Del 1 Cistanches lindrar Sevofluran-inducerad kognitiv dysfunktion genom att reglera PPAR- -beroende antioxidant och antiinflammatorisk hos råttor

Mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

Abstrakt

Denna studie syftade till att undersöka de skyddande effekterna och underliggande mekanismerna förcistanchepå den sevofluraninducerade råttmodellen för åldrad kognitiv dysfunktion. Åldrade (24 månader) SD-hanråttor tilldelades slumpmässigt i fyra grupper: kontrollgrupp, sevoflurangrupp, kontroll plus cistanche och sevofluran pluscistanchegrupp. Därefter mättes inflammatoriska cytokinnivåer med ELISA, och den kognitiva dysfunktionen hos råttor utvärderades med vattenlabyrinttest, öppet fälttest och rädslakonditioneringstest. Tre dagar efter anestesi dödades råttorna och hippocampus skördades för analys av relativa biomolekyler. Den oxidativa stressnivån indikerades som nitrit- och MDA-koncentration, tillsammans med SOD- och CAT-aktiviteten. Slutligen användes en PPAR-antagonist för att utforska mekanismen förcistanchein vivo. Resultaten visade att efter inhalation av sevofluranet utvecklade 24- men inte 3-månadsgamla SD-hanråttor uppenbara kognitiva försämringar i beteendetestet 3 dagar efter anestesin. Intraperitoneal injektion avcistanchevid dosen 50 mg/kg under 3 dagar i följd före anestesi lindrade den sevofluraninducerade förhöjningen av neuroinflammationsnivåer och försvagade signifikant den hippocampusberoende minnesförsämringen hos 24-månadersgamla råttor.Cistancheminskade också oxidativ stress genom att minska nitrit och MDA samtidigt som SOD- och CAT-aktiviteten ökade. Dessutom hämmade sådan behandling också aktiveringen av mikroglia. Dessutom visade vi att PPAR-hämning omvänt lindradecistanche-inducerad skyddande effekt. Sammantaget visade vi att cistanche kan utöva antioxidant, antiinflammatorisk, anti-apoptos och antiaktivering av mikroglia effekter på utvecklingen av sevofluraninducerad kognitiv dysfunktion genom att aktivera PPAR-signalering.

NYCKELORD

cistanche, postoperativ kognitiv dysfunktion (POCD), PPAR-, sevofluran

Cistanchekosttillskott ökar immuniteten

1|INTRODUKTION

Postoperativ kognitiv dysfunktion (POCD) är en förödande komplikation med långvariga konsekvenser och definieras som försämring av minne, uppmärksamhet, koncentration och informationshantering som inträffar efter operation och anestesi. Forskning har visat att cirka 10 procent av kirurgiska patienter och nästan 40 procent av äldre patienter vid 65 års ålder och ännu äldre kommer att uppleva POCD.1 Patienter med POCD visar påfallande högre dödlighet, minskad livskvalitet och ökat beroende av social trygghet jämfört med de utan POCD.2,3 Även om många forskningsinsatser har gjorts under de senaste decennierna, är patogenesen av POCD fortfarande i stort sett okänd.

Det är välkänt att neuroinflammation och oxidativ stress i hjärnan spelar en avgörande roll i initieringen och utvecklingen av POCD.4,5 Även om operationsinducerad inflammation eller oxidativ stress kan orsaka neuroinflammation och skada i hjärnan och i slutändan bidra till den kognitiva störningen , tyder nyare rapporter på att anestesimedel som används under operationen också kan utlösa kognitiv funktionsnedsättning.3,6,7

