Del två Hur behandlar echinacoside DNA-oxidativ skada och hämmar cellapoptos?

KLICKA HÄR FÖR DEL 1

För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

3. Experimentell Sektion

3.1. Celler och Kemikalier

En human kolorektal adenokarcinom SW480-cellinje köptes från ATCC. Cellerna odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA) innehållande 10 procent fetalt bovint serum (FBS) (Gibco) och 1 procent (v/v) penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) vid 37 grader i en fuktad atmosfär innehållande 5 procent CO2.Echinacosideköptes från Yuanye Biotechnology, Shanghai, Kina (HPLC > 98 procent). Stamlösningar framställdes i DMSO (Sigma-Aldrich), och arbetslösningar framställdes i ett cellodlingsmedium.

3.2. MTT Viabilitetsanalys

Celler såddes i 96-brunnsplattor med 1 × 104 celler per brunn under 12 timmar och inkuberades sedan i närvaro avEchinacosideeller 0.01 procent DMSO i 24 eller 48 timmar. Till slut, 20 μL MTT-lösning (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) (5 mg/ ml i PBS, pH 7,2) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) sattes till varje brunn och plattorna inkuberades i 4 timmar. Efter avlägsnande av mediet innehållande MTT tillsattes 150 μL DMSO till varje brunn. Plattorna inkuberades på en plattskakare i 10 minuter och absorbansen vid 570 nm mättes med en BioRad 680 mikroplattläsare (Hercules, CA, USA). Varje experiment utfördes två gånger i tre exemplar. Data analyserades med hjälp av programvaran GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).

3.3. Kolonibildningsanalys

Celler såddes i 6-brunnsplattor med en densitet av 1 × 104 per brunn under 12 timmar och inkuberades sedan i närvaro avEchinacosideeller {{0}},01 procent DMSO i 10 dagar. Plattorna tvättades med PBS och celler fixerades med iskall metanol och färgades med kristallviolett lösning (Sigma-Aldrich) (0,5 procent i 25 procent metanol). Bilderna fotograferades efter att plattorna torkats över natten. De kristallvioletta kristallerna löstes i 70 procent etanol, och absorbansen vid 595 nm mättes med en BioRad-mikroplattläsare. Data analyserades med hjälp av programvaran GraphPad Prism.

3.4. DNA-fragmenteringsanalys med DAPI-fluorescens Färgning

Efter läkemedelsbehandling tvättades celler i {{0}}brunnsplattor en gång i PBS, fixerades i iskall 4 procent paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich) i PBS under 20 minuter och färgades sedan med 4 ,6-diamidino-2--fenylindol (DAPI) (Sigma-Aldrich) (0,2 ug/ml) i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter tvättning med PBS förseglades celler i VECTASHIELD monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Kärnmorfologi fotograferades med ett Olympus fluorescerande mikroskop.

Echinakosid i cistanche kan stärka immunförsvaret

3.5. Cellcykelanalys

Celler såddes i 96-brunnsplattor med 1 × 104 celler per brunn under 12 timmar och inkuberades sedan i närvaro avEchinacosideeller {{0}}.01 procent DMSO i 24 timmar. Till slut skördades cellerna med trypsin (Invitrogen), tvättades i PBS två gånger och fixerades sedan med iskall etanol (70 procent) i 2 timmar vid -20 grader. Fixerade celler tvättades två gånger i kall PBS och återsuspenderades i 300 μL nyberedd PBS med 0,1 procent Triton X-100, 0,2 mg/ml DNas-fritt RNase A (Sigma), 10 ug/ml propidiumjodid (PI) (Roche, Indianapolis, IN, USA). Efter inkubation vid 37 grader i mörker i 20 minuter, filtrerades cellerna genom ett nylonnät (Falcon, BD Bioscience, San Jose, CA, USA), laddat till FACSCalibur flödescytometer (BD Biosciences). Data analyserades med hjälp av ModFit-mjukvaran (Topsham, ME, USA).

