktionella förhållandet mellan förändrad tarmmikrobiota neurotransmittorer och neurotrofiner i både hippocampus och kolon, och störd koncentration av SCFA studerades. Korrelationsanalys användes för att styrka bevis för att CTE riktar sig mot tarmmikrobiota för behandling av depression genom att modulera mikrobiota-tarm-hjärnans axel.

MATERIAL OCH METODER

Material

Fluoxetin (FLX) köptes från Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, Kina). 5-hydroxytryptamin (5-HT), noradrenalin (NE) och BDNF ELISA-kit köptes från Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). Acetonitril av HPLC-kvalitet köptes från Merck (Darmstadt, Tyskland). Avjoniserat vatten framställdes från destillerat vatten med användning av ett Milli-Q vattenreningssystem (Millipore, Bedford, MA, USA). Alla andra reagens och kemikalier som användes var av analytisk kvalitet.

Torkade stjälkar avC. tubulosasamlades in från Hetian County (Xinjiang, Kina). Proverna av kupongexemplaren autentiserades av professor Xiaobo Li och deponerades på herbariet vid School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Den homogena pulveriseradeC. tubulosastjälkarna suspenderades i tiofaldig 70 procent etanol och värmeåterloppskokades tre gånger, vardera i 1 timme vid 100 grader. Extrakten filtrerades med gasväv, indunstades under vakuum vid 65 grader och lyofiliserades. Provet återupplöstes och separerades sedan med makroporöst harts D101. Efter adsorption kastades fraktionen som eluerades med vatten. CTE erhölls efter eluering med 40 procent etanol, indunstades sedan under vakuum vid 65 grader och lyofiliserades.

Analys av kemisk sammansättning av CTE

Det relativa innehållet av PhGs i CTE bestämdes med UV-spektrofotometri vid 330 nm med användning av echinakosid som standard. Det relativa innehållet av iridoider och iridoidglykosider mättes med UV-spektrofotometri med dubbelvåglängdsmetoden för att undvika den spektrala interferensen från PhGs (237 nm användes för spektroskopisk kvantifiering, en isobestisk punkt 280 nm användes för referensvåglängd), geniposid användes som standard. Den totala kolhydrathalten i CTE bestämdes med den fenol-svavelsyrakolorimetriska metoden med glukos som standard (Chow och Landhausser, 2004).

De huvudsakliga kemiska beståndsdelarna i CTE karakteriserades av UPLC-Q-TOF-MS. UPLC-Q-TOF-MS-analys utfördes på ett Waters ACQUITY UPLC-system (Waters Corp., Milford, MA, USA) med en ACQUITY UPLC BEH C18-kolonn (100 mm x 2.1 mm id, 1,7 段m, Waters Corp., USA) genom gradienteluering med användning av 0,1 procent myrsyraacetonitril (A) och 0,1 procent myrsyra i vatten (B) vid en flödeshastighet på 0,4 ml/min. Gradientprofilen var: 0-5 min (A: 5-20 procent ), 5-7,5 min (A: 20-30 procent ), 7,5-10 min ( A: 30-70 procent ), 10-11 min (A: 70-100 procent ), och hålls i 1,5 min. Gradienten återfördes tillbaka till 5 procent på 0,5 minuter och hölls i 2,5 minuter för nästa körning. Injektionsvolymen var 3 [il. Temperaturen på kolonnugnen var inställd på 35 grader.

