DEL 1 Echinacosid hämmar glutamatfrisättning genom att undertrycka spänningsberoende Ca2 + -inträde och proteinkinas C i råtta cerebrokortikala nervterminaler

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 och Su Jane Wang 3,*

1 Institutionen för anestesiologi, Far-Eastern Memorial Hospital, Pan-Chiao District, New Taipei City 22060, Taiwan; drluchengwei@gmail.com (C.W.L.); drlin1971@gmail.com (T.Y.L.);nskh9450n@yahoo.com.tw (S.K.H.)

2 Institutionen för maskinteknik, Yuan Ze University, Taoyuan 32003, Taiwan

3 School of Medicine, Fu Jen Catholic University, nr 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., Nya Taipei 24205, Taiwan.

Abstrakt:Det glutamaterga systemet kan vara involverat i effekterna av neuroprotektiva terapier. Echinacosid, en fenyletanoidglykosid extraherad från den medicinska kinesiska örtenHerba Cistanche,har neuroprotektiva effekter. Denna studie undersökte effekterna av echinacosid på 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning i råtta cerebrokortikala nervterminaler (synaptosomer). Echinacosid hämmade Ca²⁺-beroende, men inte Ca²⁺-oberoende, 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning på ett koncentrationsberoende sätt. Echinacosid minskade också den 4-aminopyridin-framkallade ökningen av cytoplasmatisk fri Ca²⁺koncentration men förändrade inte den synaptosomala membranpotentialen. Den hämmande effekten av echinacosid på 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning förhindrades av cu-konotoxin MVIIC, en bredspektrumblockerare av Cav2.2 (N-typ) och Cav2.1 (P / Q-typ) kanaler, men var okänslig för den intracellulära Ca²⁺frisättningshämmare dantrolen och 7-kloro-5-(2-klorfenyl)-1,5-dihydro-4,1-bensodiazepin-2(3H)-one (CGP37157). Vidare minskade echinacosiden den 4-aminopyridininducerade fosforyleringen av proteinkinas C, och proteinkinas C-hämmare avskaffade effekten av echinacosid på glutamatfrisättning. Enligt dessa resultat föreslår vi att den hämmande effekten av echinacosid på framkallad glutamatfrisättning är associerad med minskad spänningsberoende Ca²⁺inträde och efterföljande undertryckande av proteinkinas C-aktivitet.

Nyckelord:echinacosid; glutamat frigöring; cerebrokortikala nervterminaler; spänningsberoende Ca²+ kanaler; proteinkinas C av Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom och ocklusion av mellersta hjärnartären[9-12]. Mekanismen genom vilken echinacosid inducerar neuroprotektion är emellertid inte helt förstådd.

För mer information, vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Echinacosidi cistanche har många funktioner

1. Inledning

Echinacosidär en viktig fenyletanoidglykosid närvarande iHerba Cistanche, en välkänd traditionell kinesisk medicin som används för att behandla glömska, impotens och kronisk förstoppning [1].Echinacosidhar olika bioaktiviteter såsom antioxidation, antiinflammation, cancer, hepatoprotektion och immunmodulering [2–4]. Särskiltechinacosidhar neuroprotektiva effekter; Det kan till exempel skydda mot oxidativ stress- eller neurotoxininducerad neurotoxicitet i primära råttkortikala neuroner, humana neuroblastom SH-SY5Y-celler och feokromocytom (PC12) celler [5-8]. Dessutomechinacosiddämpar hjärnskador och förbättrar kognitiv funktion i djurmodeller av Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom och ocklusion i mellersta hjärnartären [9–12]. Emellertid mekanismen genom vilkenechinacosidinducerar neuroprotektion är inte helt förstådd.

Neuroprotektion är en komplex process för att bevara neuronal struktur och funktion vid giftiga förolämpningar. Glutamat excitotoxicitetsreduktion anses vara en potentiell mekanism som är involverad i hjärnans neuroprotektion. Glutamat, en excitatorisk aminosyraneurotransmittor, har en avgörande roll i flera hjärnfunktioner [13]. Överaktiveringen av glutamatreceptorer under höga glutamatkoncentrationer orsakar emellertid intracellulär Ca2 + överbelastning, mitokondriell dysfunktion, produktion av fria radikaler och neuronal död [14,15]. Denna patologiska process är inblandad i många hjärnstörningar inklusive cerebral ischemi, traumatisk hjärnskada, epilepsi och neurodegenerativ sjukdom [16,17]. Därför anses hämmare som blockerar patofysiologisk glutamatogerisk överföring vara potentiella neuroprotektiva läkemedel. Anmärkningsvärda exempel på dessa är glutamatreceptorantagonister [18,19]; Kliniska prövningar för dessa läkemedel har dock misslyckats på grund av mindre effektivitet och oönskade, eller till och med cytotoxiska biverkningar [20,21]. Förutom direkt glutamatreceptorblockad kan hämning av glutamatfrisättning vara en effektiv strategi för neuroprotektion. Flera neuroprotektanter (t.ex. memantin och riluzole) kan minska glutamatfrisättningen i råtthjärnvävnader [22–24].

