Del 2 Echinakosid ökar spermiemängden hos råttor genom att rikta in sig på den hypotalamiska androgenreceptorn
Mar 10, 2022
För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com
Diskussion
Etnofarmakologiska register och vår tidigare studie13 bekräftade detCistanche tubulosaextrakter ökade effektivt könshormonnivåer och förbättrad spermiekvalitet.ECHsom en av huvudföreningarna iCistanche tubulosa19,20, kan öka antalet spermier och öka utsöndringen av LH och T (Fig. 1). I den här studien visade vi detECHdistribuerades till hypotalamus istället för testiklarna, vilket tyder på en indirekt effekt av ECH på testiklarna. Faktum är att ECH direkt hämmade hypotalamisk AR-aktivitet, AR-translokation till kärnan och HPG-axelrelaterat genuttryck och gav också skydd mot BPA-inducerad reproduktionsskada.
I studier av human gonadotropinproduktion regleras könshormonnivåerna hårt av HPG-axeln och en negativ återkopplingsslinga21. T-utsöndringen är nämligen markant ökad som svar på konsekventa och ihållande ökningar av LH-nivåer i blodet som svar på en brist på negativ androgen återkoppling till hypofysen och hypotalamus. I den här studien,ECHökade utsöndringen av LH i encefalon plus hypofys och produktion av testosteron i testis och mRNA-nivåer av LHR och Gnrhr i encefalon plus hypofys (fig. 1 och fig. 4), vilket tyder på attECHkan påverka HPG-axelns negativa återkoppling. Inte överraskande spelar AR själv en viktig roll i återkopplingsregleringen av T- och LH-nivåer22,23. Det manliga HPG-axelparadigmet är centrerat på testosteron som ger negativ återkopplingsrepression på nivån för både hypotalamus och hypofysen24,25. Tidigare studier använde Foxg1-Cre för att avlägsna gener av intresse i hypofysen men inte hypotalamus för att bestämma den relativa betydelsen av de två regionerna. Resultaten visade att AR-signalering i hypofysen hos den manliga musen är nödvändig när det gäller testosteronberoende reglering av LH-sekretion26. Av denna anledning valde vi att fokusera på hypotalamisk AR för vidare studier.
Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer
Som en steroid nukleärt hormonreceptor regleras aktiviteten av AR av steroidliganden T, vars bindning initierar nukleär translokation och den transkriptionella regulatoriska funktionen av AR27. I den här studien visade vi detECHbehandling hämmade AR-translokation från cytoplasman till kärnor i hypotalamus (fig. 3). Dessutom visade PK-studien detECHkan markant penetrera till hypotalamus snarare än till testiklarna, vilket tyder på att mer ECH passerar blod-hjärnbarriären, möjligen via endocytos, snarare än blodtestisbarriären. Dessutom visade vi med indirekt ELISA den kombinerande förmågan hos ECH och AR, vilket tyder på att ECH direkt kan binda till AR. Detta stöddes ytterligare av resultat från molekyldockningsanalysen som indikerade att förmodade bindningsställen för ECH finns vid Met-894 och Val-713 i AR-fickan (Fig. 5D). Detta stöder andras upptäckter att AR deltar i regleringen av en negativ matningsslinga och att en minskning av AR-T-interaktioner i hjärnan resulterar i ökad LH-sekretion23,28,29
Steroidogenes är en hårt kontrollerad, väsentlig process för utvecklingen av spermatogenes med involvering av steroidogent protein (StAR)30 och steroidogena enzymer såsom CYP11A1, CYP17A1, 3 -hydroxisteroiddehydrogenas (HSD3) och 17 -hydroxisteroid dehydrogenas (HSD17) som omvandlar kolesterol till testosteron31. Vi visade att mRNA-nivåerna för generna som kodar för dessa enzymer ökade signifikant medECHbehandling medan uttrycket av StAR-mRNA inte förändrades. Detta tyder på detECHhade ingen effekt på överföringen av kolesterol till mitokondriernas inre membran, medan det kan spela en roll för att främja kolesterolomvandling till testosteron. Slutsatsen kan då dras attECHbehandling ökar avsevärt antalet spermier genom att öka syntesen och utsöndringen av testosteron.