Masspektrometri utfördes med användning av en Waters Vion IMS-masspektrometer (Waters Corp., Milford, MA, USA). Jonisering utfördes i negativ elektrospray (ESI)-mod. MS-parametrarna var följande: kapillärspänning, 2.0 kV; konspänning, 20 V; källtemperatur, 120 grader ; desolvationstemperatur, 500 grader ; gasflöden av kon och desolvation, 50 respektive 1,000 L/h. För noggrann massmätning användes leucin-enkefalin som låsmassan för att generera en [MH]-jon (m/z 554,2615). Ett MSE-experiment (Mass SpectrometryElevatedEnergy) i två skanningsfunktioner utfördes enligt följande: funktion 1 (lågenergi): m/z 50-1,000, 0,25 s skanningstid, 0,02 s inter-scan fördröjning , 6 eV kollisionsenergi; funktion 2 (hög energi): m/z 50-1,000, 0,25 s skanningstid, 0,02 s inter-scan fördröjning, kollisionsenergiramp på 20-45 eV. Data bearbetades med hjälp av UNIFI 1.8.1 programvara (Waters Corp., Milford, MA, USA).

cistancheburkförbättra njurfunktionen

Djurförsök

Sprague-Dawley-hanråttor (200 x 20 g) anskaffades från Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Beijing, Kina) och inhystes i Laboratory Animal Center vid Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Djuren hölls i grupper under kontrollerad rumstemperatur (25 x 2 grader, 55 x 10 procent relativ fuktighet) med en 12:12 timmars ljus-mörkercykel. Råttorna fick fri tillgång till vanlig laboratorieråttmat och vatten under 1 vecka. Djuranläggningarna och protokollen godkändes av Animal Ethics Committee vid Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina).

Efter 1 veckas acklimatisering utsattes 40 naiva råttor för en period av 72 timmars sackarosträning och sackarosbaslinjetestning. Råttor delades in i fem grupper (n=8) baserat på deras sackarospreferens i sackarosbaslinjetestet (kompletterande figur S1). Kontrollgruppen och CUS-gruppen fick koksaltlösning (10 ml/kg). För de andra tre grupperna, CTE vid hög dos (CTEH) (400 mg/kg), låg dos (CTEL) (200 mg/kg) och FLX (10 mg/kg) administrerades intragastriskt 1 timme före CUS-proceduren (8:00 till 9:00) under loppet av 4 veckor.

Kronisk oförutsägbar stress utvecklades som beskrivits tidigare (Willner, 1997; Xue et al., 2013), förutom för kontrollgruppen utan stress, applicerades en serie stressfaktorer på råttorna: lågintensiv stroboskopisk belysning över natten (120 blixtar/ min), vitt brus (100 dB) i 1 timme, vattenbrist i 24 timmar, tomma vattenflaskor i 1 timme (efter vattenbrist), matbrist i 24 timmar, tvångssim (5 min), fysisk fasthållning ({{11 }} h), smutsad bur i 24 timmar (200 ml vatten i 100 g sågspånsbädd), svansklämning (1 min), 45 graders burlutning i 24 timmar, stöt i 30 minuter och belysning över natten (12 timmar). Stressfaktorer applicerades kontinuerligt och slumpmässigt i 4 veckor, vars detaljer beskrivs i tilläggstabell S1. Mat och vatten var fritt tillgängligt för de icke-stressade kontrollråttorna, som förblev ostörda i ett annat rum, med undantag för 14 timmars avsaknadsperiod före varje sackarostest. En råtta dog under CUS-proceduren. Tvångssimprov (FST) utfördes efter

4 dagars akut administrering och efter 28 dagars stress utfördes sackarospreferenstest (SPT) (dag 29), öppet fälttest (OFT) (dag 31) och nyhetsundertryckt matningstest (NSFT) (dag 33). Konturen av en design för CUS och beteendetester visas i kompletterande figur S2.

Ett tvångssimtest utfördes som beskrivits tidigare (Porsolt et al., 1978). Proceduren bestod av förtest- och testsessioner, med användning av samma apparatur och förhållanden (diameter 20 cm, höjd 45 cm, innehållande 25 cm vatten som hölls vid 26 grader). Under förtestsessionen tvingades råttor att simma i 15 minuter; 24 timmar senare placerades råttor i samma apparat under 5 min simtestsession. Simbeteendet inom

5 min observerades med en videokamera och varaktigheten av orörlighet mättes och analyserades.

