DEL 2: Cistanche Deserticola Polysaccharide hämmar OVX-inducerad benförlust hos möss och RANKL-inducerad osteoklastogenes
Mar 02, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
Osteoporos är en allvarlig bensjukdom som drabbar den åldrande befolkningen. Cistanche deserticola (CD), ett stärkande och medicinskt livsmedel som används i stor utsträckning i Kina, har visat sig ge effektiv behandling för osteoporos.Cistanche deserticola polysackarid(CDP), extraherad från CD, har olika farmakologiska egenskaper, men dess roll i osteoklastisk bildning och funktion, såväl som osteoporos, är fortfarande okänd. Syftet med denna studie var att extrahera och rena CDP(Cistanche deserticola polysackarid)för att ytterligare utforska dess potentiella verkningsmekanism på osteoporos. Resultaten visade att CDP(Cistanche deserticola polysackarid) behandling förhindrade OVX-inducerad osteoporos och förbättrade benförlust genom att undertrycka osteoklastaktivitet och funktion. Dessutom CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling hämmade signifikant RANKL-inducerad osteoklastogenes. benresorption och osteoklastspecifikt genuttryck. Mekanistiskt, CDP(Cistanche deserticola polysackarid)hämmade RANKL-inducerad NF-xB och MAPKs signalvägsaktivering och påverkade följaktligen nedströms NEATc1-aktiveringen. Resultaten i denna studie tyder på att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)är ett potentiellt säkert läkemedel för behandling av osteoporos.
Behandling för osteoporos: Cistanche Deserticola polysackarid
KLICKA HÄR FÖR ATT SKÄLLA PRAT 1
3. Resultat
3.1. CDP(Cistanche deserticola polysackarid)förhindrar OVX-inducerad benförlust in vivo
Vi använde en OVX-inducerad osteoporosmusmodell för att undersöka effekterna av CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling av osteoporos in vivo. Jämfört med Sham-gruppen ökade kroppsvikten hos OVX-möss signifikant medan livmoderindexet minskade, vilket tyder på att osteoporosmodellen konstruerades framgångsrikt (Fig. 1B och D). mikro-CT-analys av tibias i OVX-gruppen visade en omfattande benförlust. Jämfört med OVX-gruppen ökade antalet bentrabeculae i CDP-L-gruppen, medan ökningen i CDP-H- och E2-grupperna var mer signifikant, och trabeculae i de två senare grupperna blev grövre och gapet blev mindre. Kvantitativ analys bekräftade att flera benhistomorfometriska parametrar, inklusive BMD, BV/TV, BS/TV och Tb. N hade signifikant ökade värden, medan Tb. Sp visade minskade värden i CDP-H-gruppen (Fig. 1E och F). Histopatologisk undersökning med H&E-färgning visade att antalet bentrabeculae i CDP-H- och E2-grupperna var signifikant högre än i OVX-gruppen medan det inte fanns någon signifikant förbättring i CDP-L-gruppen (Fig. 1G). Dessutom visade TRAcP-färgning att antalet osteoklaster markant ökade i OVX-gruppen men minskade i CDP-H- och E2-grupperna (Fig. 1H). CDP-L-, CDP-H- och E2-grupper visade hämmade den OVX-inducerade ökningen av P-innehåll men ökade Ca-halten i blodserumet. Benabsorptionsmarkörerna, RANKL och TRAcP-5b visade en minskande trend i CDP-L.
3.2. CDP(Cistanche deserticola polysackarid) undertrycker RANKL-inducerad osteoklastogenes in vitro
Vi övervakade cellproliferationen avCDP-behandlade BMM med hjälp av en långsiktig dynamisk realtidsanalysator för levande cellavbildning. Jämfört med kontrollgruppen, cellkonfluens iCDP-behandlade grupper förändrades inte vid en dos<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="">CDP(Cistanche deserticola polysackarid)på RANKL-inducerad osteoklastogenes, stimulerades BMM med RANKL och M-CSF i närvaro avCDPfor 7 days. TRAcP, a characteristic enzyme of osteoclasts, is considered an indicator of osteoclast function (Minkin, 1982). TRAcP staining showed that the osteoclasts treated with>1,25 µg/mlCDP(Cistanche deserticola polysackarid)visade signifikant minskad storlek och antal. Dessa resultat visade att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)hämmade effektivt den förväntade RANKL-inducerade osteoklastogenesen utan att påverka cellviabiliteten.
