DEL 2 Echinakosid hämmar glutamatfrisättning genom att undertrycka spänningsberoende Ca2 plus inträde och proteinkinas C i cerebrokortikala nervterminaler från råtta

För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

KLICKA HÄR FÖR DEL 1

3. Diskussion

I denna studie, echinacoside, en aktiv förening iHerba Cistanche, hämmade 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning i hjärnbarkens nervterminaler på råtta. De möjliga underliggande mekanismerna för den echinakosid-medierade hämningen av glutamatfrisättning undersöks och diskuteras vidare här.

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

3.1. Mekanismer bakom Echinacoside-medierad hämning av glutamatfrisättning Glutamatfrisättning

framkallad av 4-aminopyridin består av två komponenter: en fysiologiskt relevant Ca2 plus-beroende komponent, som produceras genom exocytos av synaptiska vesiklar som innehåller glutamat; och en Ca2 plus-oberoende komponent, som härrör från förlängd depolarisering som orsakar en membranpotentialmedierad förskjutning av glutamattransportörens steady-state mot den utåtriktade riktningen, vilket påverkar cytosoliskt glutamatutflöde [31]. Här observerade vi detechinakosidhämmade inte signifikant 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning i närvaro av ett Ca2 plus-fritt medium (Ca2 plus -oberoende frisättning). Dessutom den observeradeechinakosid-medierad hämning av 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning förhindrades effektivt av bafilomycin A1 (som utarmar glutamatinnehållet i synaptiska vesiklar), men inte av DL-TBOA (som icke-selektivt hämmar alla excitatoriska aminosyratransportörsubtyper). Dessa resultat tyder på detechinakosidpåverkar den Ca2 plus-beroende exocytosen av glutamatfrisättning utan att påverka det Ca2 plus-oberoende cytosoliska utflödet av glutamat genom omkastningen av den nervterminala plasmamembran glutamattransportören. I synaptiska terminaler stabiliserar Na plus-kanalhämning eller K plus-kanalaktivering membranets excitabilitet och minskade följaktligen den framkallade Ca2 plus-inträdet och frisättningen av neurotransmittor [32,33]. Därför den potentiella underliggande mekanismenechinakosid-förmedlad glutamatfrisättningsinhibering involverar en minskning av synaptosomal excitabilitet. Denna möjlighet är emellertid ohållbar på grundval av två observationer: (1) 4-aminopyridin-framkallad membranpotentialdepolarisering, mätt med det membranpotentialkänsliga färgämnet DiSC3(5) påverkades inte av tillsatsen avechinakosid; och (2) echinakosid påverkade inte den 4-aminopyridinframkallade Ca2 plus-oberoende glutamatfrisättningen, en frisättningskomponent som endast beror på membranpotentialen [31]. Om effekten inte orsakas av undertryckande av synaptosomal excitabilitet, kan den manifesteras genom en minskning av aktiviteten av Cav2.2 (N-typ) och Cav2.1 (P/Q-typ) Ca2 plus-kanaler kopplade med glutamatexocytos i nervterminaler [34–36]. Genom att använda fura-2 visar vi detechinakosidminskar signifikant den 4-aminopyridinframkallade ökningen av Ca2 plus-koncentrationen. Dessutom visar våra data att den hämmande effekten avechinakosidpå 4-aminopyridin-framkallat glutamat minskade frisättningen från 42,4 procent ˘ 2,3 procent till 12,1 procent ˘ 3,9 procent efter exponering för en blockerare av Cav2.2 (N-typ) och Cav2.1 (P/Q-typ) Ca2 plus kanaler. Dessutom har vi observerat detechinakosidfortsatte att signifikant hämma 4-aminopyridin-framkallad glutamatfrisättning i närvaro av intracellulär Ca2 plus frisättningshämmare. Dessa resultat indikerar att den samtidiga undertryckandet av Cav2.2 (N-typ) och Cav2.1 (P/Q-typ) Ca2 plus-kanalaktivitet är den potentiella mekanismen bakomechinakosid-medierad glutamatfrisättningsinhibering. Den kombinerade aktiveringen av Cav2.2 (N-typ) och Cav2.1 (P/Q-typ) Ca2 plus-kanalaktivitet kunde dock inte blockera verkan avechinakosidfullständigt. Följaktligen kan andra oidentifierade typer av Ca2 plus-kanaler eller andra presynaptiska vägar vara involverade i hämningen. Till exempel är GABAA-receptorer närvarande på presynaptisk nivå, och deras aktivering har visat sig hämma Ca2 plus influx och glutamatfrisättning [37]. I den föreliggande studien blockerade inte GABAA-receptorantagonisterna SR95531 och bicuculline echinakosid-medierad hämning av glutamatfrisättning, vilket tyder på att GABAA-receptorer inte är involverade i minskningen av spänningsberoende Ca2 plus-kanalaktivitet och i den efterföljande hämningen av glutamatfrisättning.