Med tanke på glutamatens roll i excitotoxicitet och den neuroprotektiva profilen förechinacosidanvände den föreliggande studien isolerade nervterminaler (synaptosomer) renade från råttans hjärnbark för att undersöka effekten avechinacosidom glutamatfrisättning och ytterligare utforskade potentiella mekanismer. Det isolerade nervterminalpreparatet är en väletablerad modell för att studera den presynaptiska regleringen av neurotransmittorfrisättning av läkemedel i frånvaro av postsynaptiska effekter [25]. Genom att använda denna modell utvärderade vi effekten avechinacosidpå glutamatfrisättning, membranpotential, presynaptisk Ca2 + tillströmning och proteinkinas C-aktivitet. Enligt vår genomgång av litteraturen är detta den första rapporten som dokumenterar den mekanism genom vilkenechinacosidhämmar endogen glutamatfrisättning på presynaptisk nivå.

Echinacosid kan anti-oxidation

2. Resultat

2.1.EchinacosidHämmar 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning från råtta cerebrokortikala nervterminaler genom att minska vesikulär exocytos

Figur 1 illustrerar den koncentrationsberoende effekten avechinacosidpå 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning från renade råtta cerebrokortikala synaptosomer. I synaptosomer inkuberade med 1 mM CaCl2 framkallade 1 mM 4-aminopyridin en glutamatfrisättning på 7,4 ̆ 0,1 nmol/mg/5 min, vilket reducerades med 1, 5, 10, 30 och 50 μMechinacosidtill 6,5 ̆ 0,2, 5,8 ̆ 0,3, 4,8 ̆ 0,2, 4,1 ̆ 0,1 respektive 2,3 ̆ 0,4 nmol/mg/5 min (F(5,24) = 67,1, p = 0,000). IC50-värdet förechinacosid-medierad hämning av 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning, härledd från en dos-responskurva, var 24 μM. Dessutom påverkades glutamatfrisättningen framkallad av 1 mM 4-aminopyridin i en extracellulär Ca2+-fri lösning innehållande 300 μM etylenglykolbis(β-aminoetyleter)-N,N,N1,N1-tetraättiksyra (EGTA) 2,1 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12) = 310,65, p = 0,000), och denna Ca2+-oberoende komponent av 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning påverkades inte av 20 μMechinacosid(1,8 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; p = 0,58; Figur 1). I synaptosomer behandlade med 0,1 μM bafifilomycin A1, en vesikulär transportörhämmare [26], reducerades frisättningen av 4-aminopyridinframmanade glutamat signifikant (2,2 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; F (2,12) = 249,518, p = 0,000). I närvaro av bafifilomycin A1 kunde 20 μM echinacosid signifikant hämma frisättningen av glutamat (2,1 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; p = 0,94; Figur 1). Däremot ökade 10 μM DL-treo-beta-bensyl-oxiaspartat (DL-TBOA, en glutamatåterupptagshämmare) [27] 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning till 11,8 ̆ 0,4 nmol/mg/5 min (t(8) = '11,31, p = 0,000). Även i närvaro av DL-TBOA, 20 μMechinacosidhämmad 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning signifikant (7,7 ̆ 0,2 nmol / mg / 5 min; F(2,12) = 87,23, p = 0,000; Figur 1)

2.2. EchinacosidMinskar cytosolisk ca²+Koncentration men förändrar inte synaptosomal

Mem brane Potential

Synaptosomdepolarisering orsakad av 1 mM 4-aminopyridin ökade Ca²+ koncentration(p= 0,000; Tabell 1). Tillämpningen av 20 |vMechinacosidpåverkade inte signifikant baral Ca²+ koncentration (t(8) = 0,06,p= 0,95) men signifikant minskade den 4-aminopyridininducerade ökningen iia Ca²+ koncentration (t(10)= 6,16,p =0,000). Dessutom ökade 1 mM 4-aminopyridin i 3',3',3'-dipropyltiadicarbocyanindemid [DiSC₃(5)] fluorescens (p= 0,000). Tillägget o⁽20 fdM echinacosid förändrade inte vilomembranpotentialen (t(8) = 0,976,p= 0,36) eller signifikant förändra den 4-aminopyridinmedierade ökningen av DiSC₃(5) fluorescens (t(8) = —0,014,p= 0,99; Tabell 1).

