DEL ETT Echinakosid ökar spermiemängden hos råttor genom att rikta in sig på den hypotalamiska androgenreceptorn

Hur stimulerar echinakosid östrogen och ökar antalet spermier?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Manlig infertilitet är ett stort hälsoproblem med en uppskattad prevalens på 4,2 procent av manlig infertilitet över hela världen. Vårt tidiga arbete visade att Cistanche-extrakt skyddar mot spermieskador hos möss och detechinakosid(ECH) är en av de viktigaste aktiva komponenterna. Här redovisar vi en väsentlig roll förECH, en naturlig produkt som vänder eller skyddar mot oligo som aspermi hos råttor.ECHanalyserades med HPLC, kvantiteten och kvaliteten på spermier utvärderades och hormonnivåerna bestämdes genom radioimmu-sorbentanalys. ECH reducerade nivåer av androgenreceptor (AR) och nyckelsteroidogena-relaterade gener som bestäms av Western blot och qPCR-analys. Samspelet mellanECHoch AR utvärderades genom indirekt ELISA och molekylär dockning. Resultaten visar att ECH kombinerat med hypotalamisk AR i fickan på Met-894 och Val-713 hämmar överföringen av AR fråncytoplasman till kärnor i hypotalamus. Medan negativ återkoppling av könshormonreglering hämmades, stimulerades positiv återkoppling för att öka utsöndringen av luteiniserande hormon och testosteron, vilket därefter ökade mängden spermier. Sammantaget visar dessa dataden därECHblockerar AR-aktivitet i hypotalamus för att öka mängden spermier och skydda mot oligo aspermi hos råttor.

För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

Produktionen av testosteron i testikelceller regleras starkt av hypotalamus-hypofys-gonadaxeln (HPG) genom att bilda en homeostatisk återkopplingsslinga1. Gonadotropin-frisättande hormon (GnRH), som utsöndras av hypotalamus, kan stimulera utsöndringen av luteiniserande hormon (LH) från hypofysen, vilket ytterligare stimulerar testosteronproduktionen i testiklarnas Leydig-celler. Testosteron biosyntetiseras av en serie steroidogena enzymer. Som en av huvudvägarna kan steroidogent akut regulatoriskt (StAR) protein transportera kolesterol från intracellulära källor in i mitokondrierna2 där det exponeras för kolesterolsidokedjeklyvningsenzym (CYP11A1), 3 -hydroxisteroiddehydrogenas (HSD3), { {10}}hydroxylas (CYP17A1) och 17-hydroxisteroiddehydrogenas (HSD 17 ) som katalyserar omvandlingen av kolesterol till testosteron3,4. Testosteron matas sedan negativt tillbaka till HPG-elementet för att nedreglera ytterligare LH-utsöndring på ett dosberoende sätt.

Effekten av testosteron på HPG-axelns återkopplingsslinga uppstår genom bindning till androgenreceptorn (AR), som finns i både hypotalamus och hypofysen5. Hos mössen gör ablation av AR och minimal testosteronproduktion att nivåerna av LH och follikelstimulerande hormon (FSH) ökar6, vilket tyder på att AR deltar i regleringen av den negativa matningsslingan. Den klassiska genomiska mekanismen för testosteronsignalering uppstår när testosteron diffunderar in i cellen och binder till AR. Detta ligand-receptorkomplex translokeras sedan till kärnan där det binder till androgenresponselement (ARE) i de regulatoriska regionerna av testosteronresponsiva gener för att modifiera deras translokation. Testosteron inducerar också den icke-klassiska vägen för steroidhormonverkan, kännetecknad av snabba händelser som leder till aktivering av cytosoliska signalkaskader som normalt utlöses av tillväxtfaktorer7,8. Klassiska och icke-klassiska testosteronvägar bidrar båda till att upprätthålla spermatogenes och fertilitet. Funktionen av AR är dock viktigare i den klassiska vägen eftersom testosteron verkar för att öka spermiekvaliteten.