Ca2 plus-inträde genom spänningsberoende Ca2 plus-kanaler aktiverar flera proteinkinaser associerade med glutamatfrisättning i nervterminaler inklusive mitogenaktiverat proteinkinas, proteinkinas C och proteinkinas A. Här visar vi att proteinkinas C-hämmare effektivt antagoniseradeechinakosid-medierad hämning av glutamatfrisättning; icke desto mindre var den mitogenaktiverade proteinkinashämmaren PD98059 eller proteinkinas A-hämmaren H89 ineffektiva. Dessutom det. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1006 8 av 13 4-aminopyridin-inducerad fosforylering av proteinkinas C minskade i synaptosomer efter förbehandling medechinakosidvid en koncentration som är effektiv för att hämma glutamatfrisättning. Därför är signalvägen förechinakosid-medierad glutamatfrisättningsinhibering kan involvera proteinkinas C. Proteinkinas C är ett viktigt intracellulärt signalsystem som finns på presynaptisk nivå och har en avgörande roll i neurotransmittorexocytos. Till exempel fosforyleras flera synaptiska proteiner involverade i den synaptiska vesikelhandeln eller rekrytering och exocytos, såsom det myristoylerade alaninrika C-kinassubstratet, av proteinkinas C [38,39]. Denna fosforyleringsprocess kan ökas genom depolarisationsstimulerad Ca2 plus inträde, vilket underlättar glutamatfrisättning [40]. Därför kan vi rimligtvis spekulera i att den hämmande effekten avechinakosidpå Ca2 plus-inträde som observeras här kan minska proteinkinas C-aktivitet och följaktligen glutamatfrisättning.

3.2. Terapeutiska konsekvenser

Excitotoxicitet, en patologisk process som orsakas av överdriven glutamatfrisättning och glutamatreceptoraktivering, är den främsta orsaken till neuronal död vid akuta och kroniska hjärnsjukdomar såsom stroke, traumatisk hjärnskada, Parkinsons och Alzheimers sjukdomar [13,41] och terapeutiska strategier som involverar glutamatfrisättningsinhibering kan vara lovande neuroprotektiva strategier för behandling av sådana sjukdomar.Echinacosidehar bekräftats penetrera blod-hjärnbarriären (BBB) ​​och uppvisar neuroprotektiva effekter i olika in vivo-modeller av neurotoxicitet [8,10-12,42]. Även om mekanismen för dessa neuroprotektiva effekter inte är helt klarlagda, har flera möjliga mekanismer rapporterats, inklusive inflammatorisk responshämning, mitokondriell funktionsstabilisering, antioxidation, fria radikaler och efterlikning av neurotrofisk funktion [5,9,12,42]. I den aktuella studien kan echinakosids förmåga att minska glutamatfrisättning från nervterminaler också delvis förklara dess neuroprotektiva mekanism. Huruvida denna effekt bidrar till den uppenbara terapeutiska potentialen hos echinakosid vid hjärnsjukdomar associerade med glutamatexitotoxicitet motiverar dock ytterligare forskning.

