Del 2: Echinakosid ökar spermiemängden hos råttor genom att rikta in sig på den hypotalamiska androgenreceptorn
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2
Experimentera behandling.
Experimentera 1. Möss delades slumpmässigt in i sex grupper, sju möss i varje grupp (n=7).ECH(Echinacoside från cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Kina) administrerades med en intragastrisk sond och testosteronpropionat (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Kina) gavs genom intramuskulär injektion en gång dagligen i 14 dagar enligt följande experimentella design: Kontrollgrupp: normal koksaltlösning (10 ml/kg), ECH(L)grupp (5 mg/kg), ECH(M)grupp (20 mg/kg), ECH(H)grupp (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) och enzalutamid (AR-hämmare, en gång dagligen varannan dag i 14 dagar; 20 mg/kg; CAS: 915087- 33-1; Aladdin, Shanghai, Kina).
Efter 2 veckors behandlingar bedövades mössen med dietyleter för att samla blodprover för analyser av hormonnivåer. Mössen dissekerades sedan för att separera hypotalamus, encephalon plus hypofysen, testiklarna och cauda epididymis. Prover av cauda epididymis sattes i normal saltlösning med 5 procent BSA för spermiekvalitetsbedömning, och hypotalamus, encefalon plus hypofysen och testiklarna frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 grader för vidare undersökningar.
Experimentera 2. Möss delades slumpmässigt in i 10 grupper, fem djur per grupp. ECH (20 mg/kg) administrerades oralt och mössen i varje grupp bedövades med dietyleter vid tidpunkterna 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h och 12 h efter administrering för provtagning.
Plasma samlades in och hjärtat exponerades. Perfusion av normal koksaltlösning in i de vänstra ventriklarna utfördes av en infusionsapparat tills levern och lungorna bleknades. Sedan samlades hypotalamus och testiklarna för att bestämma vävnadskoncentrationerna av ECH(Echinacoside från cistanche).
Experimentera 3. Möss delades slumpmässigt in i fyra grupper, sju i varje grupp. ECH(Echinacoside från cistanche)och BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Kina) administrerades med en intragastrisk sond en gång dagligen i 6 veckor enligt följande experimentella design: normal grupp (majsolja, 10 mL/kg, kroppsvikt/ d), modellgrupp: BPA-grupp (BPA 200 mg/kg, bw/d, majsolja) och experimentgrupp: BPA plus ECH-grupp (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg).
Efter 42 dagars behandling bedövades mössen med dietyleter och blodproverna samlades in för hormonnivåanalyser. Testis och cauda epididymis separerades och samlades upp. Cauda epididymis användes för spermiekvalitetsbedömning och testiklarna frystes i flytande kväve och förvarades vid -80 grader för vidare undersökning.
Figur 7. Banor som regleras av utvalt HPG-axelrelaterat hormon och protein i manlig reproduktion som förutspåtts av Pathway Ontology Database och KEGG Pathway Database.
Anmärkningar: Reglerade processer representeras av bakgrunder med olika färger och former, och reglerande händelser visas med pilar och linjer.
Referenserna kopplade till varje protein baserades på Pathway Ontology Database och KEGG Pathway Database och är inte listade.
Bestämning av spermiekvalitet. Beredning av spermiesuspension. Cauda epididymider maldes till 5 ml normal saltlösning med 5 procent BSA och inkuberades i 5 minuter vid 37 grader för att tillåta deras innehåll att spridas in i mediet.
Spermienummer: Enligt metoden som beskrivs av Yokoi (2003), överfördes den utspädda spermiesuspensionen (1:10; v/v; spermiesuspension/10 procent metanol) till varje räknekammare i en hemocytometer och fick stå i 5 min och räknades sedan under ett ljusmikroskop (Nikon, Instruments Inc., Japan) vid X200 förstoring.
Spermielivsduglighet: Totalt 20 μL spermiesuspension blandades med en lika stor volym eosin-nigrosinfärgning under 2 minuter; de ofärgade spermierna räknades under ett ljusmikroskop vid 200x förstoring.