3.3. CDP(Cistanche deserticola polysackarid)hämmar RANKL-inducerad osteoklastisk resorptionsaktivitet och osteoklastspecifikt genuttryck
Vi bestämde ytterligare effekterna av CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling av benresorptionsaktiviteten hos osteoklaster med användning av hydroxyapatitbelagda plattor. Benresorption är huvudfunktionen och standarden för att mäta aktiviteten och förmågan hos osteoklaster (Novack & Faccio, 2011). Resultaten visade att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)kan avsevärt minska det benresorptiva området hos osteoklaster på ett dosberoende sätt, vilket indikerar att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)hämmade benresorptionsaktiviteten inducerad av RANKL (Fig. 3A och B). I synnerhet minskade det osteoklastiska benresorptiva området till cirka 6,3 procent efter behandling med 10 µg/ml CDP(Cistanche deserticola polysackarid). För att bättre ta reda på hindret för CDP(Cistanche deserticola polysackarid)på osteoklastogenes mätte vi transkriptionsnivåerna för osteoklastrelaterade gener. Utan behandling med CDP(Cistanche deserticola polysackarid), främjade induktion med RANKL uttrycket av NFATc1-, CTSK-, Acp5-, Atp6v0d2- och Mmp9-gener. Tvärtom, den samtidiga applikationen av CDP och RANKL nedreglerade dessa fem gener signifikant.
3.4. CDP(Cistanche deserticola polysackarid)hämmar RANKL-inducerad NFATc1-aktivering
TRAcP-färgning avslöjade att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling minskade signifikant den förväntade ökningen av antalet mogna osteoklaster efter RANKL-stimulering under 3–7 dagar (Fig. 4A och B). Vidare undersökte vi om CDP-behandling effektivt kan försämra osteoklastdifferentiering genom att hämma NFATc1-uttryck. Resultaten visade att NFATc1 uttrycktes starkt efter RANKL-stimulering i 5 dagar, vilket hämmades signifikant efter CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling (Fig. 4C och D). Dessutom undertryckte CDP-behandling expressionsnivåerna av CTSK, ett protein som krävs för normal osteoklastbildning och funktion (Bossard et al., 1996) (Fig. 4E och F). Vi valde en punkt-i-tidsrepresentation av RANKL-stimulering i 5 dagar för att ytterligare undersöka effekten av 10 µg/ml CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling på NFATc1-translokation. Som väntat, CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling hämmade signifikant den RANKL-inducerade NFATc1 nukleära translokationen.
3.5. CDP(Cistanche deserticola polysackarid) hämmar RANKL-inducerad aktivering av NF-KB och MAPKs signalvägar
För att klargöra mekanismerna som är involverade i den CDP-inducerade hämningen av osteoklastdifferentiering, undersökte vi effekten av CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling på NF-KB och MAPKs vägar. Resultaten visade att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling hade undertryckande effekter på IκB-nedbrytning och p65-fosforylering på ett dosberoende sätt. Fosforylering av tre MAPKs familjemedlemmar, specifikt extracellulärt signalreglerat kinas (ERK), c-Jun N-terminalt kinas (JNK) och p38 uppreglerades.
Cistanche Deserticola
4. Diskussion
Osteoporos är en vanlig och degenerativ skelettsjukdom. För närvarande finns det många kemiska syntesläkemedel som används i kliniska behandlingar för osteoporos, såsom östrogen och bisfosfonat. Långvarig användning av dessa läkemedel kommer dock gradvis att försvaga den kliniska effekten och till och med orsaka många allvarliga biverkningar, inklusive ökad risk för äggstockscancer, bröstcancer och endometriecancer och osteonekros i käken (Beral, 2003; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). I denna studie valde vi CDP(Cistanche deserticola polysackarid), en effektiv komponent extraherad från CD, som det terapeutiska medlet och visade att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)hade en skyddande effekt mot
benförlust i OVX-möss och hämmade RANKL-inducerad osteoklastbildning och funktion. Under tiden, enligt teorin om "njurstyrande ben" för traditionell kinesisk medicin, tillskrivs benförlust till njurbrist. Som en njurförstärkande medicinsk mat har CD:n visat sig ge effektiv behandling för osteoporos (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li, & Zhang, 2016). Således CDP(Cistanche deserticola polysackarid)extraherad från denna naturliga ört är ett bättre och säkrare läkemedelsalternativ.