4. Material och metoder

4.1. Kemikalier

Fura-2-acetoximetylester (Fura-2-AM) och 3',3',3'-dipropyltiadikarbocyaninjodid[DiSC3(5)] köptes från Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ω-konotoxin MVIIC, rottlerin,2-[1-(3-dimetylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl)maleimid ( GF109203X), 5,6,7,13-tetrahydro-13-metyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,{ {27}}c]karbazol-12-propanenitril (Go6976) och N-[2-(p bromocinnamylamino)etyl]-5-isokinolinsulfonamid (H89) köptes från TocrisBioscience (Bristol, Storbritannien). Echinakosid, dantrolen, DL-treo-beta-bensyl-oxiaspartat (DL-TBOA),7-klor-5-(2-klorfenyl)-1,5-dihydro -4,1-bensotiazepin-2(3H)-on (CGP37157), 2-(2-amino-3-metoxifenyl)-4 H-1-bensopyran-4-on) (PD98059), etylenglykol bis(-aminoetyleter)-N,N,N1,N1-tetraättiksyra (EGTA) och alla andra reagens köptes från Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).

4.2. Djur

Två månader gamla Sprague-Dawley-hanråttor användes. Djuren hölls under standardiserade miljöförhållanden (22 ˘ 1 ˝C; 50 procent relativ fuktighet; 12 timmars ljus/mörker-cykel) och tillät obegränsad tillgång till mat och vatten. Djuren dödades genom halshuggning och hjärnbarken avlägsnades snabbt vid 4 ˝C. De experimentella procedurerna godkändes av Fu Jen InstitutionalAnimal Care and Utilization Committee (A10259), i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och att använda ett minimum antal djur som krävs för att ge tillförlitliga resultat.

4.3. Synaptosomala preparat

Synaptosomer renades från hjärnbarken hos råttor på diskontinuerliga Percoll-gradienter som beskrivits tidigare [43,44]. Kortfattat homogeniserades vävnaden i ett medium innehållande 0,32 M sackaros (pH 7,4), homogenatet centrifugerades under 10 min vid 3000ˆ g (5{{25) }}00 rpm i en JA 25.5 rötor; Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA) och 4 ˝C, och supernatanten centrifugerades igen under 12 minuter vid 14 500ˆ g ( 11,000 rpm i en JA 25.5-rotor). Pelleten återsuspenderades försiktigt i 0,32 M sackaros (pH 7,4), och en alikvot av denna synaptosomala suspension (2 ml) placerades på en 3 ml Percoll diskontinuerlig gradient innehållande 0,32 M sackaros, 1 mM EDTA, 0,25 mM DL-dl-ditio 3 procent, 10 procent och 23 procent Percoll (pH 7,4). Efter centrifugering vid 32 500ˆ g (16 500 rpm i en JA 20,5 rötor) under 7 minuter vid 4 ˝C, utvanns synaptosomerna från mellan 10 procent och 23 procent Percoll-banden, och de späddes ut i en slutlig volym på 30 ml av HEPES-buffertmedium (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2¨ 6H2O, 1,2 mM Na2HPO4, 10 mM glukos och 10 mM HEPES (pH 7,4)). Efter ytterligare centrifugering vid 27,000ˆ g (15 000 rpm i en JA 25.5) under 10 minuter återsuspenderades synaptosompelleten i 3 ml HEPES-buffertmedium och proteininnehållet bestämdes med användning av en Bradford-analys. Slutligen späddes 0,5 mg av synaptosomsuspensionen i 10 ml HEPES-buffertmedium och centrifugerades vid 3000ˆ g (5000 rpm i en JA 20.1-rotor) under 10 minuter. Supernatanten kasserades och pellets som innehöll synaptosomer lagrades på is och användes inom 4–6 timmar.