Sevofluran används ofta i klinisk anestesi för patienter i alla åldrar på grund av dess låga blodgasfördelningskoefficient och låga metaboliska nedbrytning.8 Flera bevis har dock visat att sevofluran kan leda till neuroinflammation och försämra kognitiv funktion. Till exempel rapporterade Makaryus att sevofluran har neurotoxiska effekter på utvecklingen av hjärnan.9 Minskad anslutning mellan excitatoriska neuroner i den prefrontala cortex har visat sig vara korrelerad med kognitiva försämringar inducerade av sevofluran.10 Homoplastiskt underlättar sevofluran kognitiv försämring genom att förvärra mikroglia. -reglerad neuroinflammation i en råttmodell via nedreglerande PPAR-aktivitet i hippocampus.1 När den kirurgiska metoden väl är bestämd kan graden av trauma och inflammatorisk respons inte ändras. Därför kan en minskning av kognitiv funktionsnedsättning ur anestesiperspektiv bli ett genomförbart tillvägagångssätt. Decistanchearter ('Rou Cong Rong' på kinesiska) har använts som tonic i Kina i många år. Moderna farmakologiska studier har visat att cistancher har breda medicinska funktioner, särskilt på det centrala nervsystemet (CNS), inklusive anti-apoptos, antioxidation, anti-aging, anti-trötthet, immunmodulerande antiinflammatorisk och neuroprotection.{{5 }} Deng et al fann att echinacosiden, en av de viktigaste aktiva föreningarna i cistanche, uppvisade skyddande effekter på TNF- -inducerad SH-SY5Y-cellapoptos.14 Fenyletanoidglykosider, en annan viktig aktiv förening av cistanche, som gav rikligt fenolisk hydroxyl, kan tjäna som vätedonator till reduktiva radikaler och på så sätt fånga upp dem. Det finns två huvudflöden genom vilkacistancherrensa de fria radikalerna, nämligen direkt involverade i avlägsnandet av fria radikaler eller blockerar deras produktion och reglerar antioxidantenzymer relaterade till fria radikalers metabolism in vivo, såsom SOD, CAT och GPX.15 Cistanches-administration bidrar till att bromsa åldrandet fenotyper och lindra kognitiv försämring hos flugor genom att minska oxidativ stress.16 Till exempel undersökte Zhang et al en av cistanchextraktionerna och bekräftade dess funktion att förlänga livslängden.17 Hittills har dock ingen studie undersökt effekterna av cistancher på kognitiva dysfunktion i antingen djurmodeller eller människor under sevofluranförhållanden.

Baserat på ovanstående resultat föreslog vi detcistancherkan dämpa kognitiv försämring inducerad av sevofluran. För att verifiera denna hypotes använde vi 24-månadsgamla SD-råttor för att få en modell för kognitiv funktionsnedsättning genom att inhalera sevofluran. Därefter undersökte vi den farmakologiska funktionen avcistancherextrakt på antiinflammatorisk, antioxidation och neuroprotection. Och mekanismen för cistancher på kognitiv försämring inducerad av sevofluran undersöktes också.

2|MATERIAL OCH METODER

2.1|Beredning av Cistanches Herba-extrakt och standardisering

Utvinningen avcistanchervar enligt tidigare verk.18,19 Kortfattat,CistancherHerba-extrakt extraherades med 95 procent etanol i vatten och lyofiliserades till pulvret. Extraktet med 10 mg/ml applicerades på kvantitativ kemisk analys av echinakosid genom omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Standardföreningen, echinacoside, erhölls från Haoxuanbio (Xi'an, Shaanxi, Kina).

2.2|Råttmodell av sevofluran-inducerad kognitiv dysfunktion och behandling med cistanche

Sprague Dawley (SD) hanråttor i åldern 3 och 24 månader köptes från Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Råttor föds upp i rena akrylburar med fri tillgång till vatten och mat under en 12-timmes ljus /mörk cykel vid en konstant temperatur på 21 grad ± 1 grad och luftfuktighet (45 procent -65 procent) i 1 vecka före experimentet för boende. Djurförsöksförfarandena godkändes av Animal Care Committee vid Seventh People's Hospital vid Shanghai University of TCM. Alla beteendetester utfördes i ett temperatur- (21 grad ± 1 grad)- och luftfuktighetskontrollerat rum (45 procent -65 procent).

I den första uppsättningen experiment in vivo användes 3- och 24-månadsgamla SD-hanråttor. Sexton 3-månader gamla råttor som vägde 200- 250 g och sexton 24-månader gamla råttor som vägde 240-300 g tilldelades slumpmässigt indraft-sevofluran (Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. , Lianyungang, Kina) eller bärgas (n=8 för varje grupp). Djur i anestesigrupperna (SEVO) utsattes för 2,6 procent av koncentrationen av sevofluran levererat av en fuktad 30 procent O2-bärargas under 4 timmar vid en flödeshastighet av 2 L/min med användning av en anestesiapparat med en multigasmonitor (Prisma) SP Alpa, Oxon, Storbritannien). Råttor i kontrollgruppen utsattes för bärargasen utan sevofluran under samma tid.

