Innehåll av fenolföreningar och genetisk mångfald på populationsnivå över det naturliga utbredningsområdet för björnbär (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) på den iberiska halvön

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt:Björnbär (Arctostaphylos uva-ursi) är en medicinalväxt som traditionellt används för behandling av urinvägsinfektioner på grund av det höga innehållet avarbutin(hydrokinon -D-glukosid), som nu främst används som ett naturligt hudblekande medel i kosmetika. Bearberry har också föreslagits som en naturligantioxidanttillsats på grund av de höga halterna av fenolföreningar i bladen. Vi studerade variationen av fenolföreningar i 42 vilda populationer av bärbär, med syftet att klargöra om inneboende biologiska, klimatiska och/eller geografiska faktorer påverkar fenolhalten över dess naturliga utbredning på den iberiska halvön. Björnbärslöven samlades in under hösten under en treårsperiod (2014–2016) i populationer över en latitud och höjdgradient. Metanolextrakt uppvisade ett brett spektrum av variationer i den totala fenolhalten, och olika fenolprofiler beträffandearbutin(nivåerna av denna huvudbeståndsdel varierade från 87 till 232 mg/g dr vikt), men även innehållet av katekiner och myricetin, som påverkades av geografiska och klimatiska faktorer. Måttliga nivåer av variation på genomstorlek – bedömd med flödescytometri – och på två plastid-DNA-regioner upptäcktes också bland populationer. Genetisk och cytogenetisk differentiering av populationer var svag men signifikant associerad med fytokemisk mångfald. Elit björnbärsgenotyper med högreantioxidantkapacitet identifierades senare.

Nyckelord: arbutin; genetisk och fytokemisk variation; genomstorlek; haplotyper; naturligaantioxidanter

cistanche är naturliga antioxidanter

1. Introduktion

Syntesen av växtspecialiserade metaboliter varierar i tid (dvs. ontogeni, fenologi och inducerade försvar) och utrymme, eftersom det spelar en avgörande roll i växternas anpassning till miljöförhållanden, samtidigt som genetisk variation står för kemodiversitet [1]. Bland dessa föreningar har fenol en mångfald av mono- och polymerstrukturer som uppfyller ett brett spektrum av fysiologiska roller [2]. Biosyntesen av specialiserade metaboliter påverkas i hög grad av miljöfaktorer som temperatur, nederbörd eller solstrålning, som i sin tur ofta utsätts för latitudinella, longitudinella eller höjdled. Speciellt är ansamling av fenolföreningar ett allmänt svar på ökade nivåer av UV-B-strålning (280–315 nm). Specifik föreningsvariation har rapporterats i växter som växer i Medelhavsområdet under sommaren och på höga höjder, där en högre förekomst av UV-B förekommer och kanelsyror och flavonoider visade de högsta UV-absorptionshastigheterna [3].

Arbutin(hydrokinon -D-glukosid) är en enkel fenolförening med begränsad förekomst i bladen hos vissa arter som tillhör släkten som Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus eller Vaccinium. Den huvudsakliga naturliga källan till arbutin, björnbäret (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) har använts i århundraden för att behandla urinvägsinfektioner och andra njursjukdomar [4], och växtbaserade formuleringar framställs fortfarande nuförtiden [5]. Under de senaste åren har spektrumet av tillämpningar avarbutinhar breddats, mestadels som ett naturligt hudblekande medel i den kosmetiska industrin [6] och i kliniska terapier på grund av dessantioxidant, antibiotiska, antiinflammatoriska och antitumöregenskaper [7]. Följaktligen finns det ett ökande intresse för att hitta ytterligare naturliga källor tillarbutin, samt biotekniska processer som kan ersätta kemisk syntes [8,9]. I detta sammanhang har in vitro-produktion av arbutin med Datura inoxia-cellkulturer nått pilotskalan [10].

Dessutomarbutin, andra fenoliska föreningar bidrar till A. uva-ursi aktiva egenskaper, såsom flavonoider och tanniner [11,12], från vilka katekin respektive korilagin är de mest relevanta inbladen [13]. I livsmedelsindustrin ersätter naturliga föreningar som växtfenoler syntetiskaantioxidantkonserveringsmedel [14]. A. uva-ursi har använts som tillsats, särskilt i köttprodukter [15–19] men även i aktiva förpackningar [20]. Slutligen har potentialen för A. uva-ursi som en källa till garvningsmedel för läderindustrin nyligen föreslagits [21].