För SPT tränades råttor först att konsumera 1 procent (v/v) sackaroslösning i 72 timmar före SPT. Sackarosbaslinjetestet före CUS-proceduren och SPT i slutet av CUS utfördes som beskrivits tidigare (Xue et al., 2013).

Öppet fälttest utfördes i slutet av CUS-proceduren, apparaturen och metoden var desamma som tidigare detaljerat (Xue et al., 2013). Ett videospårningssystem (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) användes för att registrera den totala tillryggalagda sträckan.

Nyhetsundertryckt matningstest bedömdes som tidigare beskrivits (Xue et al., 2013) och latens för att börja äta inom 5 minuter registrerades och analyserades.

Mätning av neurotransmittorer och neurotrofiska faktorer

Efter beteendetester erhölls minst fyra fekala pellets från varje råtta, placerades i sterila koniska rör och frystes omedelbart vid -80°C för analys av mikrobiell gemenskap och SCFA. Därefter offrades råttor; hippocampus och kolon isolerades och vägdes omedelbart. Vävnadsprover tvättades med koksaltlösning, snabbfrystes i flytande kväve och förvarades i -80°C för lagring. Efter sekventiell upptining vid -20OC och 4OC homogeniserades vävnadsproverna i saltlösning och centrifugerades i 25 minuter vid 2500 rpm/4OC. Den resulterande supernatanten uppsamlades och lagrades vid 4°C tills användning. Nivåerna av 5-HT i hippocampus och kolon, NE i hippocampus och BDNF i hippocampus bestämdes med kommersiella ELISA-kit enligt tillverkarens protokoll (Hou et al., 2017).

Sammansättningsprofilanalys av tarmmikrobiota

Det totala DNA från tarmmikrobiota från fekala prover extraherades som tidigare beskrivits (Wei et al., 20{{20}}4). Varje fekalt prov (0,2 g) blandades i 1 ml PBS och homogeniserades fullständigt två gånger, sedan centrifugerades vid 200 g under 6 min. Supernatanten tillsattes med 20 × 20 procent PVP och centrifugerades vid 300 g under 6 min. Den resulterande supernatanten centrifugerades sedan vid 12,000 g under 6 minuter och cellpellets skördades. Cellpellets tvättades med PBS och återsuspenderades sedan i 300 lysat I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA - Na2 - 2H2., pH 8,0). Suspensionen blandades med 100 µl lysozymlösning (100 mg/ml) och 20 µl 1 procent RNas, 37OC varmbadad i 30 minuter, tillsattes sedan 300 µl lysat II (100 mM NaCl, 500 mM Tris-bas, pH 8,0) . Cellsuspensionen blandades försiktigt med 50 × 20 procent SDS, isbadades i 5 min. DNA renades sedan genom sekventiell extraktion med 1 procent PVP, Tris-ekvilibrerad fenol och kloroform-isoamylalkohol (vol/vol/vol/vol, 3,125:25:24:1) och kloroform-isoamylalkohol (vol/vol, 24) :1) följt av utfällning vid -20°C under 2 timmar med två volymer etanol och 50 [il 3 M NaAc. DNA uppsamlades genom centrifugering, lufttorkades och löstes i 100 il sterilt avjoniserat vatten. Nukleinsyrarenheten testades med en NanoDrop 2000c spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Totalt genomiskt DNA utsattes sedan för PCR-amplifiering med användning av primrar som är specifika för V3-V4-regionerna av 16S rRNA-genen: forward primer 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') och den omvända primern 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). PCR-amplikoner renades med Agencourt AMPure-kulor (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) och kvantifierades med användning av PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Efter det individuella kvantifieringssteget slogs amplikoner samman i lika stora mängder, och parslut 2 x 300 bp sekvensering utfördes med hjälp av Illumina MiSeq-plattformen med MiSeq Reagent Kit v3 vid Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Kina). Avläsningar av parade ändar sammanställdes med FLASH-programvara (version 1.2.7), råsekvensavläsningar kvalitetstrimmades med hjälp av QIIME-programvaran (version 1.8.0) för att ta bort streckkoder som inte matchade och sekvenser under längdtröskelvärden. Efteråt klustrades de filtrerade sekvenserna i operationella taxonomiska enheter (OTU) med ett tröskelvärde på 97 procent sekvenslikhet med QIIME med UCLUST. Beta-diversitet utfördes på QIIME för viktad UniFrac principal koordinatanalys (PCoA). Slutligen användes Meta stats-mjukvara för att jämföra skillnaderna i tarmmikrobiella taxonomiska sammansättning mellan olika grupper.

