DEL Ⅱ: Rollen för mänsklig primär njurfibroblast i TGF- 1-medierad fibros-härmare

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

DEL Ⅱ: Rollen av mänsklig primär njurfibroblast i TGF- 1-medierad fibros-härmare

Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.

Abstrakt

Njurfibrosär en progressiv kronisk njursjukdom som i slutändan leder till njursvikt i slutstadiet. Trots flera angreppssättnjurfibros, är en experimentell modell för att utvärdera för närvarande tillgängliga läkemedel inte idealisk. Vi utvecklade b-härmare modeller med hjälp av tredimensionella (3D) samodlingsenheter designade med tre separata lager av tubulus interstitium, nämligen epitel-, fibroblastiska och endotellager. Vi introducerade humana njurproximala tubulära epitelceller (HK-2), humana navelvenendotelceller och patienthärledda njurfibroblaster, och utvärderade effekterna avtförändrande tillväxtfaktor- (TGF-)ochTGF-inhibitorbehandling på dettanjur-fibrosmodell. Uttrycket förfibrosmarkör alfa-slät muskel aktin påTGF- 1behandling utökades i monolager-odlade HK-2-celler i en 3D-sjukdomsmodell. I kärlavdelningen avnjur-fibrosmodeller ökades och minskades tätheten av kärl iTGF--behandlad grupp ochTGF--inhibitor behandlingsgrupp, respektive. Multiplex ELISA med användning av supernatanter iTGF--stimulerande 3D-modeller visade att pro-inflammatoriska cytokiner och tillväxtfaktornivåer inklusive interleukin-1 beta, tumörnekrosfaktor-alfa, grundläggande fibroblasttillväxtfaktor ochTGF- 1, TGF- 2, ochTGF- 3ökade, vilket efterliknade de fibrotiska mikromiljöerna hos mänskliga njurar. Denna studie kan möjliggöra konstruktionen av en människanjur-fibros-härmar enhetsmodell bortom traditionella kulturexperiment.

Nyckelord: renal fibroblast; fibros; TGF- 1

cistanche tubolosa hälsofördelar: behandling av kroniska njursjukdomar

KLICKA HÄR FÖR ATT DELA Ⅰ

3. Diskussion

TGF- 1spelar en viktig roll i matrisackumulering i njurfibrogenes och hämmar proliferation i de flesta celler, inklusive glomerulära epitelceller och endotelceller, såväl som tubulära epitelceller 【1】. TGF-ß1 inducerar emellertid proliferation i humana njurfibroblaster via induktion av grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (FGF-2) [8].

I denna studie har vi fastställt enfibros-härmare som använder tre väsentliga cellulära komponenter, inklusive humana primära njurfibroblaster, renala tubulära epitelceller och mänskliga endotelceller och utvärderade det som ennjur-fibrosmodell baserad påTGF- 1stimulering. Att genereranjur-fibros-on-a-chip etablerade vi ett nytt 3D-kultursystem designat med tre separata delar av vävnad, som syftar till att övervinna hinder förknippade med modellering av njursjukdom. Vår studie visade detTGF- 1inducerade cellulära svar, inklusive tubulär epitel-mesenkymal övergång (EMT) av epitelceller, mikrovaskulär förändring av endotelceller och cytokinförändringar i njurfibroblaster. Detta är den första studien som introducerar enfibros-härmare som består av primära fibroblaster härrörande från mänskliga njurar och stimulerade fibroblaster isolerade från patienter medTGF- 1, en känd inducerare av fibrotiska svar som vanligtvis används som standard för att efterliknafibrosi cellkulturer [9]. Dessa resultat tyder på detTGF- 1-behandlade epitelceller omvandlas till en mesenkymal cellliknande fenotyp. NärTGF- 1administreras till fibroblaster, förändras olika cytokiner för att återspegla induktionen av fibrotiska processer. Det är uppenbart att injur-fibrosmodell är fibroblaster huvudkraften bakom utvecklingen av det etablerade odlingssystemet genom TGF-stimulering.