Monografin för "björnbärsblad" från European Medicines Agency [5] föreslog minst 7 procent avarbutininnehåll i torkade blad som krav på örtberedningar. Studier som utförts under de senaste decennierna beskrev arbutininnehållet i björnbärsblad som varierade från 0 procent till 18 procent, förklarat av analytiska procedurer, naturliga variationer, tillväxtförhållanden och skördedatum [4]. Arbutininnehåll bestäms vanligtvis genom högpresterande vätskekromatografi [4,12,22–24], och tidigare studier upptäckt högrearbutininnehåll i björnbärsväxter som samlats in på hösten än i de som samlas in på våren [4]. Olika björnbärskemotyper har beskrivits, associerade med den geografiska fördelningen och till den intraspecifika differentieringen i underarter av A. uva-ursi. Den mest slående fytokemiska variationen som rapporterats är frånvaron av arbutin i A. uva-ursi subsp. stipitata Packer och Denford, men även skillnader i innehåll av metylarbutin, ellaginsyra eller myricetin har hänvisats. Quercetin finns också i björnbärsblad, där både aglykoner, såväl som deras 3-O-glykosider är de vanligaste flavonoiderna [4]. De flesta av dessa studier utfördes dock för flera decennier sedan, och numera anses intraspecifik variation i björnbär vara kontinuerlig. De 14 underarterna som beskrivs, inklusive en från Spanien (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre,Alcaraz och MB Crespo), är för närvarande icke-accepterade namn och synonyma med A. uva-ursi [ 25]. Nya undersökningar behövs därför för att förbättra vår kunskap om de föreningar som faktiskt finns i råmaterialet som skördats från olika platser för industriella ändamål, eftersom den kemiska profilen för A. uva-ursi-blad har beskrivits innefatta en mångfald av fenoler, tanniner, och flavonoidsin nyare studier utförda för att undersöka skillnader på interspecifik nivå [23,26,27].

Genetisk (inklusive cytogenetisk) mångfald på befolkningsnivå främjar anpassning till olika miljöförhållanden [28]. Effekterna av polyploidisering på produktionen av specialiserade metaboliter i medicinska och aromatiska växter har nyligen granskats [29]. I detta sammanhang är genomstorlek en till stor del använd parameter i växtvariabilitetsbedömningar, eftersom den intraspecifika variationen ofta detekteras ([30], och referenser däri), korreleras med många andra biologiska egenskaper och spelar en relevant roll i evolutionära processer [31–35 ]. Studier som behandlar sambandet mellan nukleär DNA-mängd (dvs genomstorlek) och fytokemisk mångfald är dock mycket knappa [36,37]. Förhållandet mellan fytokemisk och genetisk mångfald har bedömts med hjälp av nukleära men speciellt plastidDNA-markörer [38], särskilt i medicinska [39] och odlade [40] växtarter.

Björnbär är brett spridd över det kringliggande området, men de flesta av de insamlade vilda populationerna i Europa finns i de östliga länderna, Österrike, Schweiz, Italien och Spanien. Arctostaphylos uva-ursi växer i den östra mitten av Spanien, i berg, i höjder från 550 till 2350 m över havet (ö. h.). Det är vanligare i norr eftersom populationer som ligger på lägre breddgrader är mindre frekventa och vanligtvis har färre individer. De befintliga studierna angående variationen i arbutinhalten i Spanien hänvisade till värden från 8 procent i nordöstra populationer [41] och 19 procent i spanskt växtmaterial utvärderade i en studie utförd i Tyskland [42]. Vår studie syftar till att klargöra faktorer, inklusive genomstorlek och genetisk mångfald, vilket förklarar fytokemisk variation över den naturliga distributionen av björnbär i Spanien. Våra resultat kan bidra till valet av växtmaterial för läkemedels-, kosmetik- och livsmedelsindustrin.