För att undersöka den skyddande effekten avECHvid spermieskada användes bisfenol A (BPA), ett typiskt exogent hormonstörande ämne, som en modell för reproduktionsskada hos män hos möss32.ECHbehandling återhämtade effektivt spermieantal, spermiemotilitet, T- och LH-nivåer minskade av BPA (fig. 6A, B), vilket tyder på att ECH kan dämpa spermieskada.
Jämfört med de artificiellt syntetiserade kemikalierna för hormonersättningsterapi,ECHär en naturlig icke-hormonell förening som påverkar negativ feedback på HPG-axeln och därigenom ökar utsöndringen av LH, T och spermiekvalitet. Denna mekanistiska väg kan skydda det manliga reproduktionssystemet och därmedECHkan betraktas som ett potentiellt naturligt reproduktionsskyddande medel. Hormonregleringarna är dock komplexa och leder ofta till systemiska effekter. Som indikeras i fig. 7 ökade ECH T- och LH-utsöndringar och hämmade AR-aktivering, vilket också kan leda till konsekvenser på andra hälso- eller sjukdomsassocierade vägar såsom osteoporos33 och depression hos män34, därför bör de omfattande effekterna av ECH vara ytterligare undersökt.
Sammantaget tyder våra resultat på detECHbinder till AR i hypotalamus och hämmar överföringen av AR från cytoplasman till kärnan. Våra data tyder på att ECH binder till platser i AR-fickan vid aminosyrorna Met-894 och Val-713. Detta kan förklara ökningen av T- och AR-nivåer som ett systemiskt svar på balanserade hormonnivåer genom att främja LH-utsöndring och en efterföljande ökning av T-produktion och spermieantal (Fig. 8).
Metoder
Etikförklaring.
Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med riktlinjerna för försöksdjur som fastställts av ministeriet för vetenskap och teknik (Peking, Kina). Alla experimentella protokoll granskades och godkändes av Etikkommittén vid Anyang Institute of Technology.
Försöksdjur.
Fyra veckor gamla inavlade Kunming-möss (22 g–25 g) erhölls från djurcentret vid det fjärde militärmedicinska universitetet (Xi'an, Kina). Djuren hölls under kontrollerade förhållanden vid en temperatur av 22 grader ± 2 grader, 70 procent ± 4 procent luftfuktighet med 12 timmars ljus-mörker-cykling och fri tillgång till foder och vatten.
Experimentera behandling.
Experiment 1. Möss delades slumpmässigt in i sex grupper, sju möss i varje grupp (n=7).ECH(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Kina) administrerades med en intragastrisk sond och testosteronpropionat (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Kina) gavs genom intramuskulär injektion en gång dagligen i 14 dagar enligt följande experimentella design: Kontrollgrupp: normal koksaltlösning (10mL/kg), ECH(L)-grupp (5mg/kg), ECH(M)-grupp (20mg/kg),ECH(H) grupp (80mg/kg), TP (15mg/kg) och enzalutamid (AR-hämmare, en gång dagligen varannan dag i 14 dagar; 20mg/kg; CAS: 915087-33-1; Aladdin, Shanghai, Kina).
Efter 2 veckors behandlingar bedövades mössen med dietyleter för att samla blodprover för analyser av hormonnivåer. Mössen dissekerades sedan för att separera hypotalamus, encephalon plus hypofysen, testiklarna och cauda epididymis. Prover av cauda epididymis sattes i normal koksaltlösning med 5 procent BSA för spermiekvalitetsbedömning, och hypotalamus, encefalon plus hypofysen och testiklarna frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 grader för vidare undersökningar.