Davis et al, rapporterade att 3D-kulturen av endotelceller är tillräcklig för att cellerna ska invadera och bilda ett lumen- och rörnätverk, efter en intakt organism in vivo [10,11]. Flera grupper har rapporterat att 3D-kulturmodeller uppvisar högre nivåer av nefrotoxicitet än 2D-cellkulturmodeller [12]. Dessutom var uttrycket av nefrotoxicitets- och inflammationsrelaterade gener signifikant högre i den renala 3D-cellkulturmodellen än i en typisk 2D-kultur [13].

I denna studie, kultur media av människannjur-fibros-on-a-chip hade en signifikant högre nivå av cytokiner jämfört med den i 2Dculture. Vår grupp har visat att patienthärledda fibroblaster kan återskapa naturliga njurvävnader, inklusive endotel- och epitelcellslager, genom våra föreslagnafibros-on-a-chip-modell. Följaktligen tyder dessa fynd på attnjur-fibros-on-a-chip modell simulerar exakt den mikrofysiska miljön i den mänskliga njuren. Dessutom, eftersom fibroblasterna som odlas i chipet härrör från patienter, kan andra kliniskt relevanta patientmodeller enkelt och tydligt erhållas på ett säkert sätt. Därför människannjur-fibros-on-a-chip modellsystem kan möjliggöra utveckling av personlig medicin med känsliga mätningar av epitel- och endotelfunktioner. I våra experiment,fibrosoch angiogenes minskade iTGF-inhibitor-behandlade grupper. TGF-hämmare är naturliga antagonister av TGF-, som har visats med hjälp av olika njursjukdomsmodeller. Det verkar som om det är möjligt att genomföra experiment för att bekräfta effektiviteten av behandling i sjukdomsmodeller med terapeutiska medel som denna TGF-hämmare. Därför har detta chip tillhandahållit ett sätt att utveckla en förbättrad modell av njurfibros för att mäta cellmorfologi och funktion och kan vara användbart för att utföra nefrotoxicitetsbedömningar för läkemedel.

TGF-är den dominerande profibrotiska faktorn vid olika njursjukdomar [14] och spelar en roll vid angiogenes [15]. De angiogena effekterna av TGF- är mycket komplexa och kan ha antingen proangiogen eller antiangiogen aktivitet beroende på miljön och olika regulatoriska faktorer [16]. Angiogene tillväxtfaktorer såsom VEGF och FGF-2inducerar angiogenes in vivo verkar spela en central roll i moduleringen av angiogenes in vivo [17-20]. Vissa bevis tyder på att dessa två faktorer kan verka synergistiskt för att främja endotelcellsmorfogenetiska händelser [21,22]. Vi har tillhandahållit bevis för att VEGF-mRNA-uttryck och FGF-2-proteinutsöndring är signifikant förhöjd av TGF- 1 i 3D-chips jämfört med 2D-odling.

Begränsningen av vårfibrosmodeller kan vara att de skapades under en relativt kort tidsperiod, 24 timmar. TGF-beta har pro-fibrotiska och antiinflammatoriska egenskaper inom en tidigfibrosprocess, inte i den kroniska processen. Konventionellt,TGF-har främst använts i cytokininduceradfibrosmodeller. Men eftersom endast ett cytokin inte kan representeras in vivo,fibrosinduktionsmodeller som använder flera ytterligare kandidatämnen som t.exTGF-och BMP7 har föreslagits. Två eller tre cytokiner är dock fortfarande inte tillräckliga för att reproducera in vivo. Vi användeTGF-som utgångspunkt; Vi försökte dock implementera en in vivo-mikromiljö på chipet genom att inducera en mer varierad cytokinstorm. Fibroblast, en viktig cellulär komponent avfibros, introducerades, och sekundär stimulering av mer olika cytokiner (IL-1, TNF-, b-FGF,TGF- 1, TGF-2, ochTGF-3) inducerades i fibroblaster stimulerade medTGF-. Alltså en miljö liknandefibrosi människokroppen reproducerades.

