Del 2: Verbascoside skyddar bukspottkörtelceller mot ER-stress
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 och Carla Perego 1,*
Snälla klicka här tillbaka till del 1
3.4 Verbascoside modulerar -Cells mitokondriell aktivitet och dynamik
MTT-viabilitetsanalyser tyder på en möjlig effekt avverbascosidedirekt på mitokondrier som säkerställer kopplingen av insulinutsöndringen till näringstillståndet och cellöverlevnaden i denna celltyp. Form och membranpotential är markörer för mitokondriell hälsa [42]. Vi utvärderade först mitokondriell membranpotential genom att märka cellerna med MitoSpyw Orange CMTMRos, ett permeabelt färgämne vars koncentration beror på den inre mitokondriella membranpotentialen, medan MitoSpyw Green FM användes för att normalisera data till mitokondriernas massa (Figur 4A, B). Membranpotentialen hos mitokondrier iverbascoside-behandlade celler ökade jämfört med kontroll vid både basala och stresstillstånd. Intressant,verbascosidemetaboliter utövade olika effekter. Cafésyra förbättrade inte den mitokondriella potentialen, medan hydroxityrosol orsakade en dosberoende försämring av mitokondriell funktion, i överensstämmelse med data om cellviabilitet, en sådan effekt var mer uppenbar efter H2O2-exponering (Figur S3).
Eftersom funktionen är strikt relaterad till morfologi, mätte vi Ferets diameter, area och cirkuläritet av mitokondrierna. Akut oxidativ stress främjar en omfattande mitokondriell fission, vilket resulterar i mindre, cirkulära mitokondrier [42]. Under H2O2-stressförhållanden var mitokondrier av verbascoside-behandlade celler mer långsträckta och visade ökad yta än kontroll (Figur 4C, D och Figur S4). Mitokondriell cirkularitet var lägre i verbascoside-behandlade celler än i kontroller och skillnader var mer uppenbara i H2O2-behandlade celler (Figur S3), vilket återigen bekräftade polyfenolens skyddande roll.
Förmågan hos dessa organeller att modifiera sin form som svar på näringstillstånd eller stressiga tillstånd är under kontroll av fusions- och fissionshändelser och kräver mitokondriell motilitet [39]. Spårning av mitokondrierrörelser ledde till att vi beräknade det kumulativa tillryggalagda avståndet och analysen avslöjade en signifikant ökning av mitokondriernas dynamik i de verbascoside-behandlade cellerna jämfört med kontroll, redan under basala förhållanden (Figur 4E, F och Video S1–S4). Effekten var mer uttalad efter H2O2-behandling, faktiskt förbehandling med verbascoside nästan helt återställde effekten av oxidativ stress på mitokondriell dynamik.
Sammantaget stöder dessa data starkt en nyckelroll för verbascoside för att säkerställa mitokondriernas dynamik, vilket är avgörande för att främja den snabba anpassningen av denna organell till stressförhållanden.
3.5 Verbascosides inverkan på människan av Langerhans överlevnad och funktion
Med tanke på translationspotentialen hosverbascosidetillämpning inom människors hälsa, verifierade vi dess inverkan på mänskliga isolerade Langerhanska öar, en mer relevant modell för fysiopatologiska och farmakologiska studier på -celler. Isolerade öar behandlades med 16 uM verbascosid under 5 dagar och mitokondriernas membranpotential utvärderades. Som rapporterats i figur 5A, medan organellpotentialen äventyrades i mänskliga kontrollöar efter H2O2-exponering, minskade inte den inre membranpotentialen hos mitokondrier i verbascoside förbehandlade öar signifikant, vilket stöder hypotesen om en skyddande roll för verbascoside mot ROS-inducerad - celldysfunktion. Analys av uttryck av ER-stressmarkörer visade en viktig minskning av P-eIF2-fraktionen i de två distinkta öpreparaten som bibehölls i 16 uM verbascoside, vilket bekräftar nedregleringen av denna väg även i humana prover (Figur 5D). De gynnsamma effekterna av polyfenolbehandlingen bekräftades av det ökade insulininnehållet som observerades i verbascoside-behandlade öar jämfört med kontroller (Figur 5B). Dataspridning i våra experiment gjorde det inte möjligt att påvisa någon signifikant skillnad mellan glukosstimulerad insulinsekretion (GSIS) i verbascoside-behandlade öar, även om en positiv trend verkar uppenbar under både basala och stressförhållanden (Figur 5C).