hudblekande mat:CISATNCHE

2. Resultat och diskussion

2.1. Kemisk mångfaldsanalys

Björnbärsblad provtagna från totalt 249 växter som växte på 42 spanska platser och under treårsperioden, 2014–2016 (Figur 1, Tabell S1), visade olika torrviktsprocent (dr wt), allt från 46,7 (LO) till 55,1 procent (CP), med ett genomsnitt på 50,1 ± 2,7 procent (data visas inte). Metanolextrakt framställda från prover som samlats in 2014 och 2015 användes för bestämning av totala fenoler och arbutinhalt. Vi observerade ett brett spektrum av kontinuerliga variationer för båda parametrarna med signifikanta skillnader (p < 0,001)="" mellan="" växter.="" bladextrakt="" från="" 80="" växter="" provtagna="" hösten="" 2014="" (figur="" 2a)="" visade="" totala="" fenolhalter="" från="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" dr="" vikt="" (prov="" li-4)="" till="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" dr="" vikt="" (sr)="" -2),="">arbutininnehållet fluktuerade från 92.0 ± 3.0 mg/g dr vikt (AN-6) till 194,2 ± 5,6 mg/g dr vikt (SE-8). Analys av extrakt framställda från löv samlade i 2015 från 94 växter (Figur 2b) visade också en stor fytokemisk variation, från 110,5 ± 3,6 mg GAE/g dr wt(PI-4) till 200,9 ± 9,8 mg GAE/g dr vikt (LO-4) i totalt fenolhalt, medan arbutinhalten varierade mellan 87,1 ± 0,4 mg/g dr vikt (ET-2) och 211,5 ± 5,9 mg/g dr vikt (LI) -2). Dessutom, oavsett insamlingsår, betydande skillnader i totala fenoler ocharbutininnehåll detekterades bland björnbärsväxter som växte på samma plats för de flesta av populationerna (data visas inte). Arbutinnivåer var signifikant korrelerade med totala fenolinnehåll i björnbärsbladextrakt eftersom vi uppskattade signifikanta Pearson-koefficienter på {{0}} .332 (p=0.003) för 2014 och 0,289 för 2015 data (p=0.005). Arbutininnehållet i de 48 plantorna som provades under båda åren varierade inte signifikant (p=0.380).

Trots variationen inom populationer, och oavsett skördeår, visade variansanalys att arbutininnehållet i extrakt av bärbärsblad också berodde (p < {0}}.00="" 1)="" plats="" på="" populationen="" (figur="" 3a,b),="" som="" inträffade="" för="" totalt="" fenolinnehåll="" i="" björnbärsblad="" analyserade="" i="" 2015="" (p="">< 0.001,="" figur="" 3b).="" däremot="" observerades="" inte="" signifikanta="" skillnader="" i="" totalt="" fenolinnehåll="" (p="0.080)" bland="" de="" 10="" populationer="" som="" provades="" 2014,="" som="" var="" belägna="" i="" ett="" relativt="" litet="" område,="" men="" fördelade="" på="" ett="" brett="" höjdområde,="" från="" 424="" (ba)="" befolkning)="" till="" 1410="" m="" ö.h="" (pa-befolkning).="" denna="" variation="" i="" höjd="" var="" associerad="" med="" skillnader="" i="" klimatförhållanden="" (tabell="" s1),="" eftersom="" platser="" på="" högre="" höjder="" kännetecknades="" av="" lägre="" medeltemperaturer="" (pearsons="" korrelationskoefficient,="" r="−0,666," p="">< 0,001)="" och="" högre="" årliga="" nederbörd="" (="" r="0.485," p="">< 0,001),="" vilket="" intur="" resulterade="" i="" lägre="" globala="" strålningsnivåer="" (r="−0,390," p="">< 0,001).="" vidare,="" från="" denna="" datauppsättning="" visades="" en="" låg="" men="" signifikant="" positiv="" korrelation="" mellan="" årlig="" nederbörd="" och="" totalt="" fenolinnehåll="" i="" björnbärsväxter="" (spearmans="" koefficient="" rho="0.256," s="0.022)," medan="" från="" 2015="" års="" datauppsättning="" när="" vi="" tog="" prov="" på="" populationer="" i="" ett="" större="" område="" upptäckte="" vi="" en="" signifikant="" positiv="" korrelation="" mellan="" årlig="" nederbörd="" och="" arbutininnehåll="" (rho="0.246," p="0}.017)." denna="" signifikanta="" korrelation="" indikerar="" att="" bärbärsväxter="" som="" växer="" på="" nordliga="" platser="" och="" på="" relativt="" högre="" höjder="" ofta="" visade="" sig="">arbutininnehåll (rho=0.217, p=0.035 respektive rho=0.269, p=0.009). Som nämnts korrelerade dessa högre arbutinhalter signifikant till högre totala fenolhalter i björnbärsblad, som liknade (i genomsnitt 154,4 ± 19,6 mg GAE/g dr vikt) de som finns i vattenextrakt från andra växtarter som används somantioxidanttillsatser inom livsmedelsindustrin [43], såsom asrosmarin (185,0 mg GAE/g dr vikt), te (149,3 mg GAE/g dr vikt) eller guava (154,4 mg GAE/g dr vikt). Dessa resultat överensstämmer med tidigare referenser och bekräftades i en studie utförd av Wrona et al. [20] med några av de spanska proverna av björnbärsblad som samlades in 2015, för vilka högreantioxidantkapacitet var förknippad med högrearbutininnehåll. Elitbärbärsgenotyper kunde också identifieras för detta ändamål, såsom individer 1, 4, 7 och 8 från LO-populationen, som ackumulerade i genomsnitt 183,3 ± 16,4 mg GAE/g dr vikt under de två åren av studien.