Cistanche deserticola-extrakt: behandling av njursjukdomar

4. Material och metoder

4.1.Cellkulturer

Kidney fibroblasts(KFs)were isolated from biopsies of the normal tissue portion of renal cell carcinoma patients with an estimated glomerular filtration rate (eGFR)>60 mL/minut/1,73 m2 efter att patienter hade gett sitt samtycke till en andra biopsi för forskningsändamål. KFs odlades i ett fibroblasttillväxtmedium (FGM-2, Lonza, Schweiz), och passagerna 3 till 4 användes för experimenten. Njurfibroblaster skrapades från kulturen i 1-2 veckor tills cellerna bildade ett monolager. För att eliminera epitelceller som kontaminerade kulturen valdes fibroblaster med hjälp av magnetiska anti-fibroblastpärlor (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) efter den första passagen. Celler lossades med 0.05 procent trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (Welgene, Gyeongsan, Korea), inkuberades med anti-fibroblastpärlor och separerades med hjälp av en magnetisk kolonn, och flödes- genom samlades. De renade primära fibroblasterna karakteriserades av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys med användning av PE-konjugerade anti-fibroblast antikroppar. Den milda magnetiskt aktiverade cellsortering (MACS) Dissociator användes för skonsam njurvävnadsmalning. En Octo MACSTM magnetseparator med MACS LS-kolonner (med kolvar) applicerad för rening av mikropärlmärkta celler köptes från Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). Milda MACS C-rör (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) användes för njurmalning för cellseparation. MACS Smart Strainers (70 um) erhölls från Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). Kolonnbuffert användes för att tvätta kolonner och återsuspendera cellpellets. Bufferten framställdes som en lösning innehållande 0,5 procent bovint serumalbumin (BSA) med 2 mM EDTA i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7,4) och köptes från Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). Grönt fluorescerande proteinuttryckande humana navelvenendotelceller (GFP-HUVEC, Lonza, Schweiz) odlades i endoteltillväxtmedium (EGM-2, Lonza, Schweiz), och celler i passagerna 3 till 4 användes. Human proximal tubulär cellinje (human njure-2(HK-2)-celler erhölls från American Type Culture Collection (ATCC). Cellinjen odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med hög glukoshalt. kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 ug/ml). Reagenser köptes från Gibco (Rockville, MD, USA). Alla celler lossades med användning av 0,05 procent trypsin- EDTA och hölls i en fuktad inkubator vid 37 grader och 5 procent CO2. KFs återsuspenderades i kvinnlig könsstympning-2 vid en cellkoncentration av 4×10 graders celler/ml. Tubulära epitelceller från mänskliga njurar (HK{{49) }}) resuspenderades i en koncentration av 2×10 graders celler/ml i högglukoshaltiga DMEM.GFP-HUVECs resuspenderades vid en koncentration av 2×10 graders celler/ml i EGM-2.

4.2.Reagens

Matrisen var sammansatt av fibringer, inklusive kommersiellt tillgängligt fibrinogen från bovin plasma, aprotinin från bovin lunga och trombin från bovin plasma. De tidigare nämnda tre materialen köptes från Sigma (St. Louis, MO, USA). Fibrinogen löstes i l×PBS i ett vattenbad (37 grader) under 3 0 min vid en koncentration av 10 mg/ml. Trombin och aprotinin löstes i avjoniserat vatten vid en koncentration av 50 enheter/ml och 4 TIU/ml. De tre lösningarna steriliserades genom filtrering genom ett 0,22 μm filter. Rekombinant människaTGF- 1erhölls från PeproTech EC Ltd. (London, Storbritannien). En specifik hämmare av TGF-beta-receptorkinas, SB431542, köptes från Tocris Cookson, Inc. (Ellisville, MO, USA).