4.4. Glutamatfrisättning

Glutamatfrisättning analyserades med onlinefluorimetri som beskrivits tidigare [45,46]. Synaptosomala pellets återsuspenderades i HEPES-buffertmedium (0,5 mg/ml) och förinkuberades vid 37 ˝C i 10 minuter i närvaro av 16 µM bovint serumalbumin för att binda eventuella fria fettsyror som frigjordes från synaptosomer under förinkubation. En 2-mL alikvot av synaptosomerna överfördes till en omrörd kyvett innehållande 2 mM NADP plus, 50 enheter glutamatdehydrogenas och 1,2 mM CaCl2, och FL-fluorescensen av NADPH mättes i en Perkin-Elmer LS{{ 14}} spektrofluorimeter (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) vid excitations- och emissionsvåglängder på 340 respektive 460 nm. Eftersom synaptosomer inte är mottagliga för elektrisk stimulering, användes kaliumkanalblockeraren 4-aminopyridin för att stimulera glutamatfrisättning. 4-aminopyridin destabiliserar membranpotentialen och tros orsaka repetitiv spontan Na plus kanalberoende depolarisering som nära approximerar in vivo depolarisering av den synaptiska terminalen som leder till aktivering av spänningsberoende Ca2 plus kanaler och neurotransmittorfrisättning [47 ]. Data erhölls med 2 s intervall. En standard av exogent glutamat (5 nmol) tillsattes i slutet av varje experiment. Värdet på FL-fluorescensförändringen som produceras av standardtillsatsen användes för att beräkna det frisatta glutamatet som nanomol glutamat per milligram synaptosomalt protein (nmol/mg). Frisättningsvärden som anges i texten är nivåer som uppnåtts vid steady-state efter 5 min av depolarisering (nmol/mg/5 min). Kumulativa data analyserades med hjälp av Lotus 1-2-3-kalkylblad (IBM, White Plains, NY, USA) och MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).

4.5. Plasmamembranpotential

Plasmamembranpotentialen bestämdes med ett membranpotentialkänsligt färgämne, DiSC3(5) [48]. Synaptosomer återsuspenderades i HEPES-buffertmedium och 2 ml alikvoter överfördes till en omrörd kyvett innehållande 5 µM DiSC3(5) vid 37 ˝C i en Perkin–Elmer LS-55-spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA). Efter att ha låtit blandningen komma i jämvikt under 3 minuter, bestämdes FL-fluorescensen vid excitations- och emissionsvåglängder på 646 respektive 674 nm. Data samlades in med 2 s intervall. Kumulativa data analyserades med användning av MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) och uttrycktes i FL-fluorescensenheter.

4.6. Cytosolic Ca2 plus koncentration ([Ca2 plus ]C)

[Ca2 plus ]C mättes med Ca2 plus-indikatorn fura-2. Synaptosomer (0,5 mg/ml) förinkuberades i HEPES-buffertmedium innehållande 5 µM fura-2 och 0.1 mM CaCl2, under 30 minuter vid 37 ˝C i ett omrört test rör. Efter fura-2-laddning centrifugerades synaptosomer i en mikrocentrifug i 30 s vid 3000ˆ g (5000 rpm). Synaptosomala pellets återsuspenderades i ett HEPES-buffertmedium och den synaptosomala suspensionen omrördes i en termostaterad kyvett i en Perkin-Elmer LS-55-spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA). CaCl2 (1 mM) tillsattes efter 3 minuter och ytterligare tillsatser gjordes efter ytterligare 10 minuter. Fluorescensdata ackumulerades vid excitationsvåglängder på 340 och 380 nm (emissionsvåglängd 505 nm) med 2 s intervall. [Ca2 plus]C (nM) beräknades med hjälp av kalibreringsprocedurer [49] och ekvationer som beskrivits tidigare [50]. Kumulativa data analyserades med användning av MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).

