DelⅡ: Dereplication-guidad isolering av nya fenylpropanoid-substituerade diglykosider från Cistanche Salsa och deras hämmande aktivitet på NO-produktion i makrofager

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Tillbaka till del Ⅰ

En 3-metylbutenylgrupp, en aglykonsubstruktur, föreslogs av COZY-korrelationerna av H-2 med H-1a och H-1b och HMBC-korrelationerna mellan H{{ 4}} och H-5 och de olefiniska kolen, vid kC 120,7 (C-2) ​​och 136,4 (C-3). Två sockerdelar etablerades genom NMR-spektraanalys och HPLC-spektraanalys av det sura hydrolysatet, med MS-fragmentmönster. Den absoluta konfigurationen av dem bestämdes vara D-glukos och L-ramnos med hjälp av HPLC-analys av syrahydrolysatet [17]. Dessa sockerdelar definierades som en -glukos och en a-rhamnos genom kopplingskonstanter för de anomera protonerna. 1H-1H COSY-spektrumet visade sekventiella korrelationer från H-13 till H-63 och från H-133 till H-633 (Figur 4).

En nedskiftad glukosproton vid kH 4,70 (H-43) antydde en acylsubstituent på glukos. Från HMBC-spektrumet bekräftade korrelationen mellan H-43 och C-9333 positionen för koffeoylsubstituenten. HMBC-korrelationerna mellan H-13 och C-1 (kC 64,5) och mellan H-33 (kH 3,68) och C-133 (kC 101,2) föreslog positionerna för varje substituent . Följaktligen bestämdes strukturen av 6 som 3-metylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-kaffeoyl- -D- glukos-pyranosid och benämnd cistansalside B.

Cistansalside C (12), ett brunt amorft pulver, bestämdes ha en molekylformel C26H38O13 genom (plus )-HR-ESI-QTOF-MS, som visade en topp vid m/z 581,2213 [M plus Na] plus (beräknat för för C26H38O13Na, 581,2205). En karakteristisk jon vid m/z 163 antydde att en koffeoylsubstituent existerade i strukturen. Fragmentjonerna vid m/z 325 och m/z 471 antydde förekomsten av en ramnosenhet och en glukosenhet.

Jämförelse av NMR-spektra på 12 med de för 6 visade att de var likartade förutom aglykonstrukturen. I NMR-spektra av 12 observerades två parafiniska kol vid kC 38.0 (C-2) och 24.4 (C-3) ​​istället för två olefiniska kol vid kC 12{{16 }}.7 (C-2) och 136.4 (C-3) i aglykonen av 6. De germinala metylgrupperna (kH 0.88) i aglykonen av 12 flyttades uppåt på fältet i förhållande till H-4 och H-5 (kH 1,71 och 1,63) i aglykonen av 6 (tabell 2). Aglykonet av 12 föreslogs vara en 3-metylbutylgrupp, vilket bekräftades av 1H och COSY NMR-spektra. Toppar av 3-metylbutylgruppen observerades vid 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m) , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) och 0,88 (H-4, 5).

Två sockerdelar bekräftades på nytt genom HPLC-analysen av syrahydrolysatet och NMR-spektraanalysen såväl som MS-fragmentmönster. De absoluta konfigurationerna av sockerarterna identifierades som D-glukos och L-ramnos med hjälp av HPLC-analys av syrahydrolysatet [17]. En -glukosdel och en a-rhamnosdel bekräftades genom kopplingskonstanter för de anomera protonerna. 1H-1H COSY-spektrumet visade sekventiella korrelationer från H-13 till H-53, från H-133 till H-333 och från H{{11} } till H-433 (Figur 4).

Positionen för substituenter bekräftades med hjälp av HMBC-analysen. I HMBC-spektrumet är korrelationerna mellan H-13 och C-1 (kC 67,2), mellan H-33 (kH 3,68) och C-133 (kC 101,2) och mellan H-43 (kH 4,70) och C-9333 (kC 165,7) detekterades. Följaktligen fastställdes strukturen för 12 att vara 3-metylbutyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-kaffeoyl- -D-glukos-pyranosid och heter cistansalside C.