4.3. Cellmönster i enheten

Innan cellsådd för att underlätta tät bindning, behandlades enheten i 1 min i en plasmamaskin (Femto Science Inc., Suwon, Korea) med en effekt på 70 W, 50 Hz. Plasmabehandling-inducerad ythydrofilicitet och hjälpte till att underlätta gelmönster och medialaddning. För att undvika förändringar i hydrofilicitet utfördes experiment inom 30 minuter efter plasmabehandling. Olika cellmönster i enheterna kan göras på ett mycket anpassningsbart sätt. Det var viktigt att bestämma sammansättningen och koncentrationen av de olika celltyperna som skulle mönstras i förväg. För cellulära hydrogelsuspensioner bereddes 37,5 μL cellsuspension och en separerad alikvot på 12,5 μL 10 mg/ml fibrinogenlösning (250 μL 10 mg/ml fibrinogenlösning med 40 μL 4 TIU/ml aprotin för att omedelbart blandas) innan lastning. Omedelbart före laddning blandades de 37,5 μL cellsuspensionen med 12,5 μL 10 mg/ml fibrinogen tills den homogeniserades. 50 ul hydrogel blandades med en 1 ul droppe trombin (0,5 enhet/ml). Omedelbart efter blandning injicerades trombin med en fibrinsuspension av GFP-HUVECs (cellkoncentration av 2x10' celler/ml) i den yttre kanten av den yttre kanalen (Figur 3, Gel A). Vi väntade 3 minuter på att fibrinogentvärbindningen skulle vara fullständig. Omedelbart efter blandning placerades trombin med en fibrinsuspension av KFs (cellkoncentration på 4×10 grader celler/ml) på varje sida av reservoargolvet per brunn (Figur 3, Gel C). Denna fibrinsuspension av KFs fick tvärbindas vid rumstemperatur under 3 min. En cellsuspension av 10 μL humana proximala tubulära njurepitelceller (HK-2) injicerades i injektionsporten på den inre kanalen (Figur 3, Gel B). För att fästa HK-2 på väggen av fibringel i GFP-HUVECs kanal, vändes enheten 90 grader och placerades i 5 procent CO, en inkubator i 30 minuter vid 37 grader. HK-2 slog sig ner och bildade ett cellark på sidan av fibringelen.

Efter att ha fäst HK-2 fylldes enheten med EGM-2. Anordningen inkuberades under 3 dagar vid 37 grader i en 5 procent CO, inkubator. Mediet byttes med eller utan 5 ng/mlTGF- 1och med 5 ng/mlTGF- 1och 10 umTGF- 1inhibitor efter tre dagars inkubation (Figur 3).

vad är cistanche

4.4. Immunocytofluorescens

Samodlade vävnader i enheten fixerades med 4 procent (vikt/volym) paraformaldehydlösning (Biosesang, Seongnam, Korea) i PBS (Welgene, Gyeongsan, Korea) under 20 min, följt av permeabilisering med en 20 min nedsänkning i 0,15 procent Triton X-100(Sigma, St.Louis, MO, USA). Proverna behandlades sedan med 3 procent BSA (Sigma, USA) under 1 timme. Cellerna inkuberades med antikroppar köpta från Abcam. De primära antikropparna var anti-cytokeratin 8 och anti-o-SMA, lämnade i 2 dagar vid rumstemperatur (RT). Alexa Fluor 647 konjugerad åsna-anti-kanin IgG(H plus L) användes som den sekundära antikroppen. DNA-märkning utfördes med en 1:250 utspädning av Hoechst33342 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) under 3 timmar vid RT. Bilder samlades in med hjälp av ett Zeiss LSM 710 konfokalt lasermikroskop. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) mättes med hjälp av ImageJ och en fluorescens-intensitetsanalysator.

4.5. Multiplexanalys av cytokiner

MSD V-Plex Cytokine and Angiogenesis Panel 1 Human kit (Rockville, MD, USA) användes för att mäta interleukin-1 beta （IL-1ß） och grundläggande fibroblasttillväxtfaktor （b-FGF） i enstaka prover, enligt tillverkarens instruktioner. Alla prover utvärderades för totala proteinnivåer av IL-1 och b-FGF. Mängden (i pg/ml) kvantifierades från standardkurvan för varje mätning.