4.7. Western Blotting

Synaptosomer homogeniserades i en lysbuffert (10 mM HEPES-buffert, pH 7,4), 1 procent Triton X-100 och proteashämmareblandning. Lysaten klargjordes genom centrifugering och proteinkoncentrationen bestämdes med användning av ett proteinanalyskit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Lika mängder proteiner separerades genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och överfördes till nitrocellulosamembranet. Membranen blockerades med Tris-buffrad saltlösning som innehöll 5 procent lättmjölk och inkuberades med lämplig primär antikropp (fosfoproteinkinas C (panna), 1:3000, NOVUS Biologicals Inc., Beverly, MA, USA) över natten kl. 4˝C. Efter tre tvättar i Tris-buffrad saltlösning, behandlades membranet sedan med den sekundära pepparrotsperoxidaskonjugerade antikroppen (1:3000) under 1 timme vid rumstemperatur. Membranen tvättades sedan minst tre gånger med Tris-buffrad saltlösning och visualiserades med användning av det förbättrade kemiluminescenssystemet (Amersham, Buckinghamshire, Storbritannien). En alikvot av prover laddades och sonderades med en anti-PKC-antikropp för detektering av PKC som laddningskontroll. Nivån av uttryck eller fosforylering bedömdes genom banddensitet, som kvantifierades med densitometri. Densitometrisk kvantifiering av band analyserades med användning av Syngene-mjukvara (Synoptics, Cambridge, Storbritannien).

4.8. Statistisk analys

Data erhölls från en enda synaptosomal beredning och var inte oberoende av varandra. För att testa betydelsen av effekten av ett läkemedel kontra kontroll användes ett tvåsidigt Students t-test. När en ytterligare jämförelse krävdes (t.ex. om en andra behandling påverkade effekten av echinakosid), användes en enkelriktad ANOVA följt av Tukeys test. Analysen slutfördes via programvaran SPSS (17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Data uttrycks som medelvärde ˘ SEM; signifikans utvärderades till p < 0.05="" för="" alla="" statistiska="">

5. Slutsatser

Detta är den första studien som visar detechinakosidhämmar glutamatfrisättning från cerebrokortikala synaptosomer från råtta genom att minska Ca2 plus inflöde genom Cav2.2 och Cav2.1 kanaler, och denna frisättningsinhibering är sannolikt beroende av undertryckandet av proteinkinas C-vägen, åtminstone delvis. Föreliggande fynd är värdefullt eftersom det ger en ny insikt i verkningsmekanismerna för echinacoside i hjärnan.

Erkännanden:Detta arbete stöddes av ett anslag från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Författarbidrag:Tzu Yu Lin och Su Jane Wang skapade och designade experimenten; Cheng Wei Lu utförde experimenten; Cheng Wei Lu och Shu Kuei Huang analyserade data; Su Jane Wang skrev tidningen.

Intressekonflikt:Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Intressekonflikter: Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Referenser

1. Tu, PF; Wang, B.; Deyama, T.; Zhang, ZG; Lou, ZC Analys av fenyletanoidglykosider avHerba cistancheav RP-HPLC. Acta Pharm. Synd. 1997, 32, 294-300.

2. Dalby-Brown, L.; Barrett, H.; Landbo, AK; Meyer, AS; Molgaard, P. Synergistiska antioxidativa effekter av alkamider, koffeinsyraderivat och polysackaridfraktioner från Echinacea purpurea på in vitro-oxidation av humana lågdensitetslipoproteiner. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 9413-9423. [CrossRef] [PubMed]

3. Dapas, B.; Dall'Acqua, S.; Bulla, R.; Agostinis, C.; Perissutti, B.; Invernizzi, S.; Grassi, G.; Voinovich, D. Immunmodulering förmedlad av en örtsirap som innehåller ett standardiserat Echinacea-rotextrakt: En pilotstudie i friska människor på cytokingenuttryck. Phytomedicine 2014, 21,1406-1410. [CrossRef] [PubMed]

4. He, WJ; Fang, TH; Tu, PF Forskningsframsteg om farmakologiska aktiviteter av echinakosid. Kina J. Chin. Mater. Med. 2009, 34, 476-479.