För närvarande är OVX-musmodellen en klassisk modell av postmenopausal benförlust hos kvinnor, som undersöker orsakerna till benförlust och genomför intervention (Wehrle et al., 2015). Följaktligen utförde vi bilateral ooforektomi på C57BL/6J honmöss för att konstruera en osteoporosmodell. I tidigare studier var CDP-doserna som gavs till djur 50–200 mg/kg (låg dos) och 1800 mg/kg (hög dos) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Här, den höga dosen av CDP(Cistanche deserticola polysackarid)hos möss var 600 mg/kg, vilket baserades på den höga kliniska dosen av 30 g CD i avkok; sålunda liknar den nuvarande klinisk praxis. I denna studie, behandling med CDP(Cistanche deserticola polysackarid)hämmade signifikant OVX-inducerad kroppsviktsökning, vilket är ett vanligt fenomen som observerats hos OVX-möss (Davis et al., 2019). Genom att använda mikro-CT-skanning och 3D-rekonstruktion fann vi att OVX ledde till en märkbar minskning av BMD, BV/TV, BS/TV och Tb. N, och en ökning av Tb. Sp, medan CDP-behandling vände alla dessa förändringar. I synnerhet, jämfört med det positiva läkemedlet, kan CDP avsevärt förbättra BMD hos OVX-möss, vilket är en viktig markör för benkvalitet och används för att återspegla graden av osteoporos (Fuggle et al., 2019), vilket indikerar att CDP har en fördel över det positiva läkemedlet för att förbättra BMD. Vidare indikerade de histologiska resultaten att CDP-behandling kan minska den ökade mängden TRAcP-positiva osteoklaster inducerad av OVX. Dessa resultat tyder på att CDP-administration effektivt mildrade benförlust vid OVX-inducerad osteoporos, möjligen genom att hämma osteoklastbildning. I enlighet med ovanstående resultat fann vi CDP dosberoende hämmade RANKL-inducerad osteoklastisk bildning och funktion, medan CDP hade liten effekt på M-CSF-inducerad osteoklastprekursorcellproliferation i våra in vitro-experiment.
Bindningen av RANKL och RANK kan leda till rekryteringen av TRAF6 och den efterföljande aktiveringen av flera nedströms signalvägar, såsom NF-KB och MAPKs (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). NF-KB-signalvägen spelar en viktig roll i regleringen av osteoklastdifferentiering, och tystnaden av gener som kodar för nyckelproteiner i denna väg kan leda till onormal benutveckling (Leibbrandt & Penninger, 2008). Det är väl etablerat att NF-KB finns i cytoplasman hos ostimulerade celler i ett komplex med IKB men går snabbt in i kärnan efter RANKL-stimulering (Boyle et al., 2003). Det frigjorda IκB bryts sedan snabbt ned, medan NF-KB aktiverar specifik gentranskription, vilket följaktligen främjar osteoklastdifferentiering, mognad och apoptos (Abdelmagid et al., 2015). I denna studie visade resultaten att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)behandling undertryckte RANKL-inducerad aktivering av NF-KB-signalvägen, vilket visades genom hämning av nedbrytningen av IKB och fosforylering av p65 på ett dosberoende sätt, vilket kan involvera dess anti-osteoklastogena effekt. Dessutom är MAPKs signalväg, inklusive ERK, JNK och p38, nära involverade i RANKL-inducerad osteoklastogenes (Li et al., 2002). Dessutom kan de dominerande hämmarna av p38 och JNK förhindra RANKL-inducerad osteoklastogenes (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), medan ERK spelar en betydande roll i osteoklastöverlevnad (Miyazaki et al., 2000). Det är väl etablerat att RANKL aktiverar MAPKs signalväg genom att öka fosforyleringen av ERK, JNK och p38 (Mizukami et al., 2002). I vår studie visade vi att CDP undertryckte RANKL-inducerad fosforylering av nyckelproteiner i MAPKs signalväg. Sammantaget indikerar dessa resultat att inhibering av aktiveringen av NF-KB och MAPKs signalvägar bidrar till den hämmande effekten av CDP mot osteoklastogenes.