SCFAs koncentrationsanalys

Koncentrationen av SCFA (inklusive acetat, propionat, butyrat, isobutyrat, valerianasyra, isovalerinsyra och hexansyra) i avföringsprover från råtta bestämdes med GC{{0}}-gaskromatograf (Shimadzu, Japan), monterad med en DB-FFAP-kolumn (30 mx 0,25 mm x {{10}},25 cm, Agilent, USA). Standardlösningar av acetat, propionat, butyrat, isobutyrat, valeriansyra, isovalerinsyra och hexansyra framställdes vid 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0,01 respektive 0,005 mg/ml med eter (inklusive 2- metylvalerianasyra 0,1 mg/ml som intern standard). Varje fekalt prov (0,2 g) blandades i 0,8 ml avjoniserat vatten genom att vortexa och centrifugera vid 5,000 rpm i 20 minuter vid 4OC, 450 il supernatant tillsattes med 50 il 50 procent H2SO4 och 500 il intern standard lösning, vortexa i 1 min och centrifugerades vid 12, 000 rpm i 10 min, sedan placerades blandningen i 4°C i 30 min. Supernatanten togs för GC-analys. Analysen av SCFAs utfördes som tidigare beskrivits (Wang et al., 2016).

Statistisk analys

Alla data presenterades som medelvärden 土 SEM. Statistisk analys utfördes med programvaran SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) med en enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts test eller Students t-test. Data exkluderades från analyser om mer än två standardavvikelser från medelvärdet. Värden på p < 0.05="" ansågs="" vara="" statistiskt="" signifikanta.="" pearsons="" korrelationsanalys="" användes="" för="" att="" utvärdera="" sambandet="" mellan="" den="" relativa="" mängden="" av="" tarmmikrobiota,="" scfa,="" hippocampus="" 5-ht,="" ne="" och="" bdnf-nivåer="" och="" kolon="">

RESULTAT

Analys av kemisk sammansättning av CTE

Den kemiska sammansättningen av CTE analyserades först heltäckande. Som visas i tabell 1 var PhG huvudkomponenten i CTE, med en relativ halt på 48,6 procent, iridoider och iridoidglykosider var 6,9 procent och totala sackarider var 20,0 procent. Dessa

komponenter i CTE karakteriserades sedan med användning av UPLC-Q-TOF-MS. Totalt 27 beståndsdelar upptäcktes och identifierades, inklusive 20 beståndsdelar av PhG, fem iridoider och iridoidglykosider och två oligosackarider. Detaljerad information inklusive retentionstid, exakt MS och MS/MS-fragmentjoner listas i stödjande information (kompletterande tabell S2). UPLC-Q-TOF-MS totaljonkromatogram (TIC) av CTE visas i tilläggsfigur S3.

CTE förbättrade depressiva beteenden hos CUS-råttor

Hos CUS-råttor minskade den totala orörlighetstiden i FST och latensen att äta i NSFT signifikant genom CTE-behandling, och sackarospreferensen i SPT och det totala avståndet tillryggalagt i OFT ökade.

Figur 1A illustrerar de akuta effekterna av CTE på orörlighetstid i FST hos CUS-råttor. Jämfört med CUS-modellgruppen minskade 3- dagars akut oral administrering av CTE signifikant den totala orörlighetstiden i FST [envägs ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Ytterligare posthoc analys visade att administrationen

TABELL 1|kemisk sammansättning avC. tubulosaextrakt.av CTE med högdosgrupp (Dunnetts test, p < {{0}}.05) och lågdosgrupp (Dunnetts test,p < 0.05) visade en markant minskning av den totala orörlighetstiden i FST .