5. Deng, M.; Zhao, JY; Tu, PF.; Jiang, Y; Li, ZB; Wang, YH Echinacoside räddar SHSY5Y neuronala celler från TNFalfa-inducerad apoptos. Eur. J. Pharmacol. 2004, 505,11-18. [CrossRef] [PubMed]

6. Koo, KA; Sung, SH; Park, JH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC In vitro neuroprotektiva aktiviteter av fenyletanoidglykosider från Callicarpa dichotoma. Planta Med. 2005, 71, 778-780. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinacoside Skyddar mot 6-Hydroxidopamin-inducerad mitokondriell dysfunktion och inflammatoriska svar i PC12-celler genom att minska ROS-produktion. Evid. Baserat komplement. Altern. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

8. Zhu, M.; Lu, C.; Li, W. Övergående exponering för echinakosid är tillräcklig för att aktivera Trk-signalering och skydda neuronala celler från rotenon. J. Neurochem. 2013,124, 571-580. [CrossRef] [PubMed]

9. Geng, X.; Tian, ​​X.; Tu, P.; Pu, X. Neuroprotektiva effekter av echinakosid i mus-MPTP-modellen av Parkinsons sjukdom. Eur. J. Pharmacol. 2007, 564, 66-74. [CrossRef] [PubMed]

10. Wei, LL; Chen, H.; Jiang, Y; Tu, PF.; Zhong, M.; Du, J.; Liu, F.; Wang, L.; Liu, CY Effekter av echinakosid på histiocentrala nivåer av aktiv massa i ocklusionsråttor i mellersta cerebral artär. Biomed. Environ. Sci. 2012, 25, 238-244. [PubMed]

11. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Reversering av vattenhaltiga extrakt avCistanche tubulosafrån beteendemässiga brister i Alzheimers sjukdomsliknande råttmodell: Relevans för amyloidavlagring och central neurotransmittorfunktion. BMC komplement. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, Q.; Gao, J.; Li, W.; Cai, D. Neurotrofiska och neuroräddande effekter av Echinacoside i den subakuta MPTP-musmodellen av Parkinsons sjukdom. Brain Res. 2010, 1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]

13. Meldrum, BS Glutamat som en neurotransmittor i hjärnan: en översyn av fysiologi och patologi. J. Nutr. 2000, 130, 1007S-1015S. [PubMed]

14. Lee, D.; Shim, MS; Kim, KY; Nej, YH; Kim, H.; Kim, SY; Weinreb, RN; Ju, WK Coenzyme Q10 hämmar glutamat excitotoxicitet och oxidativ stress-medierad mitokondriell förändring i en musmodell av glaukom. Undersök. Oftalmol. Vis. Sci. 2014, 55, 993-1005. [CrossRef] [PubMed]

15. Choi, DW Kalcium och excitotoxisk neuronskada. Ann. NY Acad. Sci. 1994, 747,162-171. [CrossRef] [PubMed]

16. Lau, A.; Tymianski, M. Glutamatreceptorer, neurotoxicitet och neurodegeneration. Pflugers. Båge. 2010, 460, 525-542. [CrossRef] [PubMed]

17. Sattler, R.; Tymianski, M. Molekylära mekanismer för glutamatreceptormedierad excitotoxisk neuronal celldöd. Mol. Neurobiol. 2001, 24, 107-129. [CrossRef]

18. Schauwecker, PE Neuroskydd av glutamatreceptorantagonister mot anfallsinducerad excitotoxisk celldöd i den åldrande hjärnan. Exp. Neurol. 2010, 224, 207-218. [CrossRef] [PubMed]

19. Yeganeh, F.; Nikbakht, F.; Bahmanpoui; S.; Rastegar, K.; Namavar, R. Neuroprotektiva effekter av NMDA och grupp I-metabotropa glutamatreceptorantagonister mot neurodegeneration inducerad av homocystein i råtthippocampus: In vivo-studie. J. Mol. Neurosci. 2013, 50, 551-557. [CrossRef] [PubMed]

20. Doble, A. Rollen av excitotoxicitet i neurodegenerativ sjukdom: konsekvenser för terapi. Pharmacol. Ther. 1999, 81,163-221. [CrossRef]

21. Muir, KW Glutamatbaserade terapeutiska metoder: Kliniska prövningar med NMDA-antagonister. Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6, 53-60. [CrossRef] [PubMed]

22. Gonzalez, JC; Egea, J.; del Carmen Godino, M.; Fernandez-Gomez, FJ; Sanchez-Prieto, J.; Gandia, L.; Garcia, AG; Jordan, J.; Hernandez-Guijo, JM Neuroprotectant minocyklin undertrycker glutamaterg neurotransmission och Ca2 plus-signalering i hippocampus neuroner. Eur. J. Neurosci. 2007, 26, 2481-2495. [CrossRef] [PubMed]