4. Diskussion
Oxidativ stress och inflammation är grunden för celldysfunktion som inträffar under T2D [43,44] som sådan, funktionell mat, näringsämnen och fytokemikalier har undersökts som verktyg för att förhindra typ 2-diabetes [45]. I detta arbete fokuserade vi på verbascoside, som är känt för att utöva antiinflammatoriska och antioxidanta aktiviteter i neuroner [18]. Trots den höga strukturella komplexiteten har verbaskosid och isoverbaskosid hittats i blodplasma hos råttor som matats med Lippia citriodora-extrakt tillsammans med några metaboliter [20]. Dessutom har cellackumulering av verbascoside och är verbascoside upptäckts i en bröstcancercellinje SKBR3 [23] och studier utförda på Caco-2-celler visar att måttliga mängder verbascoside och isoverbascoside förblir intakta och biotillgängliga efter in vitro matsmältning bearbeta. Dessutom kan Caco-2 ta upp båda molekylerna genom en snabb och linjär transport i intervallet 10 till 100 uM [22]. Inga data har rapporterats om verbascosides biotillgänglighet hos människor, och ändå antyder de ovan nämnda studierna att det kan vara möjligt för icke-metaboliserad verbascoside att passera tarmbarriären, cirkulera i blodplasma och utöva antioxidanteffekter på endokrina celler i bukspottkörteln.
Vi fann en dosberoende (0.8–16 uM) skyddande roll för verbascoside på klonala och mänskliga celler, både under basala och stressförhållanden. Denna effekt beror på verbascoside i sig och inte på dess metaboliter koffeinsyra och hydroxityrosol, som faktiskt verkar cytotoxiska vid koncentrationen 16 uM. Koncentrationerna som visat sig vara aktiva i våra experiment är i linje med de som beskrivs hos djur som matats med verbascoside [20].
Även om vi inte vet om verbascosid verkar extracellulärt genom att binda till en membranreceptor eller internaliseras av endocytos och verkar intracellulärt, bekräftar våra data att verbascoside har antioxiderande och antiinflammatoriska egenskaper och skyddar celler mot ER-stressrelaterade dysfunktioner genom att minska UPR och främja mitokondriell dynamik.
Faktum är att vi upptäckte en signifikant minskning av ROS-innehåll i verbascoside-behandlade celler, vilket ytterligare bekräftas av minskningen av lipidperoxidation mätt genom HNE- och akroleinuttryck. Till skillnad från de flesta växtpolyfenoler följer verbascoside ROS-rensande aktivitet huvudsakligen indirekt (via uppreglering av ROS-avlägsnande enzymer) snarare än direkta vägar. Faktum är att det ökar gentranskriptionen av vissa antioxidantenzymer genom aktivering av Nrf2 (NF-E2-relaterad faktor 2) väg och via AhR (arylkolvätereceptor)-beroende mekanism [24,29]. Som sådan fann vi ökat uttryck av SOD1 i verbascoside-behandlade celler.
ROS-homeostas är extremt relevant i cellpatologi. På grund av bristen på antioxidantenzymer kan förhöjd produktion av ROS inte neutraliseras och ER-stress som främjar proteinfelveckning induceras. ER-stress leder till en minskning av insulintranskription och translation genom aktivering av UPR [44,46]. Denna väg har det huvudsakliga syftet att återställa ER-funktionen genom omprogrammering av genuttryck, men när den överstimuleras utlöser den apoptos. Våra data tyder på att en viktig åtgärd av verbascoside är att mildra UPR, vilket möjliggör de modifieringar som är nödvändiga för att reparera ER-dysfunktion, utan att orsaka apoptos. Enligt denna möjlighet minskade uttrycket av BIP-, HSP70- och PERK-proteiner i verbascoside-behandlade celler, och aktiveringen av PERK-vägen försvagades som svar på tunikamycin-inducerad ER-stress. En liknande verkan rapporterades för tyrosol i insulinom NIT-1-cellinjen [47].