För att ytterligare belysa klimatiska och geografiska faktorer som påverkar fenolvariationsmönstren genomförde vi en mer uttömmande provsamling hösten 2016: 140 björnbärsväxter som växte på 29 platser, och vi kvantifierade fem fenolföreningar (Figur S1a) som identifierades genom sameluering med standarder i en acetonitril/vattengradient (Figur S1b). Analys visade ett stort antal kontinuerliga variationer för innehållet av arbutin, koffeinsyra, katekin, myricetin och quercetinglukosid, med signifikanta skillnader mellan växter som också allmänt observerades inom populationer (data visas inte). För de huvudsakliga fenolbeståndsdelarna fann vi att arbutinhalten varierade från 91,1 ± 5,0 (LB{{10}}) till 232,4 ± 2,8 mg/g dr vikt (PT{{15) }}), medan katekininnehållet varierade från 4,1 ± 0.1 (AF{{20}}) till 45,5 ± 1,4 mg/g dr vikt (LB-5). När det gäller de två andra flavonoiderna som bestämdes, upptäcktes inte myricetin i vissa växter från flera populationer, medan det nådde 21,2 ± 1,2 mg/g dr vikt i PO{{30}}, och quercetinglukosid varierade från 3,8 ± 0,1 (CO -3) till 22,8 ± 0,8 mg/g dr vikt (BT-3). Lägre halter av koffeinsyra bestämdes i extrakt av björnbärsblad, som varierade från 1,8 ± 0,0 (IZ-1) till 7,1 ± 0,3 mg växter/g dr vikt (SI-4).