Cistansalside D (17), ett amorft brunt pulver, bestämdes ha en molekylformel av C31H38O14 med positiv mod högupplöst ESI-QTOF-MS, som visade en adduktjontopp vid m/z 657,2147 [M plus Na] plus (beräknat för C31H38O14Na, 657,2154). Fragmentjoner inklusive en [M plus H x Aglykon x Rha x Acetyl Glc] plus jon vid m/z 147, en [M plus H x Aglykon x Rha] plus jon vid m/z 351 och en [M plus H x Aglykon] plusjon vid m/z 497 detekterades också. En karakteristisk jon vid m/z 147 antydde att en kumaroylsubstituent var närvarande i dess struktur. Fragmentjonerna vid m/z 351 och m/z 497 antydde förekomsten av en ramnosenhet och en acetylsubstituerad glukosenhet.

Cistansalside fråncistanche ört

13C-NMR-spektrumet avslöjade närvaron av 31 kolatomer. Två anomera protoner vid kH 4,61 (1H, m, H-13) och 4,60 (1H, s, H{{10}}) observerades i 1H- och HSQC-spektra . 1H-NMR-spektrumet indikerade närvaron av en metylgrupp vid 1,97 (3H, s, acetyl-CH3), en trans-olefin vid kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) och 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) och två para-substituerade bensenringar vid kH 7,53 (2H, d, J=6). 9 Hz, H-3333, 5333) och 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}},0 Hz, H-2, 6) och 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H-3, 5) (tabell 2) . Från HMBC NMR-spektrum, korrelationerna mellan ett karbonylkol vid kc 165,5 (C-9333) och H-8333 och mellan H-2333, 6333 och C-7333 (kc 145,4) föreslog en (E)-kumaroylgrupp. HMBC-korrelationen mellan en metylprotontopp och ett karbonylkol vid kc 169,0 bekräftade närvaron av en acetylgrupp.

En 4-hydroxifenylgrupp föreslogs baserat på HMBC-korrelationerna mellan H-3, 5 och kvaternära aromatiska kol vid kC 155,6 (C-4) och 128,6 (C-1) . En hydroxylerad etylgrupp bekräftades av COSY NMR-signalerna vid kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) och 3,54 (IH, m, H-8b). HMBC-korrelationerna mellan H-7 och C-1 (kC 128,6) och C-2, 6 (kC 129,7) föreslog en 4-hydroxifenyletylgrupp, som en aglykonsubstruktur.

Två sockerdelar, föreslagna från MS-fragmentmönster, bekräftades på nytt genom HPLC-analys av syrahydrolysatet och NMR-spektra. D-glukos och L-ramnos klargjordes med hjälp av HPLC-analys av syrahydrolysatet [17]. En -glukosdel och en a-ramnosdel etablerades genom kopplingskonstanter för de anomera protonerna. 1H-1H COSY-spektrumet visade sekventiella korrelationer från H-13 till H-53 och från H-133 till H-633 (Figur 4).

Från 1H-NMR-spektrumet antydde nedfältsförskjutningen av H-23 (kH 4,69) och H-43 (kH 4,80) den acylsubstituerade positionen på glukos. Kopplingarna mellan glukos och två acylgrupper bekräftades av HMBC-korrelationerna mellan H-43 (kH 4,80) och C-9333 och mellan H-23 och karbonylkol i en acetylgrupp (kC 169,0 ). Positionerna för en aglykon och rhamnos gavs av HMBC-korrelationerna mellan H-33 (kH 3,95) och C-1333 och mellan H-8 och C-13. Följaktligen tilldelades strukturen av 17 som 4-hydroxifenyletyl-2-O-acetyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- coumaroyl- -D-glukopyranosid och benämnd cistansalside D.