4.6. Multiplex Bead Immunoassay

Cytokinkoncentrationerna analyserades med hjälp av ett immunoanalyssystem för multiplexpärlor (Procarta Cytokine Assay Kit; Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA), baserat på multiplexeringsteknologi (xMAP; Luminex, Austin, TX, USA), enligt tillverkarens instruktioner. Uppgifterna inhämtades med en Luminex-kompatibel arbetsstation och dess hanteringsprogramvara (Bio-Plex-arbetsstation och programvara version 6.0; Bio-Rad, Tokyo, Japan), enligt tillverkarens instruktioner. Human TGF- 1, TGF- 2 och TGF- 3 relaterade tillfibrosprocess analyserades samtidigt i de utspädda proverna. Isoformerna avTGF-upptäcktes med hjälp av Bio-Plex 200 Systems och kommersiellt tillgängliga Bio-Plex ProTM HumanTGF-analyser (Bio-Rad Laboratories, Inc); baserat på informationen från tillverkaren. Multiplexanalyskitet kan kvantitativt mäta flera cytokiner från supernatanten med en nedre detektionsgräns på 1 pg/ml per cytokin. Varje prov kördes som en enda mätning för en begränsad mängd av den uppsamlade supernatanten.

4.7. Realtids-PCR

RNA-extraktion utfördes med användning av TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Master Mix och ett Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit användes för omvänd transkription av det totala RNA.qPCR utfördes med hjälp av Applied BiosystemsTM PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). De specifika primrarna framställdes av Bioneer (Daejeon, Korea) och användes i detta experiment enligt följande. Primersekvenserna är sammanfattade i tabell 1.

Tio mikroliter PowerUp SYBR Green Master Mix, 4 μL cDNA och 2 pmol av varje primer användes för realtids-PCR i en slutlig volym på 20 μL. Reaktionen utfördes vid 95 grader i 1 s och 60 grader i 20 s under 45 cykler efter denaturering vid 95 grader under 20 s. PCR utfördes i duplikat eller triplikat för varje prov. cDNA-nivåer bestämdes med användning av en standardkurva för cykeltröskelvärden. Alla data för varje cDNA låg inom motsvarande standardkurva. Erhållna data normaliserades till -aktin-cDNA.

4.8. Statistisk analys

Kvantitativa data presenteras som medelvärde ±SD eller SE för minst tre oberoende experiment. Statistiska analyser utfördes med användning av ett tvåsidigt Students t-test. Vi ansåg en signifikant skillnad endast vid en konfidensnivå på 95 procent eller högre (s<>

5. Slutsatser

Sammanfattningsvis möjliggjorde protokollen i denna studie konstruktion av människanjur-fibros-härmar enheter som modell och visade olika effekter som inte är möjliga i 2D-kulturexperiment. Vi tror att den utvärderingsstrategi som föreslås i denna studie kommer att leda till en bättre förståelse av detaljernafibrosmekanismer involverade i patologiska förändringar undernjursjukdom. Den utvecklade 3D-njurfibros-on-a-chip kan användas som en potentiell in vitro-modell, vilket kommer att föra oss närmare att skapa en förbättrad njure-på-a-chip-modell.

cistanche phelypaes: behandling av njursjukdomar

Referenser

1. Border, W.; Noble, N. Transforming growth factor in tissuefibros.N. Engl. J. Med. 1994, 331, 1286-1292.

2. Wang, W.; Huang, XR; Li, AG; Liu, F; Li, J.; Truong, LD; Wang, XJ; Lan, HYSigneringsmekanism för TGF-betal för att förhindra njurinflammation: Smads roll. Jag är. Soc. Nephrol.2005, 16, 1371-1383. [CrossRef]

3. Liu,Y.Njurfibros: Nya insikter om patogenes och terapi.Kidney Int.2006,69,213-217. [CrossRef][PubMed]

4. Andes, D.; Craig, WA Djurmodells farmakokinetik och farmakodynamik: En kritisk granskning. Int. J.Antimicrob.Agents 2002, 19,261-268. [CrossRef]

5. Kim, S.; Takayama, S.Organ-on-a-chip och njuren. Njure Res. Clin. Pract.2015, 34, 165-169.[CrossRef][PubMed]

6. Jang, KJ; Mehr, AP; Hamilton, GA; McPartlin, LA; Chung, S.; Suh, KY; Ingber, DEHuman njure proximal tubuli on-a-chip för läkemedelstransport och nefrotoxicitetsbedömning. Heltal. Biol. 2013,5,1119-1129. [CrossRef[PubMedl