Spermierörlighet: Totalt 10 μL spermiesuspension placerades på ett objektglas och registrerades som antingen rörligt eller orörligt under ett ljusmikroskop vid 200x förstoring.
Bestämning av hormonnivåer. Nivåer av testosteron (T) och LH kvantifierades i serum, encefalon plus hypofys- och testikelhomogenat med användning av radioimmunoassay (RIA) kit (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Peking, Kina). Kortfattat tillsattes anti-testosteron eller anti-LH IgG-antikropp (100 μL) och 125-I-konjugerad anti-mus-antikropp till prover eller standarden (100 μL) och blandades på en vipp över natten vid 4 grader. Efter tvättning tre gånger med PBS-Tween 20 (500 μL) centrifugerades blandningarna (3500 rpm/min) vid 4 grader i 15 min. CPM-värdena för fällningarna utvärderades med radioimmunoanalysinstrument (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Peking, Kina) och koncentrationerna av T och LH beräknades enligt formeln för en standard kurva. T- och LH-variationskoefficienten är 2,8 procent och 3,2 procent i urvalsgrupper, respektive 2,1 procent och 2,8 procent i standardgrupper.
Bestämning av genuttryck genom kvantitativ PCR i realtid. Totalt RNA isolerades från frusna testiklar och encefalon plus hypofysvävnader med användning av ett RNA Simple Total RNA-kit (Tiangen, Peking, Kina). Kvantitativ realtids-PCR (q RT-PCR) utfördes för amplifiering av cDNA med användning av 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Kina). PCR-proceduren bestod av 95 grader i 30 sekunder följt av 35 cykler av 95 grader i 15 sekunder, 58 grader i 30 sekunder och 72 grader i 30 sekunder. Smältkurvanalysen utfördes på PCR-produkterna för att verifiera primerspecificitet och produktrenhet. En dissociationskurva utfördes för varje platta för att bekräfta produktionen av en enda produkt. Den relativa mängden av varje mRNA beräknades. PCR-primrarna som används för studien visas i tabell 2.
Western blot. För AR-expressionsanalys utfördes extraktion och isolering av cytoplasmatiskt och nukleärt protein med användning av ett Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit (Beyotime, Nanjing, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Koncentrationerna av cytoplasmatiska och nukleära proteiner utvärderades med användning av ett Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Kina). Proteinprover (80 ug) kördes på en 12 procent och 5 procent SDS-PAGE gel och överfördes till PVDF-membran. Efter blockering inkuberades membranen med anti-AR IgG-antikroppar (1:1,000; Bioss; Peking Kina) och polyklonala anti-GAPDH-antikroppar från mus (1:1,000; Wuhan Boster BiologiskTechnology, Wuhan, Kina) eller mus polyklonala anti-Lamin b1-antikroppar i 2 timmar. Membranet tvättades tre gånger med TBST och inkuberades med en HRP-konjugerad kanin-anti-mus-IgG-antikropp (1:5, 000; Bioss; Beijing, Kina). Signalen visualiserades med hjälp av ChemiDoc Imaging System (Tanon-3,500, Shanghai, Kina).
Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) analys. Blod uppsamlades i hepariniserade glasrör. Plasman separerades genom omedelbar centrifugering vid 6,000 rpm under 10 min och lagrades vid -20 grader för ytterligare experiment. Hypothalamus- och testikelproverna från varje tidpunkt slogs samman och homogeniserades med metanol. Efter centrifugering vid 10,000 rpm vid 4 grader i 10 minuter, koncentrerades supernatanten med N2 och återstoden löstes i 50 μL metanol och filtrerades genom ett 0,45 μm filter. Tio μL av den provfiltrerade vätskan injicerades i HPLC-systemet för analys.
Standardkurvan bestod av prover innehållande 50, 100, 250, 500 och 750 ng/ml av ECH(Echinacoside från cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, Kina). Plasmakvalitetskontrollprover spetsade med 75 ng/ml (låg), 150 ng/ml (medium) och 300 ng/ml (hög) av ECH bereddes följaktligen för att mäta metodens noggrannhet och precision.