Cistansalside E (18) isolerades som ett amorft brunt pulver. Dess molekylformel bestämdes vara C31H38O14 genom 13C-NMR-data och den positiva högupplösta ESI-QTOF-MS-toppen vid m/z 657.2166 [M plus Na] plus (beräknat för C31H38O14Na, 657.2154). Dessutom detekterades även fragmentjoner inklusive en koffeoyljon vid m/z 163, en [M plus H x Aglycone x Rha] plus jon vid m/z 367 och en [M plus H x Aglykon]-jon vid m/z 513. Fragmentjonerna antydde förekomsten av en ramnosenhet och en acetylsubstituerad glukosenhet.

1H-NMR-spektrumet antydde närvaron av två anomera protoner vid kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) och 4,60 (1H, s, H-133 ) och två acylsubstituerade glukosprotoner vid kH 4,71 (1H, dd, J=8.9, 8,2 Hz, H-23) och 4,81 (1H, dd, J=9.7 , 9,5 Hz, H-43). 1H- och HMBC-spektra antydde förekomsten av en acetylgrupp vid kH 1,94 (3H, s, acetyl-CH3), en (E)-kaffeoyldel vid kH 7,48 (1H, d, J=15},9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8.1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H-5333) och 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) och en mono-substituerad bensenring vid kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) och 7,20 (1H, m, H-4) (tabell 2). En fenylmetylgrupp, en aglykonsubstruktur, föreslogs av HMBC-korrelationerna mellan H-7 (2H, kH 2,80, m) och C-1 (kC 138,8) och mellan H-7 och C -2, 6 (kC 128,9) och COSY NMR-signalerna för H-7 med H-8a (1H, kH 3,99, m) och H-8b (1H, kH 3,63, m).

Två sockerdelar bekräftades på nytt genom HPLC-analys av syrahydrolysatet och NMR-spektraanalys. De absoluta konfigurationerna av sockerarterna klargjordes med hjälp av HPLC-analys av det sura hydrolysatet, som bekräftades vara D-glukos och L-ramnos [17]. En -glukosdel och en -rhamnosdel etablerades genom kopplingskonstanter för de anomera protonerna. 1H-1H COSY-spektrumet visade sekventiella korrelationer från H-13 till H-53, från H-133 till H-233 och från H{{11} } till H-333 (Figur 4).

Från HMBC-spektrumet, korrelationerna mellan H{{0}} och C-8 (kC 69,4), mellan H-23 och karbonylkol i en acetylgrupp (kC 169,1), mellan H-33 (kH 3,95) och C-133 (kC 102,0) och mellan H-43 (kH 4,81) och C-9333 (kC 165,6) bekräftade placeringen av substituenter i strukturen. Därför bestämdes strukturen för 18 vara fenyletyl-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-kaffeoyl- -D-glukopyranosid och heter cistansalside E.

De flesta av trans-cinnamoylsubstituenterna isomeriserades till cis-isoformen in vitro. Ljus har rapporterats omvandla trans-kanelsyraderivat till cis-isoformer [18,19]. Jämvikten för trans-cis-omvandlingen av cinnamoylsubstituenterna observerades bibehålla ungefär 70 procent av isolaten i trans-isoformen. För olefinprotonerna i cis-formen, toppar vid ungefär 6,90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) och 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) kunde tilldelas i 1H-NMR-spektra, medan toppar vid ungefär 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) och 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) observerades för transformation [20]. I IH-NMR-spektrumet för trans-cis-blandningar observerades toppar för två olefiniska protoner (H-7333 och H-8333) i förhållandet 7:3 (trans:cis). 13C-NMR-toppar i cis-formen liknade de för transformationen.