7. Reardon, S. 'Organs-on-chips' går mainstream. Nature 2015, 523, 266. [CrossRef]

8. Strutz, F; Zeisberg, M; Renziehausen, A.; Raschke, B.; Becker, V; Kooten, CV; Muller, GATGF- 1inducerar proliferation i humana njurfibroblaster via induktion av grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (FGF-2).Njure Int. 2001, 59, 579-592.[CrossRef][PubMed]

9. Zanotti, S.; Bragato, C.; Zucchella, A.; Maggi, L.; Mantegazza, R.; Morandi, L.; Mora, M. Anti-fibrotisk effekt av pirfenidon i muskelhärledda fibroblaster från Duchennes muskeldystrofipatienter. Life Sci. 2016, 145,127-136. [CrossRef]

10. Davis, GE.: Camarillo. C, W. En alfa 2 beta 1 integrinberoende pinocytisk mekanism som involverar intracellulär vakuolbildning och koalescens reglerar kapillärlumen och rörbildning i en tredimensionell kollagenmatris. Exp. Cell Res. 1996, 224, 39-51.[CrossRef]

11. Bayless, KJ; Davis, G. Cdc42 och Race GTPaser krävs för bildning av kapillärlumen i tredimensionella extracellulära matriser. J. Cell Sci. 2002,115,1123-1136. [CrossRef [PubMed]

12. DesRochers, TM; Suter, L.; Roth, A.; Kaplan, DL Bioengineered 3D mänsklig njurvävnad, en plattform för bestämning av nefrotoxicitet. PLoS ONE 2013, 8, e59219. [CrossRef]

13. Astashkina, AI; Mann, BK; Prestwich, GD; Grainger, DW Jämförelse av prediktiva biomarkörer för läkemedelsnefrotoxicitet i njure 3-D primär organoidkultur och immortaliserade cellinjer. Biomaterials 2012, 33, 4712-4721. [CrossRef] [PubMed]

14. Meng, XM; Nikolic-Paterson, DJ; Lan, HY TGF-beta: Huvudregulatorn förfibros. Nat.Rev.Nephrol.2016,12, 325-338. [CrossRef]

15. Pardali, E.; Goumans, MJ; ten Dijke, P. Signalering av medlemmar av TGF-beta-familjen i vaskulär morfogenes och sjukdom. Trends Cell Biol.2010, 20, 556-567. [CrossRef] [PubMed]

16. Cunha, SL; Pietras, K. ALK1 som ett framväxande mål för antiangiogen terapi av cancer. Blood 2011,117,6999-7006.[CrossRef]

17. Klagsbrun, M.; D'Amore, PA Regulators of angiogenesis. Annu. Rev. Physiol.1991,53, 217-239. [CrossRef]

18. Folkman, J.;Shing, Y.Angiogenesis. J. Biol. Chem. 1992, 267, 10931-10934. [CrossRef]

19. Shweiki, D. Itin, A. Soffer, D. Keshet, E. Vaskulär endotelial tillväxtfaktor inducerad av hypoxi kan mediera hypoxi-initierad angiogenes. Nature 1992, 359, 843-848. [CrossRef]

20. Kim, KJ; Li, B.; Winer, J.; Armanini, M; Gillett, N.; Phillips, HS; Ferrera, N. Hämning av vaskulär endoteltillväxtfaktorinducerad angiogenes undertrycker tumörtillväxt in vivo. Nature 1993, 362, 841-844. [CrossRefl]

21. Pepper, MS; Ferrara, N.; Orci, L.; Montesano, R. Potent synergism mellan vaskulär endotelial tillväxtfaktor och grundläggande fibroblasttillväxtfaktor vid induktion av angiogenes in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun.1992,189,824-831.[CrossRefl

22. Goto, F.; Goto, K.; Weindel, K.; Folkman, J. Synergistiska effekter av vaskulär endotelial tillväxtfaktor och grundläggande fibroblasttillväxtfaktor på proliferation och bildning av navelsträngar av bovina kapillära endotelceller i kollagengeler. Labb. Investig.1993,69, 508-551.[PubMed]

KLICKA HÄR FÖR ATT DELA Ⅰ