Experiment 2. Möss delades slumpmässigt in i 10 grupper, fem djur per grupp.ECH(20mg/kg) administrerades oralt och mössen i varje grupp bedövades med dietyleter vid tidpunkterna 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h, och 12 timmar efter administrering för provtagning. Plasma samlades in och hjärtat exponerades. Perfusion av normal koksaltlösning in i de vänstra ventriklarna utfördes av en infusionsapparat tills levern och lungorna bleknades. Tio hypotalami och testiklar samlades in för att bestämma vävnadskoncentrationerna av ECH.
Experiment 3. Möss delades slumpmässigt in i 4 grupper, sju i varje grupp.ECHoch BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Kina) administrerades med en intragastrisk sond en gång dagligen i 6 veckor enligt följande experimentella design: normal grupp (majsolja, 10 ml/kg, kroppsvikt/d) , modellgrupp: BPA-grupp (BPA 200 mg/kg, bw/d, majsolja), och experimentgrupp: BPA plus ECH-grupp (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg). Efter 42 dagars behandling bedövades mössen med dietyleter och blodproverna samlades in för hormonnivåanalyser. Testis och cauda epididymis separerades och samlades in. Cauda epididymis användes för spermiekvalitetsbedömning och testiklarna frystes i flytande kväve och förvarades vid -80 grader för vidare undersökning.
Bestämning av spermiekvalitet. Beredning av spermiesuspension. Cauda epididymider maldes till 5 ml normal saltlösning med 5 procent BSA och inkuberades i 5 minuter vid 37 grader för att tillåta deras innehåll att spridas in i mediet. Spermienummer: Enligt metoden som beskrivs av Yokoi (2003), överfördes den utspädda spermiesuspensionen (1:10; v/v; spermiesuspension/10 procent metanol) till varje räknekammare i en hemocytometer och fick stå i 5 minuter och räknades sedan under ett ljusmikroskop (Nikon, Instruments Inc., Japan) vid x200-förstoring. Spermielivsduglighet: Totalt 20 μL spermiesuspension blandades med en lika stor volym eosin-nigrosin-färgning i 2 minuter; de ofärgade spermierna räknades under ett ljusmikroskop vid 200x förstoring. Spermierörlighet: Totalt 10 μL spermiesuspension placerades på ett objektglas och registrerades som antingen rörligt eller orörligt under ett ljusmikroskop vid 200x förstoring.
Bestämning av hormonnivåer. Nivåer av testosteron (T) och LH kvantifierades i serum, encefalon plus hypofys och testikelhomogenat med användning av radioimmunoassay (RIA) kit (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Peking, Kina). Kortfattat tillsattes anti-testosteron eller anti-LH IgG-antikropp (100 μL) och 125-I-konjugerad anti-mus-antikropp till prover eller standarden (100 μL) och blandades på en vipp över natten vid 4 grader. Efter tvättning tre gånger med PBS-Tween 20 (500 μL) centrifugerades blandningarna (3500 rpm/min) vid 4 grader i 15 minuter. CPM-värdena för fällningarna utvärderades med radioimmunoanalysinstrument (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Peking, Kina) och koncentrationerna av T och LH beräknades enligt formeln för en standard kurva. Te T- och LH-variationskoefficienten är 2,8 procent och 3,2 procent i urvalsgrupper, respektive 2,1 procent och 2,8 procent i standardgrupper.
Bestämning av genuttryck genom kvantitativ PCR i realtid. Totalt RNA isolerades från frusna testiklar och encefalon plus hypofysvävnader med användning av ett RNA Simple Total RNA-kit (Tiangen, Peking, Kina). Kvantitativ realtids-PCR (q RT-PCR) utfördes för applicering av cDNA med användning av 2×SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Kina). PCR-proceduren bestod av 95 grader i 30 sekunder följt av 35 cykler av 95 grader i 15 sekunder, 58 grader i 30 sekunder och 72 grader i 30 sekunder. Smältkurvanalysen utfördes på PCR-produkterna för att verifiera primerspecificitet och produktrenhet. En dissociationskurva utfördes för varje platta för att bekräfta produktionen av en enda produkt. Den relativa mängden av varje mRNA beräknades. PCR-primrarna som används för studien visas i tabell 2.