Aktivering av NF-KB och MAPKs signalvägar främjar uttrycket av flera viktiga transkriptionsfaktorer, såsom cellulär onkogen fos, aktivatorprotein 1 och NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, en viktig medlem av NFAT-familjen, är involverad i terminal osteoklastdifferentiering som en master transkriptionell regulator (Asagiri et al., 2005). Det har rapporterats att NFATc1--bristiga embryonala stamceller inte kan differentiera till osteoklaster under stimulering av RANKL och det ektopiska uttrycket av NFATc1 gör att prekursorceller genomgår differentiering förbi RANKL-signalering, vilket tyder på att NFATc1 har en avgörande roll i osteoklastdifferentiering (Takayanagi et al., 2002). Resultaten av vår studie visade den undertryckande effekten av CDP(Cistanche deserticola polysackarid)på NFATcl-uttryck och dess följande protein CTSK. Intressant nog observerade vi att proteinuttrycksnivån för NFATc1 först ökade och sedan minskade och nådde den högsta nivån på den 5:e dagen efter RANKL-stimulering. Detta överensstämde med resultaten av Baek et al. (2014), som observerade M-CSF-inducerad NFATc1-nedbrytning under osteoklastogenes i sent skede genom Cbl-inducerad ubiquitination av NFATc1 på ett Src-kinasberoende sätt. Immunofluorescensanalysresultat stödde konsekvent den hämmande effekten av CDP(Cistanche deserticola polysackarid)på NFATc1 transkriptionell aktivering. Dessutom undertrycktes osteoklastspecifika gener, inklusive CTSK, Acp5, Mmp9 och Atp6v0d2, alla av NFATc1 direkt (Y. Kim et al., 2005) av CDP. Dessa fynd illustrerar att NFATc1 är ett mål för den hämmande effekten av CDP(Cistanche deserticola polysackarid)på NF-KB och MAPKs signalvägar.
Cistanche deserticola polysackarid
5. Sammanfattning
Sammanfattningsvis extraherade vi och renade den aktiva polysackariden från CD och visade att CDP(Cistanche deserticola polysackarid)uppvisade en skyddande effekt på OVX-inducerad osteoporos och förbättrad benförlust genom att undertrycka osteoklastaktivitet och funktion. Dessutom CDP(Cistanche deserticola polysackarid)kan hämma RANKL-inducerad osteoklastdifferentiering och funktion genom att interferera med NF-KB och MAPKs signalvägar och följaktligen påverka nedströms NFATc1-aktiveringen. Sammanfattningsvis ger våra resultat grunden för expansion och tillämpning av CDP vid behandling av osteoporos.
Referenser
Abdelmagid, SM, Sondag, GR, Moussa, FM, Belcher, JY, Yu, B., Stinnett, H., … Safadi, FF (2015). Mutation i osteoactivin främjar receptoraktivator av NFkappaB-ligand (RANKL)-medierad osteoklastdifferentiering och överlevnad men hämmar osteoklastfunktionen. Journal of Biological Chemistry, 290(33), 20128–20146. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.624270.
Baek, JM, Kim, JY, Cheon, YH, Park, SH, Ahn, SJ, Yoon, KH, … Lee, MS(2014). Aconitum pseudolaeve var. erectum hämmar receptoraktivator av nukleär faktor kappa-B-ligand-inducerad osteoklastogenes via c-Fos/nukleär faktor av aktiverade T-celler, cytoplasmatisk 1-signalväg och förhindrarpolysackarid-inducerad benförlust hos möss. Molecules, 19(8), 11628–11644. https://doi.org/ 10.3390/molecules190811628.