Effektiva ingredienser från cistanche: acteosider

Alla isolaten testades för deras hämmande effekter på LPS-inducerad NO-produktion i RAW

Alla isolaten testades för deras inhiberande effekter på LPS-inducerad NO-produktion i RAW 264.7-celler. Dexametason användes som en positiv kontroll och dess IC50 var 7.0 uM. Av de testade föreningarna, föreningar 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) och 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) visade måttliga hämmande aktiviteter på inducerbart NO-syntas, medan de andra föreningarna var inaktiva i denna analys (IC50 värden > 100 uM). För att verifiera om dessa föreningar hade cytotoxicitet, mättes cellviabiliteten med användning av MTT-analys. Som ett resultat uppvisade ingen av dem signifikant cytotoxicitet (kompletterande figur S6-1). Dessa fyra föreningar valdes ut för att utvärdera deras inhiberande aktivitet mot NF-λB-vägen i LPS-stimulerade RAW 264.7-celler. Stimulering av RAW 264.7-celler med LPS inducerade fosforyleringen av I入B och NF-入B (p65) efter 0,5 timmars inkubation. Fosforyleringen av NF-入B (p65) reducerades signifikant genom förbehandling med föreningarna 11, 13 och 18, vilket framgår av Western blot-analys (Figur 5). Därför kan föreningarna 11, 13 och 18 utöva antiinflammatoriska effekter via hämning av NF-入B i makrofager.

Figur 5.Effekt av fyra föreningar på fosforylering av I入B och NF-入B (p65) i LPS-stimulerade RAW 264.7-celler. (A) Western blottarna utfördes i LPS och provbehandlade RAW 264.7-celler; (B, C) Immunoblotsignalerna kvantifierades med hjälp av Molecular Analyst/PC densitometrimjukvara (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Densitometrisk analys av fosforylerade isoformer rapporteras. NF-入B i RAW 264.7-cell normaliserades till innehållet av -aktin.

3. Material och Metoder

3.1. Allmänt experiment Procedur

Optiska rotationer mättes med en Jasco P-2000 digital polarimeter (Jasco, Tokyo, Japan). UV-spektra registrerades på en Chirascan plus Circular Dichroism-spektrometer (Chirascan, APL, UK). IR-spektra registrerades med Jasco FT/IR-4200-spektrofotometer. Högupplöst elektrosprayjonisering kvadrupol-time-of-flight masspektrometri (HR-ESI-qTOF-MS) utfördes på en Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS utrustad med Agilent 1260 Infinity-serien (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA), och den använda kolumnen var en Jasco SFCpak Crest C18T-5 kolumn (id 150 4.6 mm, 5 um). MassHunter Workstation Software användes för datainsamling.

1D (1H och 13C) och 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR-spektra erhölls med en Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 och Bruker AVANCE 800 HD-spektrometrar tillsammans med en kryosond (Bruker, Ettlingen, Tyskland). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, i Cistanche Andover, MA, USA) användes som NMR-lösningsmedel och referenstoppar (kH 2,50 och kC 39,5). Kolonnkromatografi (CC) utfördes med användning av Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Sverige) eller Kieselgel 60 silikagel (40–63 um, 230–400 mesh, art. 9385; Merck, Darmstadt , Tyskland). Tunnskiktskromatografi (TLC) utfördes på förbelagda Kieselgel 60 silikagel F254-plattor (Art. 5715; Merck). Fläckar på TLC detekterades med användning av en UV-lampa vid 254 nm och 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Frankrike). Mediumtrycksvätskekromatografi (MPLC) utfördes på en RediSep 120 g silikaflashkolonn (Isco, Lincoln, NE, USA) och Kiesegel 60 silikagel (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck) med användning av en Combiflash följeslagare (Isco). Högtrycksvätskekromatografisystemet (HPLC) var en Gilson HPLC utrustad med en Gilson 321-pump och UV.VIS 151-detektor (Gilson, Middleton, WI, USA), med användning av semi-preparativa ODS-kolonner (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Tyskland; Inno C18 kolumn 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Det analytiska RP-HPLC-systemet var ett Waters 2695 allianssystem med en 996 Photodiode Array (PDA)-detektor (Waters Corp, Milford, MA, USA), och den använda kolonnen var en Hypersil™ BDS C18-kolonn (130 Å, id 150: 4,6) mm, 5 um, Thermo Scientific™). Myrsyra köptes från Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Korea). Lösningsmedel av HPLC-kvalitet köptes från Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Korea). H2SO4, Na2CO3 och förstklassiga lösningsmedel för extraktion, fraktionering och isolering köptes från Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea). L- och D-cysteinmetylesterhydroklorid och o-tolylisothiocyanat köptes från Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan).