Effekterna av CTE på sackarospreferens i SPT hos CUS-råttor visas i figur IB. Tjugoåtta dagars stressprocedur orsakade en signifikant minskning av sackarospreferensen i CUS-modellgruppen jämfört med kontrollråttorna utan stress [envägs ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Dunnetts test, p < 0,05],="" vilket="" indikerar="" att="" cus-modellen="" utvecklades="" framgångsrikt.="" som="" positiv="" kontroll="" ökade="" flx-gruppen="" signifikant="" sackarospreferensen="" hos="" cus-råttor="" [envägs="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,05],="" som="" visar="" den="" prediktiva="" validiteten="" av="" cus-modellen.="" kronisk="" oral="" administrering="" av="" cte="" i="" högdosgrupp="" visade="" nyckeleffekter="" på="" sackarospreferens="" [envägs="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,01],="" som="" återställde="" det="" till="" normala="" nivåer="" hos="" cus-råttor.="" cte="" med="" lågdosgruppen="" visade="" en="" ökande="" trend="" men="" effekten="" var="" inte="" statistiskt="" signifikant="" (dunnetts="" test,="" s="">

Som visas i figur 1C användes det totala avståndet i OFT också för att utvärdera effekterna av CTE på CUS-råttor. Jämfört med icke-stressråttor uppvisade CUS-modellgruppen ett mycket kortare totalt avstånd [envägs ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; Dunnetts test, p < 0.001]="" efter="" en="" 4-veckas="" exponering="" för="" cus="" och="" den="" positiva="" flx-behandlingen="" ökade="" det="" totala="" avståndet="" hos="" cus-råttor="" [envägs="" anova,="" f(4,34)="7.845," s="0.0001;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,05].="" daglig="" oral="" administrering="" av="" cte="" med="" hög="" dos="" och="" låg="" dos="" visade="" en="" tydlig="" effekt="" på="" det="" totala="" avståndet="" hos="" cus-råttor="" [envägs="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnetts="" test,="" p="">< 0,01="" för="" högdosgrupp="" respektive="" p="">< 0,001="" för="" lågdosgrupp].="" tilläggsbild="" s4="" visar="" aktivitetsspårkartan="" i="">

Figur 1D visar effekterna av CTE på latens att äta i NSFT hos CUS-råttor. Tjugoåtta dagars stressprocedur orsakade en signifikant ökning av latens för att börja äta i CUS-modellgruppen jämfört med kontrollråttorna utan stress [envägs ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; Dunnetts test, p < 0,05],="" vilket="" indikerar="" att="" cus-modellen="" utvecklades="" framgångsrikt.="" långvarig="" oral="" administrering="" av="" cte="" med="" en="" hög="" dos="" visade="" tydliga="" effekter="" på="" latensen="" för="" att="" börja="" äta="" jämfört="" med="" cus-gruppen="" (studentens="" t-test,="" t="2.759," p="">< 0,05),="" medan="" en="" låg="" dos="" av="" cte="" visade="" ingen="">

CTE återställde nivån av neurotransmittorer och neurotrofiska faktorer i CUS-råttor