i 4 timmar (n=8 för varje grupp). Beteendetesterna utfördes på dag 1 och dag 3 efter anestesi. Sedan dödades djuren omedelbart efter beteendebedömning på dag 3, och hippocampus i hjärnan användes för molekylära analyser. I den tredje uppsättningen experiment delades alla sövda råttor slumpmässigt in i fyra grupper (n=8 för varje grupp): (a) SEVO-grupp; (b) SEVO plus GW9662 (en antagonist av PPAR-, 30 ng varje gång) grupp;

(c) SEVO pluscistanchegrupp; och (d) SEVO pluscistancheplus GW9662 grupp. De efterföljande experimenten liknade beskrivningen i den andra uppsättningen experiment.

2.3|Beteendetestning

Morris Water Maze Test utfördes som beskrivits tidigare med liten modifiering för att utvärdera det rumsliga minnet och inlärningsförmågan hos råttor i föreliggande studie.8,20 En tank fylldes till ett djup av 40 cm med vatten och gjordes ogenomskinlig genom att lägga till giftfri vit temperafärg. Vattentemperaturen hölls vid 22 ± 1 grad för att förhindra att musen flyter. En cirkulär utrymningsplattform (11 cm radie) placerades 0,5-1 cm under vattenytan i en av fyra kvadranter. Vid tre tidpunkter testades råttor för referensminne efter träning i 5 dagar och varje träningsprovsektion bestod av fyra försök med ett intervall på 15 minuter. Vid den andra och tredje tidpunkten togs plattformen bort från poolen, varefter rums- och arbetsminnesmätning utfördes. Den tid varje råtta tillbringade med att leta efter plattformen registrerades som flyktlatensen. Efter försök sattes råttor i uppvärmda burar innan de återvände till sin bur.

Öppetfältstestet utfördes på dag 1 och dag 3 efter anestesi enligt beskrivning av Fricano et al21. Kortfattat testades råttor i en 27,5 cm × 27,5 cm kvadratisk arena. Mitten, 66 procent av arenan, fick titeln "centrum". Tiden tillbringad i centret registrerades som parameter för att utvärdera det anxiolytiska beteendet.

Rädslakonditioneringstestet utfördes som beskrivits tidigare med liten modifiering för att utforska det rumsliga minnet och inlärningsförmågan hos råttor i föreliggande studie.22,23 Träningen utfördes en dag efter anestesi. Varje råtta fick anpassa sig till kammaren i 12 0 s, följt av exponering för en ljudstimulus (20 s, 80 dB) och sedan en elektrisk fotchock (2 s, 0,75 mA) 25 s efter ljudet stimulansen tog slut. Exponeringarna upprepades två gånger, med 60-s intervall mellan den andra och tredje exponeringen. Kontexttestet utfördes den andra och tredje dagen efter operationen. Varje mus placerades i samma kammare som användes för träning, följt av ingen stimulans och ingen fotchock under samma intervall som användes för att träna djuret. Resultaten registrerades och procentandelen frystid (ej rörlig) samlades in.

2.4|Vävnadssamling

Efter beteendeanalys på dag 3 efter anestesi dödades de experimentella råttorna; sedan avlägsnades hjärnvävnaderna omedelbart och hippocampus dissekerades försiktigt. För analys av proteiner, RNA och cytokiner frystes hippocampus i flytande kväve omedelbart och lagrades vid -80 grader. För immunhistokemisk analys fixerades vävnader med 4 procent paraformaldehyd under 72 timmar och överfördes sedan till 20 procent sackaros i ytterligare 72 timmar.

2,5|Enzymkopplad immunosorbentanalys

Alla råttor dödades efter beteendetestet på dag 3. Hippocampus vävnader dissekerades på is omedelbart och homogeniserades i saltlösning med ultraljud. Sedan utfördes centrifugering vid 10 000 x g vid 4 grader under 15 minuter. Nivåer av IL-1, TNF- och IL-6 bestämdes med enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA)-kit (eBioscience, San Diego, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Detektionsgränserna var 8.0 pg/mL för IL{{10}}, 8.0 pg/mL för TNF- och 4.0 pg/ml för IL{{16} }. Plasmakoncentrationer av IL-1, TNF- och IL-6 på dag 1 och dag 3 mättes också med en ELISA.