3.2. Växt Material

Hela växterna avCistanche salsa, som samlades in från Shinjang Uyghur, importerades genom Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Korea). De identifierades av Prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk University, Seoul, Korea). Kupongprovet (SNUPH2016-03) deponerades i Herbarium of Medicinal Plant Garden, College of Pharmacy, Seoul National University.

3.3. Extraktion och Isolering

De torkade hela växterna avCistanche salsa(5,7 kg) hackades och extraherades tre gånger med MeOH (20 L) vid rumstemperatur med sonikering under 99 min. Efter avlägsnande av lösningsmedlet i vakuum suspenderades det råa extraktet (1,35 kg) i H2O (5 1) och fördelades sedan med EtOAc (5 1). EtOAc-återstoden (55,3 g) separerades i 16 fraktioner (E01-16) på silikagelkromatografi under eluering med CHCl3/MeOH (50:1–0:1, steggradientsystem).

E08 (611,7 mg) utsattes för silikagelmedeltrycksvätskekromatografi (25 g) och eluerades med CHCl3/MeOH (18:1–0:1, steggradientsystem) och gav 11 fraktioner (E08a-k). Från E08g renades föreningarna 13 (0,7 mg) och 18 (0,6 mg) med användning av en Luna 5 um HPLC-kolonn och isokratisk eluering med 28 % aq. MeCN. HPLC-rening (Hypersil GOLD, 25 procent aq. MeCN) av E08h (138,5 mg) gav föreningar 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) och 17 (4,9 mg).

E09 (1,15 g) renades ytterligare på en silika-MPLC-kolonn (20 g) under eluering med CHCl3/MeOH (10:1–0:1, steg- gradientsystem) för att ge 11 delfraktioner (E09a-k). E09e (398,7 mg) utsattes för Sephadex LH-20 (MeOH) och gav åtta subfraktioner (E09e1-8). E09e6 renades därefter med användning av en Hypersil GOLD HPLC-kolonn (22 % aq. MeCN) för att ge förening 11 (0,4 mg). Från E09e7 renades förening 5 (0,6 mg) genom isokratisk eluering från en Luna 5 um HPLC-kolonn med 40 % aq. MeOH.

El0 (1,20 g) separerades i nio fraktioner (E10ai) på Sephadex LH-20-kolonn under eluering med MeOH. Från El0g (147,5 mg), isolerades föreningarna 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) och 15 (5,0 mg) genom HPLC-separation (Inno, 23 procent aq. MeCN). Fraktion E10h (470,0 mg) renades på en Hypersil GOLD-kolonn genom isokratisk eluering (40 % aq. MeOH) för att ge föreningarna 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) och 16 (3,0 mg).

Ell (2,96 g) utsattes för Sephadex LH-20 under eluering med MeOH för att ge nio fraktioner (Ella-i). E11e separerades med Sep-Pak C18-patron som eluerade stegvis med 10 procent, 20 procent, 30 procent, 50 procent och 100 procent aq. MeOH för att ge sju fraktioner (E11e1-7), följt av Luna 5 um HPLC (28 procent aq. MeCN) för att ge föreningarna 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) och 12 (1,2 mg).

E12 (19,0 g) utsattes för silika MPLC (120 g) med användning av ett CHCl3/MeOH steggradientsystem för att ge sex fraktioner (18:1–0:1 E12a-f). E12f kromatograferades på en Sephadex LH-20-kolonn (MeOH), vilket gav sju fraktioner (E12f1-7). HPLC-rening (Hypersil GOLD, 25 procent aq. MeCN) av E12f7 gav förening 2 (3,3 mg). Alla lösningsmedel som användes för HPLC var 0,05 procent myrsyrabuffert. Den vanliga flödeshastigheten för HPLC- och MPLC-kromatografi var 3 respektive 40 ml/min.