3.6. Apoptosanalys

Celler såddes i 96-brunnsplattor med 1 × 104 celler per brunn under 12 timmar och inkuberades sedan i närvaro avEchinacosideeller 0,01 procent DMSO i 24 timmar. Till slut undersöktes cellerna med hjälp av ett Annexin V-FITC Apoptos-detektionskit (Best, Shanghai, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Celler tvättades två gånger med PBS och återsuspenderades sedan i bindningsbuffert. 5 μL vardera av Annexin V-FITC och Propidium Jodide (PI) (Roche) tillsattes sekventiellt och cellerna inkuberades i 15 minuter i mörker vid rumstemperatur. Cellerna laddades på FACSCalibur flödescytometer (BD Biosciences). Data analyserades med hjälp av programvaran Cell Quest (BD Biosciences).

3.7. Immunfluorescerande färgning av 53BP1

SW480-celler såddes på runda täckglas i 24-brunnsplattor. Efter behandling medEchinacosideeller {{0}},01 procent DMSO under 24 timmar, celler fixerades med 4 procent PFA i 20 minuter och blockerades med 15 procent FBS (0,1 procent Triton X-100) ​​under 1 timme i rummet temperatur. Fixerade celler inkuberades i 2 timmar vid rumstemperatur med kanin-anti-53BP1-antikropp (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) utspädd 1:1000 i blockeringslösningen, följt av färgning med Cy3-konjugerad get-anti-kanin sekundär antikropp (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) utspädd 1:500 i blockerande buffert under 1 timme vid rumstemperatur. Efter tvätt i PBS i 3 × 5 minuter förseglades täckglasen på glasskivor i VECTASHIELD monteringsmedium med DAPI. Bilderna togs med ett Zeiss LCM 510 konfokalmikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

3.8. 8-oxoG Incorporation Assay

Intracellulär 8-oxoG mättes genom färgning med Alexa 488-konjugerad avidin (Invitrogen) [25]. Celler såddes på runda täckglas i 12-brunnsplattor. Efter behandling medEchinacosideeller {{0}}.01 procent DMSO under 24 timmar, celler fixerades med iskall metanol i 20 minuter följt av inkubation i Tris-buffrad saltlösning (TBS) (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) med 0,1 procent Triton X-100 (Sigma-Aldrich) under 15 min. Proverna blockerades i TBS med 0,1 procent Triton X-100 och 15 procent FBS under 1 timme vid rumstemperatur och färgades sedan med Alexa 488-konjugerad avidin (0,5 ug/ml) i blockeringslösning under 1 timme vid 37 grader. Efter tvätt i PBS i 3 × 5 min förseglades täckglasen på glasskivor i VECTASHIELD monteringsmedium med DAPI (Vector Laboratories). Bilder togs och analyserades med ett Zeiss LCM 510 konfokalmikroskop.

3.9. Western Blot Analys

Celler odlade och behandlade i {{0}}brunnsplattor skrapades i RIPA-buffert (150 mM NaCl, 1,0 procent IGEPAL CA-630, {{12 }},5 procent natriumdeoxicholat, 0,1 procent SDS och 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0) (Sigma). Den totala proteinkoncentrationen mättes med BCA-kit (Dingguo, Changchun, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Prover denaturerades vid 95 grader i 10 minuter, separerades på 4 procent –12 procent SDS-PAGE gel och överfördes sedan till PVDF-membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Membran blockerades i 5 procent fettfri mjölk i TBST under 2 timmar och inkuberades med primära antikroppar (Bcl-2, sc-492, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; Bax, Santa Cruz , sc-493; till c, Santa Cruz, sc-7159; p21, ab109520, Abcam, Cambridge, MA, USA; caspase 3, Abcam, ab32042; PARP, Bioss, bs-2318 R; 53BP1, Bethyl Laboratories, A300-272A) över natten vid 4 grader . Efter tvättning med PBS inkuberades membran med HRP-konjugerade sekundära antikroppar (Jackson ImmunoResearch Laboratories) och visualiserades med ECL Western blotting-detektionskit (Transgen Biotech, Changchun, Kina). Foton togs och analyserades av en bildapparat (Tanon, Shanghai, Kina).

3.10. Mätning av cellulär ROS

Intracellulär ROS mättes med flödescytometri med användning av ett cellbaserat ROS-analyskit (Beyotime Biotechnology, Haimen, Kina; S0033). I slutet avEchinacosidebehandling, cellerna tvättades två gånger med PBS och inkuberades med 10 μM diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) i 30 minuter vid 37 grader. Cellerna trypsiniserades sedan och analyserades med FACSCaliber flödescytometer (BD Biosciences). Intracellulära ROS-nivåer uttrycktes som den genomsnittliga DCF-fluorescensintensiteten hos cellerna.