Cistancheechinacosidkan behandla njursjukdom

2.3.Minskad CO2+Tillströmning genom kanalerna Cav2.2 (N-type) och Cav2.1 (P/Q-type) kan associeras med hämningen av 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning genomEchinacosid

Figur2visar att 2 cu-conotoxin MVIIC, en N-och P / Q-typ Ca²+ kanalblockerare,

reducerad frisättning av 4-aminopyridinframmanade glutamat från 7,4 土 0,2 till 2,0 土 0,1 nmol/mg/5 min (t(9) = 25,35,p= 0,000). I närvaro av cu-konotoxin MVIIC var effekten av 20 pM echinacosid på 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning obetydlig (1,8 土 0,2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1,06,p= 0,32). Dantrolen (10 ^M), en hämmare av intracellulär Ca²+ frigör Crom den endoplasmatiska retikulumet [28], reducerad 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning (5,6 土 0,3 nmol / mg / 5 min; F(2,14) = 104,95,p= 0,000). Men i närvaro av dantrolen, 20 pJMechinacosidkan fortfarande hämma glutamatfrisättningen signifikant (3,3 土 0,2 nmol /mg/5 min;p= 0,000). Liknande resultat observerades med användning av 100 pM 7-klor-5-(2-klorofeni)-1,5-dihydro-4,1-bensotiazepin-2(3H)-one (CGP37157), en membranpermeaWe-blockerare av mitokondriell Na⁺/Ca²+ utbyte. I de fem undersökta synaptosomala preparaten, 20 pMechinacosidkombinerat med 100 pM CGP37157 minskade 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning med 48,3% 土 5,2% (F (2,13) = 136,79,p= 7.000), liknande hämningen av echinacosid ensam (46.2% 土 2.3%;p= 0,89;

2.4.EchinacosidInhibcts 4-aminopyridin-evoked (glutamatfrisättning genom signalering genom proteinkinas C

Som illustreras i figur 3, 10 °jlM 2-[1-(3-dimetylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl)maleimid (GF109203X), en gen er al-proteinkinas C-hämmare [29], reducera ed 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning (F(2,13) = 19,46, p = 0,000). I GF109203X-behandlade synaptosomer minskade 20 pM echinacosid 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning med endast 5,5% 土 1,8% (p = 0,89), mindre än den med enbart echinacosid (42,4% 土 2,3%; p = f,000). Liknande resultat erhölls med 5,6,7,13-tetrahydro-13-metyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]karbazol-12-propannitril (Go6976), en selektiv för Ca2+-beroende proteinkinas C-isoformer (a, |3I, |3II, y) [29]. I närvaro av 3 pM Go6976, 20 pMechinacosidminskad glutamatfrisättning med 11,9% 土 2,9% (p = 0,59), vilket innebär en signifikant minskning jämfört med den med ekinacosid ensam (42,4% 土 2,3%; p = 0,000; Figur 3). Däremot förändrade 3 pM rottlerin, en Ca2+-oberoende proteinkinas C6-hämmare [30], inte signifikant 4-aminopyridin (1 mM)-framkallad glutamatfrisättning (p = 0,45). I närvaro av rottlerin orsakade emellertid 20 pM echinacosid effektivt en genomsnittlig hämning på 37,1% 土 5,6% av frisättningen (F (2,13) = 19,72, p = 0,000), liknande den med echinacosid ensam (p = 0,41; Figur 3). Dessutom minskade den mitogenaktiverade proteinkinashämmaren 2-(2-amino-3-metoxifenyl)-4H-1-bensopyran-4-one) (PD98059) (50 pM) och proteinkinas A-hämmaren N-[2-(p-bromocinnamylamino)etyl]-5-isokinolinsulfonamid (H89) (100 pM) 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning (p = 0,000). Även i närvaro av PD98059 eller H89, 20 pMechinacosideffektivt minskat frisättningen (F (2,13) = 52,3, p = 0,000; Figur 3).

Figur 4 visar att tha11 mM 4-aminopyridin ökade fosforyleringen av proteinkinas C i synaptosomer (t(4) = —6,871,p= 0,002). När synaptosomer förbehandlades med 20 pM echinacosid i 10 min före tillsats av 4-aminopyridin, minskade 4-aminopyridin fosforylering av proteinkinas C avsevärt (F(2)_a6) = 29.202,p= 0,00 1).

Echinacosidicistanchekan ökaimmunförsvar

2.5.Echinacosid-Medierad hämning av glutamatfrisättning involverar inte en gamma-aminosmörsyra typ A (GAB³A_A) Receptor

I figur 5, effekten av echinacosid på 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning i frånvaro eller närvaro av SR95531 (en antagonist till GABA_Areceptor) jämfördes. Dessutom förändrade 100 pM SR95531 inte signifikant 4-aminopyridin (1 mM)-framkallad glutamatfrisättning. I den

SR95531-behandlade synaptosomer, applicering av 20 pM echinacosid resulterade i en 43% hämning på 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning (F (2,12) = 42,63,p= 0,000), vilket inte skilde sig signifikant från den hämning som enbart echinacosid framställde (40 %.,p= 0,000). Ett liknande resultat erhölls med en annan GABAa-receptorantagonist, bicuculline (50 pM). Frisättningen mätt i närvaro av bicuculline och