3.4.Karakterisering

Cistansalside A (5): brunt amorft pulver; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (ren) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) och 13C-NMR (200 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (beräknat för C30H38O14Na, 645,2154).

Cistansalside B (6): brunt amorft pulver; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (ren) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR (500 MHz) och 13C-NMR (125 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (beräknat för C26H36O13Na, 579,2048).

Cistansalside C (12): brunt amorft pulver; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (ren) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) och 13C-NMR (200 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (beräknat för C26H38O13Na, 581,2205).

Cistansalside D (17): brunt amorft pulver; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (ren) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1H-NMR (400 MHz) och 13C-NMR (75 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2147 (beräknat för C31H38O14Na, 657,2154).

Cistansalside E (18): brunt amorft pulver; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (ren) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) och 13C-NMR (200 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2166 (beräknat för C31H38O14Na, 657,2154)

3.5.HPLC-QTOF-MS Analys

Kromatografisk masspektrometrianalys utfördes på ett Agilent 1260 Infinity series LC-system (Agilent Technologies, Inc., USA). Den analytiska kolumnen var en SFCpak Crest C18T-5 kolumn (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japan). Den mobila fasen bestod av 0,1 procent (v/v) myrsyra i MeCN (A) och vatten (B) med en gradienteluering på 0–35 min (23 procent A), 35–45 min ( 23–28 procent A), 45–75 min (28 procent A) och 75–80 min (90 procent A). Flödeshastigheten hölls vid 0,3 ml/min. Absorbansen mättes vid 320 nm. Betingelserna för ESI-källan var följande: torkgas (N2) flödeshastighet, 10 l/min; torkgastemperatur, 350 grader; nebulisator, 30 psig; mantelgasflöde, 12,0 l/min; mantelgastemperatur, 350 grader; kapillär, 4000 V; skummare, 60 V; oktapol RF, 750 V; fragmentorspänning, 180 V; positivt läge. Systemet drevs under Masshunters arbetsstationsprogramvara. Massintervallet sattes till m/z 50–1000.

3.6. Syra Hydrolys

Föreningar hydrolyserades med användning av 1 N H2SO4 (100 uL) upphettad med ett vattenbad vid 90 grader i 2 timmar, neutraliserades sedan med mättad vattenlösning av Na2CO3. Efter att lösningarna torkats under en ström av N2, löstes produkterna och standardsocker (D-Glc, L-Glc, L-Rha) i pyridin (100 ul) innehållande L-cystein-metylesterhydroklorid (0,5 mg). Ett L-ramnosprov löstes i pyridin (100 uL) innehållande D-cysteinmetylesterhydroklorid (0,5 mg). Efter det värmdes de till 60 grader i 1 timme. Lösningarna behandlades med 1 uL (1,11 mg) o-tolylisothiocyanat, som värmdes igen vid 60 grader under 1 timme. Varje slutlig blandning analyserades direkt med analytisk RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18-kolonn, 17 procent vattenhaltig MeCN, 0,8 ml/min, 40 min, 35 grader). tR för toppen vid 21,9 och 40,4 min sammanföll med den för tiokarbamoyltiazolidinderivatet av D-glukos respektive L-ramnos.

3.7. Cell Kultur

Murina makrofager, RAW 264.7, erhölls från Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Daejeon, Korea) och odlades i RPMI-medium innehållande 10 procent fetalt bovint serum och 100 U/ml penicillin/streptomycinsulfat. Celler inkuberades i en fuktad 5-procentig CO2-atmosfär vid 37 grader.

3.8.Droger och kemikalier

RPMI, penicillin och streptomycin köptes från HyClone (Logan, UT, USA). Bovint serumalbumin och LPS köptes från Sigma (St. Louis, MO, USA).