2.6|Bestämning av nitrit/nitrat och oxidativ skada på lipider och proteiner

Nitrit/nitrat (NO2−)-koncentrationen i den uppsamlade supernatanten mättes med Griess-reaktionen (Sigma, St. Louis, MO, USA), som visades som en indikator på produktionen av kväveoxid (NO). Kortfattat sattes 100 μL Griess-reagens till 100 μL av supernatanten. Den totala proteinhalten i supernatanten mättes med ett BCA-proteinanalysreagenskit (KeyGEN, Kina) efter inkubation vid rumstemperatur under en timme, och absorbansen mättes med användning av en spektrofotometer vid 550 nm. Resultaten är nmol NO − per mg protein.

Nivån av malondialdehyd (MDA) i hippocampus bestämdes av MDA-analyskitet (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina) efter insamling via homogenat och centrifugering. Den oxidativa skadan på lipider bestämdes genom analysen av tiobarbitursyrareaktiva substanser (TBARS). Kortfattat fälldes supernatantproverna ut med 10 procent triklorättiksyra. Därefter tillsattes tiobarbitursyra (0,67 procent) och absorbansen testades vid 535 nm. 1,1,3,3-tetrametoxipropanen som en extern standard och data uttrycktes som nmol malondialdehydekvivalenter per mg protein.

2.7|Detektion av antioxidant enzymaktivitet

För mätning av superoxiddismutas-aktivitet (SOD) tillsattes 1{{10}} μL supernatanter erhållna genom vävnadshomogenisering och centrifugering (10 000 × g, 15 minuter) vid 4 grader till 2 00 μL reaktionslösning (50 μL tetrazolium plus 19,95 mL analysbuffert, inklusive 50 mM Tris-HCl, 0,1 mmol/L hypoxantiner och 0,1 mmol/L dietylentriaminperättiksyra, pH 8,0). Sedan sattes 20 μL xantinoxid till blandningarna för att initiera reaktionen. Efter skakning och inkubering i 20 minuter registrerades absorbansförändringar vid 450 nm med användning av en spektrofotometer. SOD-aktiviteterna beräknades med användning av formeln som levererades med detekteringssatsen (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).

CAT-aktiviteten i hippocampusvävnadssupernatanten bestämdes spektrofotometriskt genom att beräkna nedbrytningshastigheten för väteperoxid (H2O2) vid 24 0 nm. Kortfattat sattes en alikvot av 100 μL av supernatanten (20 μL) till substratblandningen (1000 μL) innehållande 0,3 ml H2O2 i 50 mL 0,05 mol/L PBS (pH) 7,0). Absorbanser registrerades 1 minut efter initieringen av reaktionen. Resultaten beräknades med hjälp av externa standarder och uttrycktes som U per mg protein.

2.8|RNA-isolering och kvantitativ PCR

Hippocampus vävnader homogeniserades för att erhålla totala RNA med hjälp av TRIzol (Invitrogen), och sedan implementerades transkriptamplifiering med hjälp av iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Det resulterande cDNA:t amplifierades med qPCR med iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) med genspecifika primerprimers, och det relativa uttrycket av varje gen beräknades med hjälp av 2−ΔΔCt-metoden och normaliserades till GAPDH-kontroll. Primersekvenserna presenteras i tabell S1.

2.9|Western blot

Hippocampus vävnader homogeniserades i cellysbuffert (50 mmol/L Tris, pH 7,5, 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0,5 procent Triton X-100 , 0,5 procent NP-40, 1 mmol/L fenylmetylsulfonylfluorid, 5 mmol/L natriumvanadat, 1 mmol/L natriumfluorid, 1 ug/ml aprotinin, pepstatin och leupeptin). Proteiner separerades med SDS-PAGE-geler och sedan överfördes proteiner i gelerna till PVDF-membran (Millipore). Membranen blockerades med 5 procent mjölk och inkuberades sedan med specifika primära antikroppar, inklusive anti- -APP (ab76763, 1:1000 spädning), anti-BDNF (ab108319, 1:1000 spädning), anti-GFAP (ab68428 , 1:1000 spädning), anti-Iba-1 (ab178847, 1:1000 spädning), anti-PPAR- (ab209350, 1:1000 spädning), anti-NF-KB (ab32360, 1:1000 spädning) och anti-GAPDH (ab181602, 1:1000 spädning). Därefter användes TBST för att tvätta membranen och inkuberades sedan med HRP-konjugerade sekundära antikroppar (Santa Cruz, CA, USA). Slutligen observerades det relevanta proteinet av ECL-systemet (PerkinElmer) i ljuset av tillverkarens förklaring. Och ImageJ användes för kvantitativ analys av relativt proteinuttryck.