Trots variationen som observerats mellan individer, uppskattades också signifikanta skillnader mellan populationer för dessa fem föreningar (Kruskal–Wallis-tester, p < {0}}.001="" och="" p="0." 009="" for="" koffeinsyrainnehåll).="" högre="" arbutinhalter="" bestämdes="" i="" genomsnitt="" i="" växter="" från="" ab,="" gu,="" ln="" och="" lo="" naturliga="" populationer="" (figur="" 4a),="" som="" skilde="" sig="" signifikant="" (efter="" bonferronicorrection)="" från="" de="" låga="" halter="" som="" hittats="" i="" växter="" från="" lb-populationen="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,="" 169,5="" ±="" 10,0="" respektive="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" dr="" vikt="" fram="" till="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" dr="" vikt.="" om="">arbutininnehållet i växter som hade provtagits även under 2015 varierade inte signifikant mellan åren (p=0.821). Populationen LB visade i sin tur högre genomsnittlig katekinnivå (Figur 4b), som skilde sig signifikant från de låga medelhalterna av denna flavonoid som detekterats i populationerna AF och LC (32,8 ± 9,8 front till 5,7 ± 1,9 och 5,3 ± {{2{{62} }}},5 mg/g dr vikt respektive). Genomsnittlig myricetin- och quercetinglukosidhalt visas i figur 4c, med signifikanta skillnader mellan populationerna AB, CG, LB och PO, med högre myricetinhalt (15,1 ± 4.0, 14.6 ± 5.7, 10 0,7 ± 2,8 respektive 17,2 ± 3,9 mg/g dr vikt), jämfört med de låga nivåerna som ackumulerades på genomsnittliga växter från populationerna CO och OD (1,2 ± 1,5 respektive 2,4 ± 3,6 mg/g dr vikt) , och betyder också quercetin-glukosidinnehåll bestämt i populationer AA, BT, CP, IZ och LB (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 och 13,1 ± 3,7 mg/g skilda signifikant, ± 4,6 mg/g) från det i populationens CO (4,0 ± 0,1 mg/g dr vikt). Däremot svängde medelhalten av koffeinsyra från 2,1 ± 0,2 mg/g dr vikt i populationer AB, CE, PT och SA, till 3,5 ± 1,2 mg/g dr vikt i population AF eller 3,4 ± 2,2 mg/g dr vikt in population SI; därför observerades inte signifikanta skillnader på grund av variation inom populationen (genomsnittlig halt 2,7 ± 0,8 mg/g dr vikt). Dessa resultat kompletterar variationen på fenoliska metaboliter som observerats av Wrona et al. [20], för åtta av björnbärsplatserna som provades 2015 och som analyserades med UPLC®-ESI-Q-TOF med MSE-teknik.

Till skillnad från resultat som erhållits i analysen utförd med björnbärsprover från 2014 och 2015,arbutininnehåll bestämt i 2{{10}}16 prover visade låg men signifikant positiv korrelation med strålning (rho=0.256, p=0.002) och maximala medeltemperaturer (rho{ {5}}.183, p=0.030), och var därför omvänt korrelerade till årliga nederbördsvärden (rho=−0.265, p=0.002). Dessa skillnader var också associerade med variation i höjd (rho=−0,192, p=0.023), men denna negativa korrelation förklarades av den nämnda lågaarbutininnehåll av växter från LB-populationen som finns på 1720m. Ett liknande variationsmönster observerades för myricetininnehållet eftersom högre nivåer av denna förening var signifikant associerade med björnbärsväxter som växte på platser under högre strålningsnivåer (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). Det motsatta mönstret till det för arbutin observerades för katekin, eftersom en positiv korrelation uppskattades mellan denna flavonoid och årlig nederbörd (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1),="" och="" negativa="" korrelationer="" detekterades="" följaktligen="" med="" strålning="" och="" med="" maximal="" medeltemperatur="" (rho="−0.307," p="">< 0.001="" och="" rho="−0.470," p="">< 0.001,="" respektive).="" denna="" variation="" i="" klimatfaktorer="" förklarade="" att="" både="" höjd="" och="" latitud="" påverkade="" katekininnehållet="" i="" björnbärsblad="" (rho="0.410" respektive="" 0.490,="" p="">< 0.001).="" en="" huvudkomponentanalys="" utförd="" med="" fytokemiska,="" klimatiska="" och="" geografiska="" data="" motsvarande="" de="" 29="" platser="" som="" provades="" 2016,="" där="" de="" två="" första="" komponenterna="" förklarade="" 60="" procent="" av="" den="" observerade="" variationen,="" bekräftade="" dessa="" resultat="" (figur="" 5).="" vi="" upptäckte="" inte="" någon="" signifikant="" korrelation="" mellan="" koffeinsyra="" eller="" quercetinglukosidinnehåll="" i="" björnbärsväxter="" och="" vare="" sig="" klimatiska="" eller="" geografiska="" faktorer,="" även="" om="" vi="" uppskattade="" små="" men="" signifikanta="" korrelationer="" mellan="" myricetin-="" och="" quercetinglukosidinnehåll="" (rho="0.184," p="" {{31}="" }.030)och="" mellan="" myricetin-="" och="" koffeinsyrainnehållet="" (rho="−0.176," s="0.037)" i="">