Särskilt intressant är förmågan hos verbascoside att modulera aktiveringen av PERK-grenen av UPR. I -celler krävs denna väg för att upprätthålla den basala sekretoriska homeostasen och -cellöverlevnad, och den är allvarligt avreglerad vid diabetes [41,48]. Ännu mer spännande, vanliga varianter vid PERK bidrar till risken för prediabetes och recessiva mutationer i EIF2AK3-genen (som kodar för PERK) som ligger till grund för mottagligheten för Wolcott-Rallisons syndrom som kännetecknas av permanent neonatal insulinberoende diabetes [49,50].
Nedreglering av den IKB-NFKB inflammatoriska vägen upptäcktes också i vårt system i närvaro av verbascoside. NFKB representerar den huvudsakliga inflammatoriska vägen i -celler och dess ihållande aktivering initierar en kaskad av händelser som kulminerar i -celldöd. I stressade celler skyddar minskningen av NFKB-uttryck pankreatiska celler från diabetogena medel [27,51], vilket ytterligare stöder verbascoside-applikationen vid diabetesförebyggande. Intressant nog aktiverar PERK-signalering transkriptionsfaktorerna NFR2 (inblandad i redoxhomeostasen) och NFKB, vilket förklarar de antioxidanta och antiinflammatoriska effekterna av verbascoside [40,52].
Våra data avslöjar också en viktig roll för verbascoside på mitokondriell aktivitet och dynamik.
Markör för mitokondriell funktionskvalitet är deras dynamik, en process som kännetecknas av koordinerade cykler av fusions- och fissionshändelser som reglerar mitokondriernas antal, distribution, morfologi och membranpotential [39]. I linje med denna möjlighet förbättrar verbascoside tc3 mitokondriella membranpotential både under basala och stressförhållanden. Återigen beror effekten på verbascoside och inte på dess metaboliter, eftersom koffeinsyra inte förbättrar mitokondriell funktion och hydroxityrosol minskar organellpotentialen markant. Ökad mitokondriell dynamik och förändringar i deras morfologi observerades genom att spåra mitokondriella rörelser, vilket tyder på att verbascoside främjar ett mito-morfos-program. Omformning av det cellulära mitokondriella nätverket påverkar sammansättningen av de respiratoriska kedjans superkomplex, vilket förändrar inte bara cellmetabolismen utan också dess redoxtillstånd och gör det möjligt för celler att bättre motverka oxidativ stress och inflammation [5,37,39].
Även om den molekylära mekanismen fortfarande är okänd, kan vi anta att verbascoside, som andra polyfenoler, skyddar mitokondriellt DNA genom att minska ROS-koncentrationen [53] och förhindrar öppningen av mitokondriell permeabilitetsövergångspor [54], vilket säkerställer den fysiologiska mitokondriella aktiviteten. En annan spännande möjlighet är att modifiering av mitokondriernas dynamik och aktivitet återigen förmedlas av verkan av verbascoside på UPR. Faktum är att en nyligen genomförd forskning inom mitokondriella fältet indikerar att platser för ER-mitokondrierinteraktion spelar en nyckelroll i kontrollen av mitokondriell dynamik och aktivitet som svar på oxidativ stress och PERK är involverad i fenomenet [55]. De flesta in vitro-studier med polyfenoler utfördes i cellinjer, ofta av tumörursprung, som skiljer sig från ursprungliga celler när det gäller metabolism och ROS-produktion. Vi tillhandahåller här bevis för att verbascoside utövar en skyddande effekt även på mänskliga isolerade Langerhanska öar, det slutliga målet för intervention vid diabetes. Intressant nog mildrar polyfenolen PERK-signalaktiveringen redan under basala förhållanden, vilket ökar insulinhalten och förhindrar oxidativ stress-medierad mitokondriell dysfunktion. Det återstår att klarlägga om polyfenoleffekten på insulininnehållet reflekterar föreningens förmåga att förhindra celldöd, att mildra ER-stress eller att direkt kontrollera insulingenuttrycket, vilket visas för andra polyfenoliska föreningar [56]. Dessa data är särskilt relevanta med tanke på den möjliga användningen av verbascoside som en komplementär terapi vid diabetesbehandling.