2.10|Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys

För FACS-analys samlades hippocampuscellerna efter isolering omedelbart. Därefter tvättades cellerna med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och återsuspenderades i PBS innehållande 2 procent FBS. För varje analys färgades 1 × 105 celler i 100 µL PBS-FBS med fluorescenskonjugerad CD11b (BD PharMingen, katalog #554982, 1:250) och CD45 (BD PharMingen, katalog #554878, 1:250 för antikroppar på 1:250) 2 timmar vid 4 grader i mörker. Efter tvättning med kall PBS återsuspenderades cellerna i 300 ul PBS-FBS. Och flödescytometrisk analys utfördes på en FACSAria I flödescytometer (BD Biosciences). Resultaten analyserades med FlowJo (version 7.6.1).

2.11|Nissl färgning

Den uppsamlade hippocampus bäddades in i en OCT-förening och skars sedan i {{0}} μm koronala sektioner med hjälp av en frysmikrotom (Leica). Efter upptining på laddade objektglas tvättades sektionerna med 0.01 mol/L PBS tre gånger under totalt 15 minuter och inkuberades sedan i kresylviolettlösning (0,5 %, innehållande några droppar isättika). syra) i 10-15 minuter vid rumstemperatur. Efter tvättning med destillerat vatten två gånger, torkades sektionerna i etanol gradvis (70 procent, 85 procent, 95 procent och 100 procent). Efter dehydrering placerades de i xylen och täckglas med användning av ett monteringsmedium. Slutligen observerades Nissl-färgningen under mikroskop (Leica).

2.12|Dataanalys

Data analyserades med programvaran GraphPad Prism 6.0. Data i beteendestudierna analyserades vid olika tidpunkter (dag 1 eller dag 3) efter sevoflurananestesi med användning av en tvåvägsvariansanalys (ANOVA) med upprepade mätningar. Övriga data analyserades med envägs ANOVA före Bonferroni-testet. Alla experiment utfördes i tre exemplar och resultaten uttrycktes som medelvärdet ± SEM P < 0,05="" ansågs="" vara="" statistiskt="">

3|RESULTAT

3.1|Cistanche förhindrade onormal neuroinflammation hos åldrade råttor

För att undersöka skillnaden i kognitiv funktion mellan vuxna och åldrande råttor, användes sevofluran för att inducera anestesi på 3- och 24-månader gamla råttor. Sedan utvärderades det hippocampusberoende beteendet på dag 1 och dag 3 (Figur S1A). Som visas i figur S1B fanns det ingen skillnad i flyktlatens för fyra experimentella grupper på dag 1. Dessutom var tiden som spenderades i centrum och procenten av frysning liknande råttor som fick vehikel och sevofluran på dag 1 (Figur S1C, D). Men de 3- och de 24- månader gamla råttorna hade signifikanta skillnader i flyktlatens, tid tillbringade i centrum och procentandelen av

frysning efter sevofluraninduktionen på dag 3, vilket tyder på att sevofluran förändrade den kognitiva funktionen hos åldrade djur avsevärt (Figur S1B-D). Således användes de åldrade råttorna för de efterföljande experimenten.

