Del 2: Echinacoside skyddar mot MPP plus -Inducerad neuronal apoptos via ROS/ATF3/CHOP Pathway Regulation

EchinacosideSkyddar mot MPP plus -inducerad neuronal apoptos via ROS/ATF3/CHOP Pathway Regulation

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Snälla klicka här till del 1

Snälla klicka här till del 3

Cistanche echinacosidehar antioxidantegenskaper

Immunofluorescensfärgning

1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, eller en kombination av MPP? och ECH. Cellerna inkuberades sedan i en blockerande buffert (3 procent BSA i PBS) vid rumstemperatur (RT) under 30 min. Sedan späddes anti-ATF3-, anti-CHOP- eller anti-klyvda kaspas 3-antikroppar till 1:100 i blockerande buffert (1 procent BSA i PBS med 0,3 procent Triton X-100) och inkuberades över natten vid 4C. Efter att ha tvättats tre gånger med PBS, inkuberades cellerna med Alexa 488-get anti-kanin IgG (Life Technologies, Carlsbad, CA) vid RT för

1 h. Kärnor färgades med Hoechst 33342. Bilder togs med ett konfokalmikroskop (Leica SP8, Wetzlar, Tyskland).

Terminal deoxinukleotidyltransferasmedierad dUTP Nick-End-märkning (TUNEL) analys

Vi färgade var tionde koronala sektion (totalt 14–15) genom SNc från bregma -2.92 nm till -3.64 mm.

Fyra typiska sektioner genom SNc på samma nivå i varje grupp användes för TH- och TUNEL-räkningar [10]. TUNEL-analyser utfördes för att analysera apoptos i vävnadssnitt med ett in situ celldödsdetektionskit (Roche, Rotkreuz, Schweiz), enligt tillverkarens instruktioner. Efter DNA-märkning användes sektioner för immunofluorescensfärgning med anti-TH-antikropp och bilder togs med ett konfokalmikroskop (Leica SP8, Wetzlar, Tyskland). Efter avgränsning av SNc vid låg förstoring (10 9 mål) enligt mushjärnatlasen [20], räknades de TH-positiva cellerna och TH/TUNEL dubbelpositiva celler vid en högre förstoring ({{7} } mål) av två observatörer som är blinda för behandlingen. Förhållandet mellan TH/TUNEL dubbelpositiva celler och TH-positiva celler beräknades.

Cistancheechinacoside harantiinflammatoriskegenskaper

Statistisk analys

Alla data presenteras som medelvärde ± SD. Envägs ANOVA följt av post hoc-analys med Tukeys HSD och Student–Newman–Keuls multipla jämförelsetest utfördes för statistiska ändamål. Ett värde på P \ 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.

Resultat

ECH minskar ROS-produkter och dämpar

MPP1-Inducerad apoptos

ECH har visat sig skydda neuroner från apoptos i djurmodeller, samt minska nivåerna av pro-inflammatoriska cytokiner i neuroblastomceller [12]. Det är dock fortfarande oklart om ECH direkt modulerar den neuronala apoptos inducerad av MPP?. Våra data visade att ECH inte påverkade spridningen eller döden av SH-SY5Y-celler (Fig. 1B), och deras morfologi förblev oförändrad (Fig. 1C). Intressant nog, efter exponering av SH-SY5Y-celler för MPP?, ökade överlevnaden på ett dosberoende sätt efter ECH-behandling (10–40 lg/ml) (Fig. 1B, C).

Tidigare studier har visat att MPP? hämmar specifikt elektrontransportkedjan i mitokondrier och är också associerad med ROS-generering [6, 21]. Genom att använda DCFH-DA som en fluorescerande sond för att bedöma förändringar i ROS-nivåer fann vi att ECH markant undertryckte den MPP?-inducerade ROS-genereringen (Fig. 2A). Konfokalmikroskopi visade att de minskade ROS-produkterna var associerade med ECH-nivåer (Fig. 2C). ECH visade sig också skydda cellmembranet mot ROS och minska MDA-nivåerna, slutprodukten av lipidperoxidation (Fig. 2B). Tagen tillsammans,

ECH främjar cellöverlevnad genom att minska MPP?-inducerade ROS-produkter i neuroner.