5. Slutsatser
De in vitro-studier som rapporteras här på klonala och mänskliga celler indikerar att verbascoside utövar skyddande effekter mot ER-stress-associerade dysfunktioner, vilket minskar aktiveringen av PERK-grenen av UPR och förbättrar mitokondriernas dynamik. Eftersom avbrott i ER-homeostas utlöser cellskador och diabetes, ger dessa data ett skäl för eventuell användning av verbascoside som ett näringsämne i sjukdomsförebyggande och behandling. Ändå måste många problem lösas för en effektiv klinisk tillämpning av verbascoside. Trots mängden laboratoriestudier är tillförlitliga kliniska studier som bekräftar hälsoeffekterna av verbascoside in vivo begränsade. Dessutom är det obligatoriskt att öka dess stabilitet och biotillgänglighet för framtida tillämpning av denna förening i människors hälsa. Från denna punkt är verbascoside en intressant molekyl eftersom dess ställning har olika reaktiva ställen som kan modifieras genom kombinationskemi. Vi förväntar oss att informationen från dessa studier kommer att öppna vägar för terapeutisk modulering av oxidativ stress och inflammation under patologiska tillstånd genom att använda naturliga föreningar.
Tilläggsmaterial: Följande är tillgängligt online på http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Figur S1: Effekter av koffeinsyra och hydroxityrosol på cellernas livsduglighet. Figur S2: Effekter av verbascoside på tunikamycin-inducerad ER-stress. Figur S3: Effekter av koffeinsyra och hydroxityrosol på mitokondriell membranpotential. Figur S4: Kvantitativa bildanalyser av mitokondrier i celler behandlade med koffeinsyra och hydroxityrosol. Video S1, S2 Videor: Mitokondriernas dynamik inspelad under basala förhållanden, i frånvaro (S1) eller närvaro (S2) av verbascoside. Video S3, S4: Mitokondrierdynamik registrerad under oxidativ stressförhållanden, i frånvaro (S3) eller närvaro (S4) av verbascoside.
Författarbidrag: konceptualisering, AG, PM och CP; datakurering, AG och PM; formell analys, AG och PM; finansieringsförvärv, CP; utredning, MC; metodik, AM och SG; resurser, FB, RR och ADG; övervakning, CP; validering, AM, SG och MC; visualisering, AG och AM; skrift—originalutkast, AG; skrivande—granskning och redigering, PM, AM, FB, RR, ADG, MC och CP Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.
Finansiering: Denna forskning fick ingen extern finansiering.
Tack: Vi vill tacka Carlo Corino och Mario Dell'Agli för reagenserna och den hjälpsamma diskussionen.
Intressekonflikter: Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.
Referenser
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: Globala uppskattningar av diabetesprevalens för 2017 och prognoser för 2045. Diabetes Res. Clin. Öva. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Diabetes vid korsningen: Sjukdomsklassificeringens relevans för patofysiologi och behandling. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. Cellbiologin för systemisk insulinfunktion. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Kolesterolmetabolism, pankreas-cellfunktion och diabetes. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Basis Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Algeriet, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Forma pankreatisk celldifferentiering och funktion: Influensen av mekanotransduktion. Cells 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabetes Mellitus och cellen: De senaste tio åren. Cell 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ME; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Minskad insulinexocytos i mänskliga pankreatiska celler med genvarianter kopplade till typ 2-diabetes. Diabetes 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Dynamik av insulinutsöndring vid fetma och diabetes. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. Roden, M.; Shulman, GI Den integrativa biologin av typ 2-diabetes. Naturen 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