För att undersöka effekterna av cistanche på neuroinflammation hos åldrade råttor som genomgår sevofluranexponering, utvärderade vi nivåerna av det proinflammatoriska cytokinet. Bevisen för neuroinflammation sågs 24 timmar efter sevoflurananestesi, vilket framgår av en hög koncentration av proinflammatoriska cytokiner IL-1, IL-6 och TNF- i plasmiden på dag 1 och dag 3 (Figur 1A, 1), och neuroinflammationen indikerades av de förhöjda mRNA:n av pro-inflammatoriska cytokiner i hippocampus upp till 3 dagar (Figur 1C-E). För var och en av de proinflammatoriska faktorerna eliminerade cistanchebehandling skillnaderna i de sevofluraninducerade förändringarna i de proinflammatoriska mediatorerna. Cistanche försvagade signifikant de förhöjda pro-inflammatoriska cytokinerna i sevofluranen

3.2|Cistanches Herba-extraktbehandling dämpade sevofluran-inducerad oxidativ stress i hippocampus hos åldrade råttor

Därefter undersökte vi effekterna av cistanche på den oxidativa stressen inducerad av sevofluran. Som illustreras i figur 2A fann vi att cistanche-behandlingen förhindrade sevofluraninducerad oxidativ stress, vilket antyds av signifikant minskad koncentration av nitrit/nitrat i hippocampus. Vi observerade också att SEVO plus cistanche-gruppen visade lägre nivåer av MDA-ekvivalenter, ett index för den oxidativa skadan på lipider, i hippocampus tre dagar efter sevofluraninhalationen, jämfört med SEVO

grupp (Figur 2B). Dessutom visade råttor som utsatts för sevoflurananestesi (SEVO-grupp) en signifikant minskning av SOD- och CAT-aktivitet på dag 3 efter anestesi i hippocampus. Hippocampusaktiviteten hos dessa enzymer ökade emellertid signifikant i SEVO plus cistanche-gruppen, jämfört med SEVO-gruppen (Figur 2C, D).

CistancheKosttillskott lindrar antioxidativ stress

3.3| Cistanches Herba-extraktbehandling dämpade mikroglialaktivering

Mikrogliaceller aktiveras under laboratoriet eller anestesi-inducerad inflammation i hippocampus, vilket sedan bidrar till den patologiska utvecklingen. För att undersöka om cistanche kunde förhindra mikrogliaaktivering, mätte vi populationen av aktiverade mikrogliaceller och dess relativa markörer. Vilande mikroglia uttryckte CD11b och ett lågt uttryck av CD45, medan aktiverade mikroglia uttryckte CD11b och hög nivå av CD45. Som visas i figur 3A bekräftade resultat från flödescytometrianalys att procentandelen CD45 var signifikant lägre hos cistanchebehandlade råttor än hos SEVO-inducerade råttor (0.495 ± 0.{{15} }51 procent efter cistanchebehandling jämfört med 1,127 ± 0,032 procent i SEVO-gruppen). Därefter mätte vi gliamarkörerna med qRT-PCR. Efter anestesi med sevofluran, mRNA

3.4|Cistanches Herba-extraktbehandling försvagade sevofluraninducerad neuronal apoptos

Neuronal apoptos drivs delvis av aktiverad mikroglia och oxidativ stress, och vi hade bekräftat att cistanche kunde förhindra mikrogliaaktivering och oxidativ stress in vivo. För att ytterligare undersöka de farmakologiska effekterna av cistanche, testade vi för neuronal apoptos med TUNEL-färgning och klyvd kaspas 3 och Bax/Bcl-2 immunoblot. Som visas i figur 4A ökade sevofluran cellapoptos i hippocampusregionerna. Cistanche-administration minskade TUNEL plus-celler efter sevoflurananestesi. Vi illustrerade också de anmärkningsvärt höga nivåerna av kaspas 3 och Bax, medan låga nivåer av Bcl-2 i hippocampus hos sövda åldrade råttor. Råttor som fick administrering av cistanche före anestesi avslöjade en signifikant minskning av kaspas 3-aktivitet (Figur 4B), klyvd kaspas 3 och Bax-protein (Figur 4C, D), vilket överensstämde med minskad neuronal apoptos observerad i TUNEL-färgning.