Echinacoside(ECH) är en av de bioaktiva komponenterna som härrör från medicinalväxtarterna Echinacea9 och Cistanche10. Med ett brett spektrum av farmakologiska aktiviteter är extrakt av Echinacea ett av de mest populära växtbaserade kosttillskotten i Europa och USA, främst på grund av deras antioxidantegenskaper11 och deras förmåga att förebygga förkylning12. Intressant,Cistancheextrakt ochECHhar traditionellt använts som ett toniskt medel för att bota reproduktiv dysfunktion och för att öka manlig sexuell aktivitet i traditionell kinesisk medicin10. Vissa OTC-produkter av Cistanche-extraktion har utvecklats som näringstillskott och blir allt populärare på hälsokostmarknaderna i Kina och några andra asiatiska länder (China Food and Drug Administration)13. Men de underliggande mekanismerna förECHåtgärder förblir oklara. Manlig infertilitet är ett stort hälsoproblem med en uppskattad prevalens på 4,2 procent av manlig infertilitet i världen14. Diagnosen av manlig infertilitet baseras för närvarande på studien av spermiekvalitet inklusive analys av sädesparametrar som spermiekoncentration, motilitet och morfologi15. Den östrogenliknande bisfenol A (BPA) är en utbredd miljöförorening som har studerats för dess inverkan på manlig fertilitet hos flera djurarter och människor16. BPA stör den hypotalamus-hypofys-gonadala axeln, hämmar uttrycket av testikulära steroidogena enzymer och syntesen av testosteron hos hanungarna17, vilket orsakar ett tillstånd av hypogonadotrop hypogonadism18. I denna studie undersöker vi effekterna avECHpå spermiekvalitet och hormonnivåer. Dessutom valdes BPA som ett spermieskademodellmedel för att ytterligare studera den skyddande effekten avECHmot dålig spermiekvalitet.

Resultat ECH ökar spermiemängden. Antalet spermier i cauda epididymis, spermiers viabilitet och spermiemotilitet visas i Tabell 1. Behandling med 80 mg/kg ECH och 15 mg/kg testosteronpropionat (TP) ökade signifikant antalet epididymala spermier. Det fanns dock ingen signifikant skillnad i spermiers viabilitet och spermiers rörlighet.

ECH ökar testosteron- och LH-nivåerna i serum, encefalon plus hypofys och testiklar. ECH-behandling ökade avsevärt LH-nivåerna i serum, encefalon plus hypofysen och testiklarna (Fig. 1A). I ECH(H)-gruppen ökade LH-nivåerna signifikant med 1.1-faldigt i serum, 1.4-faldigt i encefalon plus hypofys och 1.2-faldigt i testiklarna. Testosteron ökade signifikant med 1,5 och 1,3-faldigt i encefalon plus hypofys respektive testiklar, men inte i serum efter ECH(H)-behandling. Efter TP-behandling ökade testosteronnivåerna signifikant med 1,6, 1,8 och 1,4-faldigt i serum, encefalon plus hypofys och testiklar.

ECH increased steroidogenic enzyme gene expression. ECH significantly increased the expressions of key steroidogenic enzymes in the testis (Fig. 1B). The mRNA levels of CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2, and HSD17β in the ECH(H) group were increased more than 3-fold, while the levels of StAR mRNA showed no significant differences with all ECH treatments (p>0.05). TP förändrade inte uttrycket av CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 och HSD17 signifikant. Detta återspeglas i en omfattande värmekartaanalys av effekten av ECH på steroidogent enzymuttryck, vilket indikerar att ECH signifikant ökade mRNA-nivåerna av CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 och HSD17, och särskilt HSD3 1/ 2 (Fig. IC).

ECH kan passera blod-hjärnbarriären och i mindre utsträckning blod-testikelbarriären. För att utvärdera androgenåterkopplingsslingan vid HPG-axeln, utvärderades förmågan hos ECH att komma in i hypotalamus i en serie PK-studier. ECH-koncentrationer detekterades i hypotalamus efter 12 timmars enstaka oral administrering av 30mg/kg ECH, och ECH visade markant hypotalamuspenetrans med medelhypothalamus/plasmaförhållandet på 33,92 procent (Fig. 2A). Te T1/2-värdena var 2,61±0,42 timmar och 1,88±0,22 timmar i plasma respektive hypotalamus (Fig. 2B). Emellertid upptäcktes mycket begränsad åtkomst av ECH till testiklarna med hjälp av HPLC. Koncentrationerna av ECH i testiklarna var 0.083 ug/mL, 0,043 ug/mL och 0,028 ug/mL vid 0,5 h, 1 h respektive 1,5 h efter behandling .