23. Lu, CW; Lin, TY; Wang, SJ Memantin undertrycker glutamatfrisättning genom hämning av spänningsberoende Ca2 plus ingång och proteinkinas C i hjärnbarkens nervterminaler från råtta: En NMDA-receptoroberoende mekanism. Neurochem. Int. 2010, 57,168-176. [CrossRef] [PubMed]

24. Wang, SJ; Sihra, TS Icke-kompetitiv metabotropisk glutamat 5-receptorantagonist (E)-2-metyl-6- styryl-pyridin (SIB1893) undertrycker glutamatfrisättning genom hämning av spänningsberoende Ca2 plus inträde i cerebrokortikala nervterminaler hos råtta (synaptosomer). J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309, 951-958. [CrossRef] [PubMed]

25. Dunkley, PR.; Jarvie, PE; Heath, JW; Kidd, GJ; Rostas, JA En snabb metod för isolering av synaptosomer på Percoll-gradienter. Brain Res. 1986, 372,115-129. [CrossRef]

26. Araque, A.; Li, N.; Doyle, RT; Haydon, PG SNARE proteinberoende glutamatfrisättning från astrocyter. J. Neurosci. 2000, 20, 666-673. [PubMed]

27. Dunlop, J. Glutamatbaserade terapeutiska metoder: Inriktning på glutamattransportsystemet. Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6,103-107. [CrossRef] [PubMed]

28. Zucchi, R.; Ronca-Testoni, S. Den sarkoplasmatiska reticulum Ca2 plus kanal/ryanodinreceptor: Modulering av endogena effektorer, läkemedel och sjukdomstillstånd. Pharmacol. Rev. 1997, 49,1-51. [PubMed]

29. Fan, Y.; Li, J.; Zhang, YQ; Jiang, LH; Zhang, YN; Yan, CQ Proteinkinas C delta-medierad cytotoxicitet av 6-Hydroxidopamin via ihållande extracellulär signalreglerad kinas 1/2-aktivering i PC12-celler. Neurol. Res. 2014, 36, 53-64. [CrossRef] [PubMed]

30. Gschwendt, M.; Muller, HJ; Kielbassa, K.; Zang, R.; Kittstein, W.; Rincke, G.; Marks, F. Rottlerin, en ny proteinkinashämmare. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 199, 93-98. [CrossRef] [PubMed]

31. Nicholls, DG; Sihra, TS; Sanchez-Prieto, J. Kalciumberoende och oberoende frisättning av glutamat från synaptosomer övervakas med kontinuerlig fluorometri. J. Neurochem. 1987, 49, 50-57. [CrossRef] [PubMed]

32. Nicoll, RA Kopplingen av neurotransmittorreceptorer till jonkanaler i hjärnan. Science 1988, 241, 545-551. [CrossRef] [PubMed]

33. Wu, LG; Saggau, P. Presynaptisk hämning av framkallad neurotransmittorfrisättning. Trender Neurosci. 1997, 20, 204-212. [CrossRef]

34. Turner, TJ; Dunlap, K. Farmakologisk karakterisering av presynaptiska kalciumkanaler med hjälp av subsecond biokemiska mätningar av synaptosomal neurosekretion. Neuropharmacology 1995, 34, 1469-1478. [CrossRef]

35. Millan, C.; Sanchez-Prieto, J. Differentiell koppling av kalciumkanaler av N- och P/Q-typ till glutamatexocytos i hjärnbarken på råtta. Neurosci. Lett. 2002, 330, 29-32. [CrossRef]

36. Vazquez, E.; Sanchez-Prieto, J. Presynaptisk modulering av glutamatfrisättning riktar sig till olika kalciumkanaler i cerebrokortikala nervterminaler hos råtta. Eur. J. Neurosci. 1997, 9, 2009-2018. [CrossRef] [PubMed]