3.11. Mätning av mitokondriemembran Potential

Mitokondriell membranpotential mättes med JC-1-färgämnet (Beyotime Biotechnology, C2006) enligt tillverkarens instruktioner. Kontroll ochEchinacoside-behandlade celler inkuberades med JC-1 i 20 minuter och undersöktes sedan med ett Olympus fluorescerande mikroskop.

3.12. Statistisk analys

Statistisk analys utfördes med användning av GraphPad Prism Software. Signifikans beräknades med hjälp av envägsvariansanalys (ANOVA) ochp < 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" results="" were="" expressed="" as="" mean="" ±="">

Echinacosideicistanche: Neuroskyddeffekter

4. Slutsatser

I den här studien testade vi effekterna avEchinacosidepå en mängd olika humana cancercellinjer. Överraskande nog hittade vi det

Cistanchedeserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

hämmade spridningen av humant SK-HEP-1-hepatom, MCF-7 bröstcancer och SW480 kolorektala cancerceller. Ytterligare analyser fann att Echinacoside stoppade SW480-celler i G1-fasen och inducerade kaspasberoende apoptos genom att aktivera den mitokondrierassocierade inre apoptosvägen. Cellcykelstopp var relaterat till uppreglering av G1/S-CDK-blockeraren och DNA-synteshämmaren CDKN1B (p21), och apoptos var associerad med nedreglering av det anti-apoptotiska proteinet Bcl-2 och uppreglering av pro-apoptotisk Bax, samt förlust av mitokondriell membranpotential. Den signifikanta ökningen av intracellulär oxiderad form av guanin, 8-oxoG, tyder på att det förekom ökad oxidation av dNTP:er och/eller DNA-molekyler, vilket kan ha orsakat cellcykelstopp och apoptos i SW480-cancerceller. Medan de underliggande mekanismernaEchinacosideEffekterna på oxidativ skada och apoptos återstår att karakterisera, dessa resultat stöder Echinacoside som en ny kemisk ställning för utveckling av läkemedel mot cancer.

Erkännanden

Dessa studier stöddes av ett anslag från Jilin-provinsen (bidragsnummer: 20130101120JC) och av en forskningsfond från Jilin University (projektnummer: 450091099029).

Författarbidrag

Liwei Dong utförde det mesta av experimentarbetet, analyserade data och skrev manuskriptet; Debin Yu och Nuoting Wu gjorde MTT- och kolonibildningsanalysen; Hongge Wang och Jiajing Niu gjorde immunfärgnings- och Western blot-experimenten; Ye Wang hjälpte till med cellcykel- och apoptosexperiment; och Zhihua Zou utvecklade konceptet, analyserade data och övervakade genomförandet av denna studie och skrivningen av manuskriptet. Alla författare har godkänt det inlämnade manuskriptet.

Intressekonflikt

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Echinacosideicistancheburkantiinflammatorisk

Referenser

1. Jiang, Y.; Tu, PF Analys av kemiska beståndsdelar i Cistanche-arter.J. Chromatogr.2009,

1216, 1970–1979.

2. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W.Cistanche deserticolaYC Ma, "ökenginseng": En recension.Am. J. Chin. Med.2012, 40, 1123–1141.

3. Freeman, C.; Spelman, K. En kritisk utvärdering av läkemedelsinteraktioner medEchinacea spp.

Mol. Nutr. Food Res.2008, 52, 789–798.

4. Hudson, JB Tillämpningar av fytomedicinenEchinacea purpurea(Purple Coneflower) vid infektionssjukdomar.J. Biomed. Biotechnol.2012, 2012, 769896.

5. Zhang, D.; Li, H.; Wang, JB Echinacoside hämmar amyloid fibrillering av HEWL och skyddar mot A-inducerad neurotoxicitet.Int. J. Biol. Macromol.2015, 72, 243–253.

6. Wu, Y.; Li, L.; Åkte.; Li, YQ Skyddseffekter av echinakosid på koltetrakloridinducerad levertoxicitet hos råttor.Toxikologi2007, 232, 50–56.