Effekterna av CTE på {{{{10}}}}}HT- och NE-nivåer i hippocampus hos CUS-råttor visas i figurerna 2A,B. Fyra veckors stressprocedur orsakade en signifikant minskning av 5-HT [envägs ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0{{39 }}01; Dunnetts test, p < 0.001]="" och="" ne="" [envägs="" anova,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,001]="" koncentration="" i="" hippocampus="" hos="" cus-råttor="" jämfört="" med="" den="" i="" kontrollgruppen,="" och="" det="" antidepressiva="" medlet="" flx="" återställde="" signifikant="" 5-ht-nivåerna="" i="" hippocampus="" [envägs="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" s="0.0001;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,001].="" efter="" oral="" administrering="" av="" cte="" i="" högdosgrupp="" observerades="" signifikant="" ökning="" av="" 5-ht-nivån="" [envägs="" anova,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" dunnetts="" test,="" p="">< 0,001]="" medan="" ne-koncentrationerna="" inte="" ändrades.="" på="" liknande="" sätt="" reducerades="" bdnf-uttryck="" signifikant="" i="" cus-modellgruppen="" jämfört="" med="" de="" icke-stressade="" råttorna="" (studentens="" t-test,="" t="4.171," p="">< 0,01)="" (figur="" 2c).="" både="" långvarig="" oral="" administrering="" av="" cte="" med="" hög="" dos="" (elevens="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" och="" flx="" (elevens="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0.05="" )="" ökade="" bdnf-uttryck="" jämfört="" med="" cus-modellgrupp.="" cte="" med="" låg="" dos="" visade="" ingen="" signifikant="" effekt="" på="">

{{0}}HT-nivån i tjocktarmen hos CUS-råttor skilde sig från den i hippocampus, och 4-veckans stressprocedur hade ingen inverkan på kolon 5-HT (Figur 2D ). Omvänt stimulerade oral administrering av CTE med hög dos 5-HT-nivåer i tjocktarmen jämfört med CUS-modellgruppen (Studentens t-test, t=2.173, p < 0,05).="" cte="" med="" låg="" dos="" visade="" ingen="" effekt="" på="" kolon="">

CTE reglerade tarmens mikrobiella sammansättning av CUS-råttor

Effekten av CTE på den tarmmikrobiella sammansättningen av CUS-råttor utvärderades med den 16S rRNA-gensekvenseringsbaserade metoden. Det visade sig att 28 dagars oral administrering av CTE förändrade tarmmikrobiella sammansättningen hos CUS-råttor och påverkade olika

mikrobiella taxonomiska nivåer bland råttgrupper (klassnivå 1, ordningsnivå 1, familjenivå 1, släktnivå 8 och artnivå 2). Detta tyder på att det mikrobiella samhället i tarmen kan spela en roll i de antidepressiva effekterna av CTE. Detaljerad information om signifikant förändrade tarmmikrobiella taxa på olika taxonomiska nivåer visas i tabell 2.

MiSeq-sekvenseringen gav totalt 2 132 980 obearbetade läsningar, efter kvalitetskontroll, avbrutning och borttagning av chimärer. Därefter grupperades läsningarna i OTU:er, som tilldelades taxa från filum till artnivå. Studien av beta-diversitetsanalys utfördes för att utforska likheten mellan bakteriella gemenskapsmönster bland de fem råttgrupperna. PCoA baserat på viktade UniFrac-avstånd av tarmmikrobiota från de fem råttgrupperna i studien visas i figur 3A. Beta-diversitetsanalys av PCoA visade en tydlig separation av det mikrobiella samhället från kontrollgruppen och CUS-modellgruppen, medan CTE med högdosgruppen trendade att vara närmare kontrollgruppen jämfört med CUS-gruppen.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 procent. Som visas i tilläggsfigurerna S5A, B, orsakade 4 veckors stressprocedur en icke-signifikant trend mot en ökad nivå av Firmicutes och en icke-signifikant minskning av Bacteroidetes i CUS-modellgruppen jämfört med kontrollgruppen. Efter daglig administrering av CTE med hög dos och låg dos återgick den relativa mängden Firmicutes och Bacteroidetes till liknande nivåer i kontrollgruppen, dock utan statistisk signifikans. Och även om liknande förändringar observerades för Firmicutes/Bacteroidetes-förhållandet bland råttgrupperna, visades inga statistiska skillnader (kompletterande figur S5C). En icke-signifikant trend mot en minskad nivå av phyla Cyanobacteria hittades i CUS-modellgruppen jämfört med kontrollråttorna utan stress; medan administrering av CTE med en hög dos resulterade i en signifikant ökning av den relativa förekomsten av cyanobakterier jämfört med CUS-gruppen (kompletterande figur S5D).