3.9.Mätning av NO-produktion

Nitritkoncentrationen i odlingsmediet mättes som en indikator på NO-produktion enligt Griess-reaktionen. Cellerna såddes vid 2:105 celler/brunn i 96-brunnsodlingsplattor. Efter förinkubation av RAW 264.7-cellerna i 18 timmar förbehandlades cellerna med föreningar (50 uM, 10 uM, 5 uM eller 1 uM) och stimulerades med LPS (500 ng/ml) i 24 h. Testföreningar lösta i DMSO. Celler behandlades också med 0,05 % DMSO som vehikelkontroll. RAW 264,7-celler (2: 105 celler/brunn) odlades i 96-brunnsplattor med användning av RPMI utan fenolrött och förbehandlades med prover i 0,5 timmar. Cellulär NO-produktion inducerades genom tillsats av 500 ng/ml slutkoncentration LPS och en 24 timmar lång inkubation. Efter inkubation blandades 100 uL konditionerat medium med samma volym Griess-reagens och inkuberades under 15 min. Absorbansen av blandningen vid 540 nm mättes med en ELISA mikroplattläsare (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). De erhållna värdena jämfördes med de för standardkoncentrationer av natriumnitrit löst i RPMI, och koncentrationerna av nitrit i det konditionerade mediet av provbehandlade celler beräknades.

3.10.3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys för cellviabilitet

Celler såddes i {{0}}brunnsplattor med en densitet av 5:104 celler/brunn och inkuberades med serumfritt medium i närvaro av prover. Testföreningar lösta i DMSO. Celler behandlades också med 0,05 % DMSO som vehikelkontroll. Efter inkubation i 24 timmar tillsattes 10 uL MTT (5 mg/ml i saltlösning) och inkubationen fortsatte i ytterligare 4 timmar. Mitokondriellt succinatdehydrogenas i levande celler omvandlar MTT till synliga formazankristaller under inkubation. Formazankristallerna solubiliserades sedan i dimetylsulfoxid och absorbansen mättes vid 540 nm med användning av en enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) mikroplattläsare (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Relativ cellviabilitet beräknades jämfört med absorbansen för den obehandlade kontrollgruppen. Alla experiment utfördes i tre exemplar.

3.11.Immunoblotanalys

Proteinuttryck utvärderades genom western blotting enligt standardförfaranden. Kortfattat odlades RAW264.7-celler i 6{{20}} mm odlingsskålar (2:106/ml), följt av förbehandling av 50 uM föreningar . Cellerna tvättades två gånger i iskall PBS (pH 7,4), cellpelletarna återsuspenderades i lysbuffert på is under 15 minuter, och cellrester avlägsnades sedan genom centrifugering. Proteinkoncentrationen bestämdes med Bio-Rad proteinanalysreagens enligt tillverkarens instruktioner. Protein (20–30 ug) blandades 1:1 med 2: provbuffert (20 procent glycerol, 4 procent SDS, 10 procent 2- ME, 0,05 procent bromfenolblått och 1,25 M Tris [pH 6,8]), laddade på 8 eller 15 procent SDS-PAGE-geler och kördes vid 150 V under 90 min. Cellulära proteiner överfördes till Immunoblot-polyvinylidendifluoridmembran (Bio-Rad) med användning av ett Bio-Rad halvtorrt överföringssystem enligt tillverkarens instruktioner. Membranen inkuberades sedan över natten med respektive p-NF-入B, NF-入B, pI入B och -aktin primära antikroppar (Abcam, Cambridge, Storbritannien) i Tris-buffrad saltlösning innehållande 5 procent skummjölk och 0,1 procent Tween 20. Följande dag tvättades blottarna tre gånger med Tris-buffrad saltlösning (0,1 procent Tween 20) och inkuberades i 1 timme med en HRP-konjugerad sekundär anti-IgG-antikropp (utspädd 1:2000–1 :20 000). Blotterna tvättades igen tre gånger med Tris-buffrad saltlösning (0,1 procent Tween 20), och immunoreaktiva band utvecklades med användning av det kemiluminescerande substratet ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).

3.12.Statistisk analys

Experimentella data presenteras som medelvärde för SEM. Nivån av statistisk signifikans bestämdes genom variansanalys (ANOVA) följt av Dunnetts t-test för multipla jämförelser.p Värden mindre än 0.05 ansågs signifikanta.