ECH undertrycker ROS-stressrelaterat/MPP1-inducerat genuttryck och ökar GDNF

Uttryck i MPP1-behandlade celler

ROS-produkter har visat sig stimulera det ovikta proteinsvaret och inducera uttrycket av stressrelaterade gener, inklusive ATF3, ATF4 och CHOP [22]. ATF3 och CHOP spelar en särskilt viktig roll i stressinducerad neuronal apoptos [9, 23]. Onormalt uttryck av a-synuklein är också en av de kritiska markörerna i PD-patologi [2]. Med hjälp av qRT-PCR analyserade vi uttrycket av ATF3, CHOP, SNCA och gliacellinjehärledd neurotrofisk faktor (GDNF) i MPP? cellmodell och fann att MPP? signifikant förbättrat uttrycket av ATF3, CHOP och SNCA jämfört med PBS-kontrollgruppen. ECH påverkade inte uttrycket av dessa gener i SH-SY5Y-celler som inte behandlades med MPP?. ECH upphävde emellertid deras MPPa-inducerade uttryck (Fig. 3). Dessutom MPP? undertryckte uttrycket av GDNF signifikant i SH-SY5Y-celler, men ECH vände delvis detta fenomen (Fig. 3B).

ECH hämmar MPP1-inducerad kaspas-3-aktivering i SH-SY5Y-celler

Höga nivåer av ATF3 och CHOP främjar direkt neuronal apoptos [9, 23]. Våra data visade att ECH hämmade ATF3- och CHOP-uttryck på ett dosberoende sätt (Fig. 4A). ECH blockerade också MPP?-inducerat kaspas-3

aktivitet (Fig. 4A, B). Immunofluorescensanalys av den klyvda formen av kaspas-3 visade vidare att ECH markant minskade uttrycket av klyvt kaspas-3-protein i MPP?-behandlade celler (Fig. 4C).

ECH reverserar MPP1-inducerad ATF3- och CHOP-ackumulation i SH-SY5Y-celler

Efter exponering för miljögifter lokaliseras ATF3- och CHOP-proteiner i cytoplasman och kärnan [24, 25], och detta leder till apoptos. Våra resultat antydde att MPP? behandling ökade ATF3- och CHOP-uttrycket i kärnan, och ECH dämpade effektivt denna process (Fig. 5A, B). Western blotting-analys visade att MPP? markant ökade nivåer av både proteiner i cytoplasman och kärnan. Intressant nog upphävde ECH MPP? effekter och undertryckt ATF3- och CHOP-ackumulering i kärnan (Fig. 5C–E).

ATF3 spelar en kritisk roll i MPP1-inducerad apoptos i SH-SY5Y-celler

ATF3 har visat sig inducera apoptos i SH-SY5Y-celler [23], och resultaten från denna studie indikerar att ECH signifikant undertrycker ATF3-mRNA och proteinuttryck inducerat av MPP? i dessa celler. Rollen för ATF3 i apoptos och ECH-skydd av cellöverlevnad förblev dock oklart. Så vi använde litet hårnåls-RNA (shRNA) specifikt för ATF3 för att undersöka detta och fann ingen skillnad i livsduglighet mellan ATF3-knockdowngruppen och kontrollgruppen under normala förhållanden (Fig. 6A). Men ATF3-dämpning eller ECH-behandling räddade signifikant de morfologiska förändringarna som inducerades av MPP? (Fig. 6B). ATF{11}}knockdown-cellerna hade högre livskraft än kontrollgruppen efter exponering för MPP? (Fig. 6C). Proteinnivåerna av CHOP och aktiverat kaspas-3 var lägre i ATF3-knockdown-celler än

i kontrollceller med icke-specifikt shRNA (Fig. 6C, D). Dessa data indikerade att ATF3 spelar en kritisk roll i MPPa-inducerad apoptos av neuroblastomceller. Så dessa resultat stöder hypotesen att ECH skyddar SH-SY5Y-celler mot MPP?-inducerade effekter via nedreglering av ROS/ATF3/CHOP-vägen. Intressant nog visade våra data att ECH också hämmade den MPP?-inducerade ökningen av p53- och PUMA-nivåer (p53-uppreglerad modulator av apoptos) i SH-SY5Y-celler (Fig. 7).

Cistancheechinakosidhar effekten att förbättraimmunitet

ECH skyddar DA-neuroner mot apoptos

Inducerad av MPP1 in Vitro eller av MPTP in Vivo

För att bekräfta effekten av ECH i PD, behandlades primära DA-neuroner med MPP? eller MPP? och ECH. In vitro-experimenten visade att MPP? reducerade avsevärt livskraften för DA-neuroner och detta förhindrades av ECH

(Fig. 8). Vi bedömde vidare apoptos i DA-neuroner i SNc efter olika behandlingar hos möss med MPTP-inducerad PD och kontroller. Fler TH-positiva neuroner hittades i detta område i kontrollen än i MPTP-gruppen (Fig. 9A). TUNEL-analyser visade att NS och ECH inte inducerade apoptos i DA-neuroner i SNc, men MPTP gjorde det och ECH skyddade neuronerna mot det (fig. 9B, S2). Intressant nog visade western blotting av lysat av SNc från musmodellen av PD att ATF3- och CHOP-proteinnivåerna också minskade med ECH (Fig. 10).

Cistancheechinakosidhar enanti-apoptotisk effekt