Kromatografi utfördes med ett HPLC-system (D2{{10}}00 Elite-serien, Hitachi, Japan) kopplat till en UV-detektor (L-2400, Hitachi, Japan). Separation utfördes på en Thermo-C18 (250 mm × 4,6 mm id, 4,6 μm partiklar) kolonn som hölls vid 25 grader. Den mobila fasen var en gradient framställd av 0,1 procent fosforsyra innehållande 0,04 procent trimetylamin (komponent A) och metanol (komponent B). Den linjära gradienten var som följer: 70–90 procent A över 0-2 min, 60–70 procent A över 2–6 min, 55–60 procent B under 6–8 min och återgick sedan till 90 procent A vid 8 min omedelbart. Flödeshastigheten var 0,8 ml/min. UV-detektorn drevs vid 332 nm. Toppområdet utvärderades som den analytiska mätningen.
Farmakokinetiska studier på möss. ECH:s penetration(Echinacoside från cistanche)till hypotalamus och testiklarna utsattes för farmakokinetisk analys med Drug and Statistics programvara (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). Farmakokinetiska parametrar bestämdes med användning av den icke-kompartmenterade metoden baserad på statistisk momentteori. De preliminära farmakokinetiska parametrarna inklusive tiden till toppkonstant (Tmax), toppkoncentration (Cmax), eliminationshastighetskonstant (Ke), eliminationshalveringstid (T0.5), arean under kurvan (AUC{ {4}}–12), skenbar distributionsvolym (Vc) och clearance (CL) erhölls för ytterligare analys. Hjärna/plasma-förhållanden beräknades baserat på AUC0-t-värden för plasma och hjärna.
ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) syntes och identifiering. Totalt 9,8 mg ECH(Echinacoside från cistanche)och 1,0 mg butandiolanhydrid löstes i 2 ml pyridin, blandades i 12 timmar under omrörning vid rumstemperatur. Blandningen koncentrerades med N2 och återstoden kombinerades med 10,8 mg N-hydroxisuccinimid (NHS) och 19,3 mg dicyklohexylkarbodiimid (DCC) och löstes i 4 ml N, N-dimetylformamid (DMF) under 12 timmar under omrörning vid rumstemperatur . Efter centrifugering vid 2,000 g under 5 minuter vid 4 grader, sattes supernatanten till 5 ml PBS i vilken 14,4 mg ovalbumin (OVA) löstes. Den nya blandningen omrördes i 24 timmar vid 4 grader. Reaktionslösningen dialyserades sedan mot PBS under tre dagar. Närvaron av ECH-OVA bekräftades av UV-spektra (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) vid en våglängd från 190 till 400 nm såväl som genom denaturering av PAGE.
Indirekt ELISA (iELISA). En mikrotiterplatta belades med ECH-OVA (2 ug/100 μL) och inkuberades över natten vid 4 grader. Plattan tvättades tre gånger med PBST och två gånger med PBS; och 5 procent PBSM (PBS innehållande 5 procent skummjölk) tillsattes för att blockera de obundna platserna vid 37 grader under 2 timmar. Efter att plattorna tvättats med PBST och PBS, delades brunnarna in i 4 grupper; experimentell grupp, 1 ug AR totalt protein/100 μL; positiv grupp, anti-OVA-antikropp från kanin (1:1,000); negativ grupp, 1 ug bovint serumalbumin; och en blank grupp innehållande PBS. Efter inkubation i 1,5 h tvättades plattorna och 100 μL/brunn av kanin HRP-konjugerat IgG (1:1, 000) tillsattes till den positiva gruppen, 100 μL/brunn av anti-AR tillsattes (1:1,000) till de andra grupperna. Efter inkubation i 1,5 timmar tillsattes kanin-HRP-konjugerad IgG (1:5, 000) utspädning till plattorna. Efter inkubation vid 37 grader i 1 timme tvättades plattorna tre gånger med PBST och två gånger med PBS. TMB tillsattes sedan och inkuberades under 10 minuter i mörker vid rumstemperatur och 2 M H2SO4 tillsattes för att stoppa reaktionen. Absorbansen avlästes vid en våglängd av 450 nm.