Cistanche salsa extrakt

4. Slutsatser

I denna studie isolerade och klargjorde vi strukturerna för fem nya fenylpropanoid-substituerade glykosider, benämnda cistansalside AE ​​(5, 6, 12, 17 och 18), förutom att isolera och identifiera 13 kända föreningar, med hjälp av en dereplikationsstrategi. De kända föreningarna bestämdes vara lipedosid AI (1) [21], 23-acetylakteosid (2) [22], issocistanosid C (3) [15], osmanthusid B (4) [21], epimeridinosid A ( 7) [15], cistanosid D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubulosid E (10) [16], cistanosid M (11) [15], isomartynosid (13) [24], salsaside C (14) [6], jionosid C (15) [25] och salsaside F (16) [6]. Deras strukturer etablerades genom analys av omfattande spektroskopiska data och genom jämförelse med rapporterade data i litteraturen. Det bekräftades att preliminärt förutsagda strukturer av fenylpropanoid-substituerade glykosider var korrekt matchade till deras verkliga strukturer.

Fördelen med Cistanche salsaextrakt

Referenser

1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Undertryckande av SOS-inducerande aktivitet av Trp-P-1 av fettsyror från Cistanche-salsa i Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu-testet. Nat. Driva. Lett. 1997, 10, 261-265. [CrossRef]

2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Anti-spridningseffekter av Cistanches salsa på utvecklingen av benign prostatahyperplasi. Burk. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]

3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Rapid Discrimination of Herba Cistanches genom flerstegs infraröd makrofingeravtryck kombinerat med mjuk oberoende modellering av klassanalogi (SIMCA). Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]

4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Differentiering av Herba Cistanches genom fingeravtryck med högpresterande vätskekromatografi-diod array-detektion-masspektrometri. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Studier av Cistanchis Herbas beståndsdelar. V. Isolering och strukturer av två nya fenylpropanoidglykosider, cistanosider E och F. Chem. Pharm. Tjur. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]

6. Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Nya glykosider från Cistanche salsa. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]

7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Kompositionsstudie av fenoliska föreningar av Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, som växer i Republiken Kazakstan. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.

8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Förbättrad ackumulering av fenyletanoidglykosider genom prekursormatning till suspensionskultur av Cistanche-salsa. Biochem. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]

9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsaextrakt verkar på samma sätt som proteinbundet

polysackarid-K (PSK) på olika typer av cellinjer. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.

10. Tian, ​​X.-F.; Pu, X.-P. Fenyletanoidglykosider från Cistanches salsa hämmar apoptos inducerad av 1-metyl-4-fenylpyridiniumjon i neuroner. J. Etnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]

11. Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Nya koncept, experimentella tillvägagångssätt och strategier för dereplication för upptäckten av nya fytoöstrogener från naturliga källor. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]

12. De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Dereplication-guided isolering av depsides theaflavins ST och lecanora DF från den endofytiska svampen Setophoma sp. Phytochemistry 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]

13. Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Antiproliferativa och antiplasmodiella föreningar från utvalda Streptomyces-arter. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]

14. Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Dereplication-guided isolering av nya leverskyddande triterpenoid saponiner från Celosiae Semen genom högpresterande vätskekromatografi kopplat med elektrosprayjonisering tandem kvadrupol-time-of-flight masspektrometri. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]

15. Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. LTQ-Orbitrap-baserad strategi för traditionell kinesisk medicin riktad klassupptäckt, identifiering och hennes omics-forskning: En fallstudie på fenyletanoidglykosider i tre olika arter av Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]

16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Beståndsdelarna i Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Isolering och strukturer av en ny fenyletanoidglykosid och en ny neolignanglykosid. Chem. Pharm. Tjur. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]

17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Enkel diskriminering av aldosenantiomerer genom omvänd fas HPLCistancheChem. Pharm. Tjur. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]

18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Studie av cis-kanelsyra i Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]

19. Kahnt, G. Trans-Cis-jämvikt av hydroxikanelsyror under bestrålning av vattenlösningar vid olika pH. Phytochemistry 1967, 6, 755–758. [CrossRef]