På släktnivå var Bacteroides och Ruminococcus två av de mest förekommande mikrobiella taxa som stod för ungefär 30 procent relativ förekomst i alla fem råttgrupper. Fyra veckors stressprocedur orsakade en signifikant minskning av den relativa förekomsten av Bacteroides och en signifikant ökning av Ruminococcus i CUS-modellgruppen jämfört med kontrollråttorna utan stress (Figur 4A, B). Långtidsadministrering av CTE resulterade i en signifikant ökning av förekomsten av Bacteroides såväl som en signifikant minskning av Ruminococcus jämfört med CUS-råttorna. Dessutom visade sex släkten av Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus och Brachybacterium statistiskt signifikanta skillnader mellan CUS-modellgruppen och kontrollgruppen (figur 4C-H). Efter 28 dagars behandling av CTE ändrades den relativa förekomsten av de ovan nämnda sex släktena till nivåer liknande kontrollgruppen.

Låg förekomst av Deinococcus i olika taxonomiska nivåer inklusive klassnivå (Deinococci), ordningsnivå (Deinococcales), familjenivå (Deinococcaceae) och släktnivå (Deinococcus) upptäcktes i CUS-råttgruppen, medan den inte kunde detekteras i kontrollen gruppen och administrationsgrupperna (figurerna 5A-D).

På artnivå var Weissella beninensis mycket lägre i CUS-gruppen än i kontrollgruppen, och en signifikant ökning av relativ förekomst observerades efter administrering av CTE med en hög dos (Figur 5E). Omvänt vände CTE-administration den signifikanta ökningen i den relativa mängden Brachybacterium-konglomerat som observerades i CUS-råttorna (Figur 5F).

CTE-modulerade SCFAs i CUS-råttor

SCFA-koncentrationerna (inklusive acetat, propionat, butyrat, isobutyrat, valeriansyra, isovalerinsyra och hexansyra) i fekala prover från råtta analyserades med GC och visas i figur 6. Nivåerna av acetat [envägs ANOVA, F( 4,32)=2.721, s=0.0467; Dunnetts test, p < 0.05]="" och="" hexansyra="" [envägs="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" dunnetts="" test,="" p="">< 0,05]="" ökade="" signifikant="" i="" cus-modellgruppens="" råttor="" jämfört="" med="" kontrollgruppen.="" efter="" långvarig="" administrering="" av="" cte="" med="" hög="" dos,="" acetat="" (students="" t-test,="" t="2.182," p="">< 0,05)="" och="" hexansyra="" [envägs="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" s="0.0328;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,05]="" koncentrationer="" minskade="" övervägande="" jämfört="" med="" cus-gruppen,="" vilket="" tyder="" på="" att="" cte="" kan="" utöva="" sin="" antidepressiva="" aktivitet="" genom="" att="" modulera="" den="" störda="" neuroaktiva="" metaboliten="" scfa.="" administrering="" av="" cte="" med="" lågdosgrupp="" visade="" en="" minskande="" trend="" men="" ingen="" anmärkningsvärd="" effekt="" på="" acetat-="" och="">

Korrelationsanalys av tarmmikrobiotan, neurotransmittorer och neurotrofiner i Hippocampus, 5-HT i kolon och SCFAs