Black, DM, Bauer, DC, Schwartz, AV, Cummings, SR, & Rosen, CJ (2012). Fortsatt bisfosfonatbehandling förosteoporosför vem och hur länge? New England Journal of Medicine, 366(22), 2051–2053. https://doi.org/10.1056/ NEJMp1202623.
De Martinis, M., Di Benedetto, MC, Mengoli, LP, & Ginaldi, L. (2006). Senilosteoporos: Är det en immunförmedlad sjukdom? Inflammation Research, 55(10),399–404. https://doi.org/10.1007/s00011-006-6034-x.
Fuggle, NR, Curtis, EM, Ward, KA, Harvey, NC, Dennison, EM, & Cooper, C.(2019). Frakturförutsägelse, avbildning och screening inosteoporos. Nature Reviews Endocrinology, 15(9), 535–547. https://doi.org/10.1038/s41574-019-0220-8.
Hu, Y., Huang, J., Li, Y., Jiang, L., Ouyang, Y., Li, Y., … Zeng, Q. (2020).Cistanche deserticola polysackaridinducerar melanogenes i melanocyter och minskar oxidativ stress via aktiverande NRF2/HO-1-väg. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 24(7), 4023–4035. https://doi.org/10.1111/jcmm.15038.
Huang, H., Ryu, J., Ha, J., Chang, EJ, Kim, HJ, Kim, HM, … Kim, HH (2006). Osteoklastdifferentiering kräver TAK1 och MKK6 för NFATc1-induktion och NF-kappaB-transaktivering av RANKL. Celldöd & differentiering, 13(11), 1879–1891.
Liu, Y., Wang, C., Wang, G., Sun, Y., Deng, Z., Chen, L., … Xu, J. (2019). Loureirin B undertrycker RANKL-inducerad osteoklastogenes och ovariektomiseradosteoporosvia dämpande NFATc1- och ROS-aktiviteter. Theranostics, 9(16), 4648–4662. https://doi. org/10.7150/thno.35414.
Rachner, TD, Khosla, S., & Hofbauer, LC (2011).Osteoporos: Nu och framtiden. Lancet, 377(9773), 1276–1287. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)62349-5.
Strom, O., Borgstrom, F., Kanis, JA, Compston, J., Cooper, C., McCloskey, EV, & Jonsson, B. (2011).Osteoporos: Burden, health care provision and opportunities in the EU: En rapport utarbetad i samarbete med InternationalenOsteoporosFoundation (IOF) och European Federation of Pharmaceutical Industry Associations (EFPIA). Arkiv förOsteoporos, 6, 59-155. https://doi.org/10.1007/ s11657-011-0060-1.
Identifiering och karakterisering av enpolysackaridfrån rötterna av Morinda officinalis, som en inducerare av benbildning genom uppreglering av målgenexpression. International Journal of Biological Macromolecules, 133, 446–456.
Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., & Wu, D. (2018). Immunstimulerande aktivitet av vattenextraherandepolysackariderfrån Cistanche deserticola som ett växtadjuvans in vitro och in vivo. PLoS One, 13(1), artikel e0191356. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191356.
Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., … Tu, P. (2014). Extrakt av Cistanche deserticola kan motverka immunosenscens och förlänga livslängden i åldringsaccelererade musbenägna 8 (SAM-P8) möss. Evidensbaserad komplementär och alternativ medicin, 2014(2), artikel 601383. https://doi.org/10.1155/2014/601383.
Zhang, S., Zhang, Q., Zhang, D., Wang, C., & Yan, C. (2018).Anti-osteoporos aaktivitet av en roman Achyranthes Biden tatapolysackaridvia stimulerande benbildning.Carbohydrate Polymers, 184, 288–298. https://doi.org/10.1016/j.
Zheng, H., He, B., Wu, T., Cai, J., & Wei, J. (2020). Extraktion, rening och anti-osteoporotisk aktivitet av enpolysackaridfrån Epimedium Maxim. in vitro. International Journal of Biological Macromolecules, 156, 1135–1145. https://doi. org/10.1016/j.ijbiomac.2019.11.145.
Cistanche deserticola kosttillskott