Molekylär dockning. En molekylär dockningsstudie utfördes för att undersöka bindningssättet för föreningen ECH(Echinacoside från cistanche)till den humana androgenreceptorn (AR) med hjälp av Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Den tredimensionella (3D) strukturen för AR (PDB ID: 2YHD) laddades ner från Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). 3D-strukturen för ECH erhölls av programvaran ChemBioDraw Ultra 14.0 och ChemBio 3D Ultra 14.0. AutoDockTools 1.5.6-paketet (http://mgltools.scripps.edu) användes för att generera dockningsindatafilerna. Söknätet för AR identifierades som center x: 36.141, center y: 8.513 och center z:
21.304 med dimensioner storlek x: 15, storlek y: 15 och storlek z: 15. Värdet på uttömmande sattes till 20. För Vina-dockning användes standardparametrarna om det inte nämndes. Positionen med bäst poäng enligt Vina-dockningspoängen valdes och analyserades visuellt med programvaran PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org).
Dataanalys och statistiska metoder. Data analyserades med hjälp av statistisk programvara SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En enkelriktad ANOVA användes för jämförelse mellan grupperna. Tukeys jämförelsetest av signifikanta skillnader mellan grupper bestämdes. Resultaten uttrycktes som medel ± standardavvikelse (SD) med användning av Graph Pad Prism programvara v.7 (GraphPad Software, Inc, Kalifornien, USA).
Etiskt godkännande och samtycke till att delta. Etiskt godkännande för denna studie erhölls från Etikkommittén vid Anyang Institute of Technology.
Referenser
1. Cano, SN, Misra, M. & Ackerman, KE Träning, träning och hypotalamus-hypofys-gonadalaxeln hos män och kvinnor.Front. Horm. Res. 47, 27–43 (2016).
2. Papadopoulos, V. & Miller, WL Roll av mitokondrier i steroidogenes. Bästa praxis. Res. Cl. Sv. 26, 771–790 (2012).
3. Rone, MB et al. Identifiering av ett dynamiskt mitokondriellt proteinkomplex som driver kolesterolimport, trafficking och metabolism till ett steroidhormon. Mol. Endokrinol. 26, 1868–1882 (2012).
4. Shibari, S., Ylonen, H. & Palme, R. Utsöndring och mätning av kortikosteron- och testosteronmetaboliter i banksorkar (Myodes glareolus). Gen. Comp. Endokrinol. 243, 39–50 (2017).
5. O'Hara, L. et al. Hypofys androgenreceptorsignalering reglerar prolaktin men inte gonadotropiner hos hanmusen. PloS ett. 10, e0121657 (2015).
6. Amador, AG, Parkening, TA, Beamer, WG, Bartke, A. & Collins, TJ Testikulära LH-receptorer och cirkulerande hormonnivåer i tre musmodeller för ärftliga sjukdomar (Tfm/y, lit/lit och hyt/hyt). Endokrinol. Exp. 20, 349-58 (1986).
7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. & Scheiner-Bobis, G. Icke-klassisk testosteronsignalering förmedlad genom ZIP9 stimulerar claudin-uttryck och tight junction-bildning i Sertoli-celler. Cell. Signal. 28, 1075–85 (2016).
8. Walker, WH Testosteronsignalering och reglering av spermatogenes. Spermatogenes. 1, 116–20 (2011).
9. Cao, C. & Kindscher, K. The Medicinal Chemistry of Echinacea Species (red. Kindscher, K.) 127–145 (Springer, 2016).
10. Jiang, ZH, Jian, W., Li, XP & Zhang, XYEchinacosideochCistanche tubulosa (Schenk) R. Wight förbättrar bisfenol A-inducerad testikel- och spermieskada hos råttor genom gonadaxelreglerade steroidogena enzymer. J. Etnopharmacol. 193, 321–328 (2016).