ECH minskar hypotalamisk AR-translokation till kärnan. För att testa effekten av ECH på AR-translokationen bestämdes uttrycket av AR i cytoplasman och kärnan i testiklarna och hypotalamus med hjälp av western blot-analys. Som visas i Fig. 3A nedreglerade ECH AR-protein i hypotalamiska kärnor med fem gånger jämfört med kontrollgruppen. Behandling med enzalutamid, en AR-hämmare, minskade nivåerna av AR-protein i hypotalamuskärnor med 4,8-faldigt. Noterbart var cytoplasmatisk AR högre med ECH-behandling och enzalutamidbehandling än kontroller, vilket tyder på att ECH blockerar AR-transport från cytoplasman till kärnan i hypotalamus. Som förväntat hämmar ECH inte AR-transport från cytoplasman till kärnan i testiklarna (Fig. 3B).

ECH ökade uttrycket av HPG-axelrelaterade gener. ECH ökade signifikant uttrycken av LH , LHR, GnRH 1 och Gnrhr i blandningspoolerna av encefalon plus hypofys, men det fanns ingen signifikant skillnad i GnRH 1-nivåer efter TP-behandling. Värmekartaanalysen visar att uttrycken av GnRH 1 och LH var högst bland HPG-axelrelaterade gener.

AR är ett mål för ECH. För att bekräfta sambanden mellan ECH och AR syntetiserades ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) framgångsrikt (Fig. 5A, B). Molekylvikten för ECH-OVA är större än OVA, så de har olika rörlighetshastigheter (Fig. 5A), och absorbanstoppen för ECH-OVA är mellan ECH och OVA (Fig. 5B).

vilket tyder på att ECH framgångsrikt konjugerats till OVA. Indirekta ELISA-resultat (Fig. 5C) visar att anti-AR-antikropp kan detektera AR-protein som finns i brunnar som innehåller ECH-OVA (indikerat med anti-OVA-antikropp) vilket tyder på att ECH kan binda till AR-protein. ECH kombineras med AR-ficka av Met-894 och Val-713. Förening ECH dockades till AF2-stället på ytan av den humana AR, och det teoretiska bindningssättet för ECH och AR visades i Fig. 5D. Compound ECH antog en kompakt konformationsbindning vid fickan av den mänskliga AR. De två fenylgrupperna av ECH binder till den hydrofoba domänen av AR-fickan och bibehåller nära hydrofoba kontakter med resterna Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 och Ile-898, medan de andra två sidorna av ECH var placerade vid ingången till fickan och fick endast ett fåtal kontakter. Detaljerad analys visade att både Met-894 (bindningslängd: 2,4Å) och Val-713 (bindningslängd: 2,7Å) bildade vätebindningar med hydroxy1-grupperna i ECH, vilket var den huvudsakliga interaktionen mellan ECH och mänsklig AR. ECH dämpar BPA-inducerad reproduktionsskada. För att undersöka effekten av ECH på reproduktionsskada undersöktes spermiekvaliteten och nivåerna av könshormoner och steroidogena enzymer i BPA-inducerade möss. Som visas i fig. 6 minskade BPA-behandling signifikant antalet spermier och spermiers rörlighet med 26,5 procent respektive 39,2 procent. ECH-administration förhindrade minskningen av antalet spermier och spermiers rörlighet med 35,5 procent respektive 30,1 procent. BPA-administrering resulterade också i en signifikant minskning av LH- och T-utsöndring, och ECH ökade avsevärt nivåerna av LH och T med 24,1 procent respektive 18,3 procent jämfört med enbart BPA-behandling (Fig. 6A, B). mRNA-nivåerna av StAR, CYP17A1, 3 -HSD och 17 -HSD i BPA-ECH-behandling ökade signifikant jämfört med BPA-behandling (Fig. 6C, D).