För att utforska det funktionella förhållandet mellan förändrad tarmmikrobiota på släktnivå, förändrade neurotransmittorer och neurotrofiner i hippocampus och kolon, och den störande koncentrationen av SCFA, utvecklades Pearsons korrelationskoefficienter (Meng et al., 2017). Korrelationer mellan dem (r > 0.4 eller r < -0.4,="" p="">< 0.05)="" visas="" i="" figur="" 7.="" koefficienterna="" indikerade="" starka="" korrelationer="" mellan="" förändrad="" tarmmikrobiotasammansättning="" i="" släktets="" nivå,="" koncentrationen="" av="" sju="" typer="" av="" scfa="" och="" depressionsrelaterade="" monoaminneurotransmittorer="" (5-ht="" och="" ne).="" förekomsten="" av="" ruminococcus="" visade="" en="" signifikant="" negativ="" korrelation="" med="" en="" 5-ht-koncentration="" i="" hippocampus,="" vilket="" innebär="" att="" cus-proceduren="" leder="" till="" en="" ökning="" av="" den="" relativa="" förekomsten="" av="" ruminococcus="" och="" en="" minskning="" av="" 5-ht-koncentrationer.="" efter="" behandling="" med="" cte="" reducerades="" den="" relativa="" förekomsten="" av="" ruminococcus="" till="" nivån="" för="" kontrollgruppen,="" och="" 5-ht-nivåerna="" visade="" sig="" ha="" förbättrats.="" vidare="" var="" den="" relativa="" förekomsten="" av="" bacteroides="" positivt="" korrelerad="" med="" en="" 5-ht-nivå="">

hippocampus och negativt associerad med koncentrationen av butyrat, isobutyrat, valeriansyra, isovalerinsyra och hexansyra; förekomsten av Parabacteroides visade en signifikant positiv korrelation med en 5-HT-nivå i hippocampus och propionatkoncentration, medan den visade en negativ korrelation med isobutyrat- och isovalerinsyrakoncentrationer; ett signifikant positivt samband mellan den relativa förekomsten av Butyricimonas och NE-nivån i hippocampus observerades också, och den relativa förekomsten av Deinococcus var positivt korrelerad med acetatkoncentrationen. Detta visade att CTE kan utöva sin antidepressiva aktivitet genom att förändra sammansättningen av tarmmikrobiotan, störa nivåerna av neurotransmittorer i hippocampus och återställa neuroaktiva metaboliter SCFAs. Detaljerade data för korrelationsanalys visas i tilläggstabell S3.

cistanchekan behandladiabetes

DISKUSSION

Identifiering av antidepressionsaktivitet hos CTE och dess kliniska fördelar

Denna studie utvärderade den antidepressiva aktiviteten av CTE hos CUS-råttor, bekräftade effektiviteten av in vivo-modeller som FST, SPT, OFT och NSFT, och bekräftade den antidepressiva aktiviteten avC. tubulosai CUS-råttor som ofta används för behandling av njurbrist, impotens och kvinnlig infertilitet vid TCM. För närvarande är de vanligaste förskrivna antidepressiva medlen serotonin- och noradrenalinåterupptagshämmaren (SNRI) venlafaxin, följt av den selektiva serotoninåterupptagshämmaren (SSRI) FLX (Thase et al., 2001; Mcintyre, 2017). Dessa antidepressiva medel har dock visat sig ha allvarliga biverkningar inklusive hjärttoxicitet, blodtryck, sexuell dysfunktion och sömnstörningar (Ferguson, 2001; Jin et al., 2015). Bland alla klasser av antidepressiva läkemedel är SSRI och SNRI korrelerade med den högsta förekomsten av sexuell dysfunktion (Montejogonzalez et al., 1997; Clayton et al., 2014). Särskilt anmärkningsvärt är den totala förekomsten av sexuell dysfunktion, som ligger på 59,1 procent (604/1 022) när alla antidepressiva medel betraktas som en helhet; och cirka 40 procent av patienterna uppvisar låg tolerans mot sexuell dysfunktion, så läkemedelsefterlevnaden påverkas allvarligt (Clayton, 2001). Med tanke på nackdelarna med nuvarande depressionsbehandling visar Cistanches Herba stor potential för klinisk tillämpning, inte bara på grund av dess potenta antidepressiva liknande aktivitet utan också för attCistanches Herbahar traditionellt använts för att behandla impotens, vilket åtminstone borde eliminera en oro för de vanligaste biverkningarna som orsakas av andra antidepressiva medel (Fu et al., 2017). Dessutom visar Cistanches Herba inga tecken på toxicitet och behandlingsrelaterade förändringar