7. Li, X.; Gou, C.; Yang, H.; Qiu, J.; Mage.; Wen, T. Echinacoside förbättrar D-galaktosamin plus lipopolysackarid-inducerad akut leverskada hos möss via hämning av apoptos och inflammation.Scand. J. Gastroenterol.2014, 49, 993–1000.

8. Xie, H.; Zhu, H.; Cheng, C.; Liang, Y.; Wang, Z. Echinacoside fördröjer cellulär åldrande av mänskliga fibroblastiska celler MRC-5.Pharmazie2009, 64, 752–754.

9. Wang, S.; Zheng, G.; Tian, ​​S.; Zhang, Y.; Shen, L.; Pak, Y.; Shen, Y.; Qian, J. Echinacoside förbättrar den hematopoetiska funktionen hos 5-FU-inducerade myelosuppressionsmöss.Life Sci.2015, 123, 86–92.

10. Jia, Y.; Guan, Q.; Guo, Y.; Du, C. Echinacoside stimulerar cellproliferation och förhindrar cellapoptos i intestinala epitelial MODE-K-celler genom uppreglering av transformerande tillväxtfaktor- 1 uttryck.J. Pharmacol. Sci.2012, 118, 99–108.

11. Morikawa, T.; Ninomiya, K.; Imamura, M.; Akaki, J.; Fujikura, S.; Pan, Y.; Yuan, D.; Yoshikawa, M.; Jia, X.; Li, Z.;et al.Acylerade fenyletanoidglykosider, echinakosid och acteosid frånCistanche tubulosa, förbättra glukostoleransen hos möss.J. Nat. Med.2014, 68, 561–566.

12. Yang, X.; Li, F.; Yang, Y.; Shen, J.; Zou, R.; Zhu, P.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Effekt och säkerhet av echinakosid i en osteopenimodell hos råtta.Evid. Baserat komplement. Altern. Med.2013, 2013, 926928.

13. Kuang, R.; Sun, Y.; Zheng, X. Undertryckande av kväveoxid inblandad i den skyddande effekten av echinacoside på H2O2-inducerad PC12-cellskada.Nat. Driva. Commun.2010, 5, 571–574.

14. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Antioxidativa effekter av fenyletanoider från

Cistanche deserticola. Biol. Pharm. Tjur.1996, 19, 1580–1585.

15. Zhang, Y.; Du, Y.; Le, W.; Wang, K.; Kieffer, N.; Zhang, J. Redox kontroll av överlevnaden av friska och sjuka celler.Antioxid. Redoxsignal.2011, 15, 2867–2908.

16. Russo, MT; Blasi, MF; Chiera, F.; Fortini, P.; Degan, P.; Macpherson, P.; Furuichi, M.; Nakabeppu, Y.; Karran, P.; Aquilina, G.;et al.Den oxiderade deoxinukleosidtrifosfatpoolen är en betydande bidragande orsak till genetisk instabilitet i celler som saknar matchning av reparationer.Mol. Cell. Biol.2004, 24, 465–474.

17. Ventura, I.; Russo, MT; de Luca, G.; Bignami, M. Oxiderade purinnukleotider, genominstabilitet och neurodegeneration.Mutat. Res.2010, 703, 59–65.

18. Rajendran, P.; Nandakumar, N.; Rengarajan, T.; Palaniswami, R.; Gnanadhas, EN; Lakshminerasaiah, U.; Gopas, J.; Nishigaki, I. Antioxidanter och mänskliga sjukdomar.Clin. Chim. Acta2014, 436, 332–347.

19. Rai, P.; Onder, TT; Young, JJ; McFaline, JL; Pang, B.; Dedon, PC; Weinberg, RA Kontinuerlig eliminering av oxiderade nukleotider är nödvändig för att förhindra snabb uppkomst av cellulär senescens.Proc. Natl. Acad. Sci. USA2009, 106, 169–174.

20. DeNicola, GM; Karreth, FA; Humpton, TJ; Gopinathan, A.; Wei, C.; Frese, K.; Mangal, D.; Yu, KH; Yeo, CJ; Calhoun, ES;et al.Onkogeninducerad Nrf2-transkription främjar ROS-avgiftning och tumörbildning.Natur2011, 475, 106–109.