37. Long, P; Mercer, A.; Begum, R.; Stephens, GJ; Sihra, TS; Jovanovic, JN Nervterminal GABAA-receptorer aktiverar Ca2 plus /Calmodulin-beroende signalering för att hämma spänningsstyrd Ca2 plus inflöde och glutamatfrisättning. J. Biol. Chem. 2009,284, 8726-8737. [CrossRef] [PubMed]

38. Turner, JR; Angle, JM; Svart, ED; Joyal, JL; Säckar, DB; Madara, JL PKC-beroende reglering av transepitelial resistens: roller för MLC och MLC kinas. Am. J. Physiol. 1999, 277, C554-C562. [PubMed]

39. Vaughan, PF; Walker, JH; Peters, C. Regleringen av neurotransmittorutsöndring av proteinkinas C. Mol. Neurobiol. 1998, 18, 125-155. [CrossRef] [PubMed]

40. Coffey, ET; Sihra, TS; Nicholls, DG; Pocock, JM Fosforylering av synapsin I och MARCKS i nervterminaler förmedlas av Ca2 plus-inträde via en Aga-GI-känslig Ca2 plus-kanal som är kopplad till glutamatexocytos. FEBS Lett. 1994, 353, 264-268. [CrossRef]

41. Obrenovitch, TP; Urenjak, J. Ändrad glutamatergisk överföring vid neurologiska störningar: Från hög extracellulär glutamat till överdriven synaptisk effekt. Prog. Neurobiol. 1997, 51, 39-87. [CrossRef]

42. Zhang, D.; Li, H.; Wang, JB Echinacoside hämmar amyloid fibrillering av HEWL och skyddar mot Ap-inducerad neurotoxicitet. Int. J. Biol. Macromol. 2015, 72, 243-253. [CrossRef] [PubMed]

43. Lin, TY; Lu, CW; Wang, CC; Lu, JF; Wang, SJ Hispidulin hämmar frisättningen av glutamat i cerebrokortikala nervterminaler hos råtta. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012, 263, 233-243. [CrossRef] [PubMed]

44. Chang, CY; Lin, TY; Lu, CW; Huang, SK; Wang, YC; Chou, SS; Wang, SJ Hesperidin hämmar glutamatfrisättning och utövar neuroskydd mot excitotoxicitet inducerad av kaininsyra i hippocampus hos råttor. Neurotoxicology 2015,2015,157-169. [CrossRef] [PubMed]

45. Nicholls, DG; Sihra, TS Synaptosomer har en exocytotisk pool av glutamat. Nature 1986, 321, 772-773. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Wang, CC; Kuo, JR; Wang, SJ Dimebon, ett antihistaminläkemedel, hämmar glutamatfrisättning i cerebrokortikala nervterminaler hos råtta. Eur. J. Pharmacol. 2014, 734, 67-76. [CrossRef] [PubMed]

47. Tibbs, GR; Barrie, AP; van Mieghem, FJ; Mc-Mahon, HT; Nicholls, DG Repetitiva aktionspotentialer i isolerade nervterminaler i närvaro av 4-aminopyridin: Effekter på cytosoliskt fritt Ca2 plus och glutamatfrisättning. J. Neurochem. 1989,53,1693-1699. [CrossRef] [PubMed]

48. Akerman, KE; Scott, LG; Hekkila, JE; Heinonen, E. Joniskt beroende av membranpotential och glutamatreceptorlänkade svar i synaptoneurosomer mätt med ett cyaninfärgämne, DiSC2(5). J. Neurochem. 1987, 48, 552-559. [CrossRef] [PubMed]

49. Sihra, TS; Bogonez, E.; Nicholls, DG Localized Ca2 plus-inträde påverkar företrädesvis proteindefosforylering, fosforylering och glutamatfrisättning. J. Biol. Chem. 1992, 267,1983-1989. [PubMed]

50. Grynkiewicz, G.; Poenie, M.; Tsien, RY En ny generation av Ca2 plus-indikatorer med kraftigt förbättrade fluorescensegenskaper. J. Biol. Chem. 1985, 260,3440-3450. [PubMed]