3,5|Cistanches Herba-extraktbehandling lindrade kognitiv dysfunktion och försämring av hippocampus vävnad efter sevofluraninducerad anestesi

För att ytterligare undersöka cistanches roll på kognitiv funktion, utsattes råttor för 50 mg/kg cistanche oralt under tre på varandra följande dagar före anestesi. I den cistanchebehandlade gruppen (grupp SEVO plus cistanche) förkortades flyktlatensen avsevärt, tiden som tillbringades i centrum var längre och frysningsprocenten ökade dag 3 efter anestesi jämfört med grupp SEVO (Figur 5A- C). Dessa resultat indikerade att cistanche åtminstone delvis kunde rädda kognitionsnedsättningar. Vi utvärderade vidare graden av neuronal död i hippocampus hos råttor i fyra grupper genom Nissl-färgning. Bilder visade att celler inte hade någon uppenbar abnormitet i gruppkontroll och gruppkontroll plus cistanche. Emellertid minskade antalet överlevnadsneuroner i CA1-regionerna signifikant i de SEVO-inducerade råttorna jämfört med det i kontrollgruppen dag 3. Behandling med cistanche vände denna effekt av SEVO och främjar signifikant neuronal överlevnad jämfört med SEVO-inducerad ensam (Figur 5D).

3.6|Cistanches Herba-extraktbehandling minskade sevofluran-inducerad pro-inflammatorisk cytokinproduktion på ett PPAR- -känsligt sätt

Vi undersökte sedan om effekten av cistanche på cytokinproduktionen var PPAR- -känslig. Behandling med GW9662 (grupp SEVO plus GW9662) ökade nivåerna av IL-1, IL-6 och TNF- jämfört med SEVO-gruppen. Behandling med cistanche minskade dock SEVO-inducerad pro-inflammatorisk cytokinproduktion. Att notera,

3.7| Cistanches Herba-extraktbehandling hämmade sevofluran-inducerad oxidativ stress via PPAR-

Det hade rapporterats att sevofluran överdriver kognitiv dysfunktion i en kronisk intermittent hypoxi-inducerad råttmodell genom hämning av PPAR-uttryck i hippocampus.1 Därefter undrade vi om effekten avcistancheskedde på ett PPAR- -beroende sätt. För detta ändamål användes GW9662, en selektiv och irreversibel antagonist av PPAR-, för ytterligare studier. Behandling med GW9662 vid 30 ng främjade oxidativ stress, vilket framgår av de ökade nivåerna av nitrit/nitrat och MDA. De antioxidativa markörerna SOD och CAT i hippocampus dag 3 ökade dock jämfört med SEVO-opererade råttor. Behandling medcistanchereducerade SEVO-inducerad överproduktion av oxidativ stressmarkörer och underlättade SOD- och CAT-aktiviteten (Figur 7A-D). Dessutom produceras dessa effekter avcistancheåterställdes av GW9662, vilket observerades av en ökning av produktionen av nitrit/nitrat (Figur 7A) och MDA (Figur 7B). Dessutom har

effekter av cistanche på SOD- och CAT-aktivitet återställdes också av GW9662 (Figur 7C, D), vilket indikerar deltagandet av PPAR-.

3.8|Cistanches Herba-extraktbehandling hämmade mikroglialaktivering och neurocytapoptos och förbättrade den kognitiva nedgången på ett PPAR- --känsligt sätt

Nästa steg var att undersöka om effekterna avcistanchepå mikrogliaaktivering och neurocytapoptos var PPAR- -känsliga. Behandling med GW9662 ökade mRNA-nivåerna av CD68 (Figur 8A), GFAP (Figur 8B) och Iba-1 (Figur 8C). Noterbart är att dessa effekter producerade av GW9662 i praktiken återställdes avcistanchesom observerats av en minskning av samma markörer (Figur 8A-C). Dessutom återställdes proteinuttrycket av GFAP och Iba-1 producerat av GW9662 också av cistanche, vilket indikerar att cistanche hämmar mikrogliaaktivering och åtminstone delvis beror på PPAR-. Dessutom inhiberades effekten av cistanche på -APP- och BDNF-proteinuttryck av GW9662 (Figur 8D, E). För att undersöka om cistanche kunde hämma neurocytapoptos på ett PPAR- -känsligt sätt, upptäcktes apoptosrelaterade proteiner. Såsom visas i figur 8F, G, reducerade cistanche vid 50 mg/kg uttrycket av pro-apoptosprotein (klyvt kaspas 3 och Bax). Dessa effekter räddades dock till stor del av GW9662.

Cistancheextrakt kan lindra cellapoptos

Eftersom den oxidativa stressen och inflammationsnivåerna var nära relaterade till kognitiv funktion hos råttor efter anestesi, bestämde vi vidare om effekten avcistanchepå kognitiv dysfunktion var PPAR- -beroende. Såsom visas i figur 8H-J, jämfört med råttor