Western blot. För AR-expressionsanalys utfördes extraktion och isolering av cytoplasmatiskt och nukleärt protein med användning av ett Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit (Beyotime, Nanjing, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Koncentrationerna av cytoplasmatiska och nukleära proteiner utvärderades med användning av ett Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Kina). Proteinprover (80 ug) kördes på en 12 procent och 5 procent SDS-PAGE gel och överfördes till PVDF-membran. Efter blockering inkuberades membranen med anti-AR IgG-antikroppar (1:1,000; Bioss; Beijing Kina) och polyklonala anti-GAPDH-antikroppar från mus (1:1,000; Wuhan Boster Biologisk
Technology, Wuhan, Kina) eller polyklonala mus-anti-Lamin b1-antikroppar i 2 timmar. Membranet tvättades tre gånger med TBST och inkuberades med en HRP-konjugerad kanin-anti-mus-IgG-antikropp (1:5, 000; Bioss; Beijing, Kina). Signalen visualiserades med hjälp av ChemiDoc Imaging System (Tanon-3,500, Shanghai, Kina).
Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) analys.
Blod uppsamlades i hepariniserade glasrör. Plasman separerades genom omedelbar centrifugering vid 6,000 rpm under 10 min och lagrades vid -20 grader för ytterligare experiment. Hypothalamus- och testikelproverna från varje tidpunkt slogs samman och homogeniserades med metanol. Efter centrifugering vid 10,000rpm vid 4 grader i 10 minuter, koncentrerades supernatanten med N2 och återstoden löstes i 50 μL metanol och filtrerades genom ett 0,45 μm filter. Tio μL av den provfiltrerade vätskan injicerades i HPLC-systemet för analys. Standardkurvan bestod av prover innehållande 50, 100, 250, 500 och 750 ng/ml av ECH (Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, Kina). Plasmakvalitetskontrollprover spetsade med 75 ng/ml (låg), 150 ng/ml (medium) och 300 ng/ml (hög) av ECH framställdes följaktligen för att mäta metodens noggrannhet och precision.
Kromatografi utfördes med ett HPLC-system (D2{{10}}00 Elite-serien, Hitachi, Japan) kopplat till en UV-detektor (L-2400, Hitachi, Japan). Separation utfördes på en Termo-C18 (250 mm × 4,6 mm id, 4,6 μm partiklar) kolonn som hölls vid 25 grader. Den mobila fasen var en gradient framställd av 0,1 procent fosforsyra innehållande 0,04 procent trimetylamin (komponent A) och metanol (komponent B). Den linjära gradienten var som följer: 70–90 procent A över 0-2 min, 60–70 procent A över 2–6 min, 55–60 procent B under 6–8 min, och återgick sedan till 90 procent A vid 8 min omedelbart. Flödeshastigheten var 0,8 ml/min. UV-detektorn drevs vid 332 nm. Toppområdet utvärderades som den analytiska mätningen.
Farmakokinetiska studier på möss. Inträngningen av ECH till hypotalamus och testiklarna utsattes för farmakokinetisk analys med Drug and Statistics programvara (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). Farmakokinetiska parametrar bestämdes med användning av den icke-kompartmenterade metoden baserad på statistisk momentteori. De preliminära farmakokinetiska parametrarna inklusive tiden till toppkonstant (Tmax), toppkoncentration (Cmax), eliminationshastighetskonstant (Ke), eliminationshalveringstid (T0.5), arean under kurvan (AUC{ {4}}–12), skenbar distributionsvolym (Vc) och clearance (CL) erhölls för ytterligare analys. Hjärna/plasma-förhållanden beräknades baserat på AUC0-t-värden för plasma och hjärna.
ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) syntes och identifiering. Totalt 9,8 mg ECH och 1,0 mg butandiolanhydrid löstes i 2 ml pyridin, blandades i 12 timmar under omrörning vid rumstemperatur. Blandningen koncentrerades med N2 och återstoden kombinerades med 10,8 mg N-hydroxisuccinimid (NHS) och 19,3 mg dicyklohexylkarbodiimid (DCC) och löstes i 4 mlN, N-dimetylformamid (DMF) under 12 timmar under omrörning vid rumstemperatur. Efter centrifugering vid 2,000 g under 5 minuter vid 4 grader, sattes supernatanten till 5 ml PBS i vilken 14,4 mg ovalbumin (OVA) löstes. Den nya blandningen omrördes i 24 timmar vid 4 grader. Reaktionslösningen dialyserades sedan mot PBS under tre dagar. Närvaron av ECH-OVA bekräftades med UV-spektra (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) vid en våglängd som sträcker sig från 190 till 400 nm såväl som genom denaturering av PAGE.
Indirekt ELISA (iELISA). En mikrotiterplatta belades med ECH-OVA (2 ug/100 μL) och inkuberades över natten vid 4 grader. Plattan tvättades tre gånger med PBST och två gånger med PBS, och 5 procent PBSM (PBS innehållande 5 procent skummjölk) tillsattes för att blockera de obundna platserna vid 37 grader under 2 timmar. Efter att plattorna tvättats med PBST och PBS, delades brunnarna in i 4 grupper; experimentgrupp, 1 ug AR totalt protein/100μL; positiv grupp, anti-OVA-antikropp från kanin (1:1,000); negativ grupp, 1 ug bovint serumalbumin; och en blank grupp innehållande PBS. Efter inkubation i 1,5 h tvättades plattorna och 100 μL/brunn av kanin HRP-konjugerad IgG (1:1, 000) tillsattes till den positiva gruppen, 100 μL/brunn av anti-AR tillsattes ( 1:1,000) till de andra grupperna. Efter inkubation i 1,5 timmar tillsattes kanin-HRP-konjugerad IgG (1:5, 000) utspädning till plattorna. Efter inkubation vid 37 grader i 1 timme tvättades plattorna tre gånger med PBST och två gånger med PBS. TMB tillsattes sedan och inkuberades i 10 minuter i mörker vid rumstemperatur och 2M H2SO4 tillsattes för att stoppa reaktionen. Absorbansen avlästes vid en våglängd av 450 nm.
Molekylär dockning. En molekylär dockningsstudie utfördes för att undersöka bindningssättet för föreningen ECH till den humana androgenreceptorn (AR) med hjälp av Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Den tredimensionella (3D) strukturen för AR (PDB ID: 2YHD) laddades ner från Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). 3D-strukturen för ECH erhölls av programvaran ChemBioDraw Ultra 14.0 och ChemBio 3D Ultra 14.0. AutoDockTools 1.5.6-paketet (http://mgltools.scripps.edu) användes för att generera dockningsindatafilerna. Sökrutnätet för AR identifierades som center x: 36.141, center y: 8.513, och center z: 21.304 med dimensionerna storlek x: 15, storlek y: 15 och storlek z: 15. Värdet på uttömmande var satt till 20. För Vina-dockning användes standardparametrarna om det inte nämndes. Positionen med bäst poäng enligt Vina-dockningspoängen valdes och analyserades visuellt med programvaran PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org). Dataanalys och statistiska metoder.
Dataanalys och statistiska metoder. Data analyserades med hjälp av statistisk programvara SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En enkelriktad ANOVA användes för jämförelse mellan grupperna. Tukeys jämförelsetest av signifikanta skillnader mellan grupper bestämdes. Resultaten uttrycktes som medel ± standardavvikelse (SD) med användning av Graph Pad Prism programvara v.7 (GraphPad Sofware, Inc, Kalifornien, USA).
Etiskt godkännande och samtycke till att delta. Etiskt godkännande för denna studie erhölls från Etikkommittén vid Anyang Institute of Technology