21. Santos, MA; Faryabi, RB; Ergen, AV; Dag, AM; Malachowski, A.; Canela, A.; Onozawa, M.; Lee, JE; Callen, E.; Gutierrez-Martinez, P.;et al.DNA-skada-inducerad differentiering av leukemiceller som en anti-cancerbarriär.Natur2014, 514, 107–111.

22. Sayin, VI; Ibrahim, MX; Larsson, E.; Nilsson, JA; Lindahl, P.; Bergo, MO Antioxidanter påskyndar utvecklingen av lungcancer hos möss.Sci. Transl. Med.2014, 6, 221–215.

23. Harris, IS; Treloar, AE; Inoue, S.; Sasaki, M.; Guerrini, C.; Lee, KC; Yung, KY; Brenner, D.; Knobbe-Thomsen, CB; Cox, MA;et al.Antioxidantvägar för glutation och tioredoxin samverkar för att driva cancerinitiering och progression.Cancercell2015, 27, 211–222.

24. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimulerar cellulär glutationredox-cykling av reaktiva syrearter som genereras från mitokondriell andning i H9c2-kardiomyocyter.Pharm. Biol.2013, 51, 64–73.

25. Struthers, L.; Patel, R.; Clark, J.; Thomas, S. Direkt detektering av 8-oxo-deoxyguanosin och 8-oxoguanin av avidin och dess analoger.Anal. Biochem.1998, 255, 20–31.

26. Bridge, G.; Rashid, S.; Martin, SA Reparation av DNA-felmatchning och oxidativ DNA-skada: Implikationer för cancerbiologi och behandling.Cancer2014, 6, 1597–1614.

27. Caldecott, KW Reparation av enkelsträngsbrott och genetisk sjukdom.Nat. Varv. Genet. 2008, 9, 619–631.

28. Ward, IM; Minn, K.; van Deursen, J.; Chen, J. p53 Bindande protein 53BP1 krävs för DNA-skadesvar och tumörsuppression hos möss.Mol. Cell. Biol.2003, 23, 2556–2563.

29. Nakabeppu, Y. Cellulära nivåer av 8-oxoguanin i antingen DNA eller nukleotidpoolen spelar avgörande roller för cancercellers cancerframkallande och överlevnad.Int. J. Mol. Sci.2014, 15, 12543–12557.

30. Colussi, D.; Brandi, G.; Bazzoli, F.; Ricciardiello, L. Molekylära vägar involverade i kolorektal cancer: Implikationer för sjukdomsbeteende och förebyggande.Int.J. Mol. Sci.2013, 14, 16365–16385.

31. Satelli, A.; Mitra, A.; Brownlee, Z.; Xia, X.; Bellister, S.; Overman, MJ; Kopetz, S.; Ellis, LM; Meng, QH; Li, S. Epitelial-mesenkymala övergångna cirkulerande tumörceller fångar in för att detektera tumörprogression.Clin. Cancer Res.2015, 21, 899–906.

32. Liao, X.; Lochhead, P.; Nishihara, R.; Morikawa, T.; Kuchiba, A.; Yamauchi, M.; Imamura, Y.; Qian, ZR; Baba, Y.; Shima, K.;et al.Aspirinanvändning, tumör PIK3CA-mutation och överlevnad av kolorektal cancer.N. Engl. J. Med.2012, 367, 1596–1606.

33. Domingo, E.; Kyrka, DN; Sieber, O.; Ramamoorthy, R.; Yanagisawa, Y.; Johnstone, E.; Davidson, B.; Kerr, DJ; Tomlinson, IP; Midgley, R. Utvärdering av PIK3CA-mutation som en prediktor för nyttan av icke-steroid antiinflammatorisk läkemedelsbehandling vid kolorektal cancer.J. Clin. Oncol.2013, 31, 4297–4305.

34. Ahmed, D.; Eide, PW; Eilertsen, IA; Danielsen, SA; Eknaes, M.; Hektoen, M.; Lind, GE; Lothe, RA Epigenetiska och genetiska egenskaper hos 24 tjocktarmscancercellinjer.Onkogenes2013, 2, doi:10.1038/oncsis.2013.35.