De observerade kontrasterande klimatmönstren av variation iarbutininnehåll av björnbärsväxter tyder på att även om biosyntesen av denna metabolit sannolikt ökar under förhållanden med högre strålning och temperatur, är vattenbrist troligen en begränsande faktor för A. uva-ursi i Medelhavs- och södra regionerna. Del Valle et al. [44] rapporterade ett latitudinellt mönster av flavonoidackumulering av Silene littorea (Caryophyllaceae) i Spanien, där högre flavonoidhalter bestämdes i sydliga populationer, eftersom latitud korrelerade negativt med UV-B-strålning och temperatur, och positivt med nederbörd. Global strålning visar en tydlig latitudinell gradient med en högre incidens i södra och östra delen av den iberiska halvön, och det finns också en signifikant orografisk effekt eftersom molnpersistens modulerar förekomsten av denna strålning på högre höjder. En UV-strålningskarta över Spanien [45] refererad hög korrelation (r > 0.9) mellan UV-B och global strålningsdata. Enligt denna referens, björnbärspopulationer som visade högre medelvärdearbutininnehållet i vår studie är mestadels lokaliserat i områden med UV-B-strålningsnivåer på 2403–2451 J/m2.

Våra resultat för katekinvariation i björnbär visade ett geografiskt mönster (Figur 5) och överensstämmer med studier utförda på andra växtarter från nordliga länder i Europa. Högre halter av specialiserade metaboliter, såsom flavonoider och antocyaniner, rapporterades i växter som växte på högre breddgrader, troligen på grund av längre dagsljusperioder och lägre natttemperaturer [46]. Därigenom ökade lösliga fenolhalter i Juniperus communis nålar med latitud och höjd i Finlands befolkningar [47], och även 10–19 procent högre fenolhalter hittades på en högre latitud i frukter av tre Ribes spp. sorter analyserade på två finska platser [48]. Dessa författare relaterade lägre fenolhalt med högre nivåer av strålning och temperatur. Flavonoidhalten i frukter av två arter av Vaccinium (även från familjen Ericaceae) visade en geografisk gradient, med högre mängder av flavonoider på nordliga breddgrader [49,50].

I förhållande till höjdvariation bestämdes högre nivåer av flavonoider i populationer av andra Ericaceae-arter, Calluna vulgaris, som växer på högre höjder [51]. Höjdgradienter påverkade också den specialiserade metabolismen hos spanska populationer av Arnica montana [52] och Quercus robur[53]. Det sistnämnda arbetet hänvisade till ett signifikant positivt samband mellan koncentrationen av totala bladfenoler och höjden, eftersom gradienten endast beror på flavonoider, vilket tyder på att dessa föreningar drev förhållandet för totala fenoler. Dessa resultat överensstämmer med våra uppskattningar för katekininnehållsmönstret. Slutligen var en nederbördsgradient associerad med signifikanta skillnader i polyfenolers sammansättning i en afrikansk medicinsk buske (Myrothamnus flabellifolia) för vilken metabolomiska skillnader var kongruenta med populationernas genetiska struktur [54].

CISTANCHE CAN ANTI-AGEING

2.2. Genomstorlek och sekvensdataanalys

Genomstorlek 2C-värden för bärbärsväxter varierade från 2,50 till 3,15 pg (tabell 1). Små skillnader i mängden nukleärt DNA har hittats bland populationer (Kruskal–Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). Dunns test med Bonferroni-korrigering avslöjade statistiskt signifikanta skillnader mellan: AL- och SI-populationer (Z=−3.972, p=0.024), LE och SI (Z=−4.196, p {{ 21}}.009), och SE och SI (Z=-4.236, s=0.008). Populationen av Pontils (PO) är typlokaliteten A. uva-ursi var.crassifolius, som sedan kombinerades som A. uva-ursi subsp. crassifolius, och för närvarande inte betraktad taxonomiskt (se introduktionen), har ett mellanvärde (2,88 pg), inom värdeintervallet som erhålls i andra populationer av arten. Detta är den första omfattande populationsstudien av nukleär DNA-mängd i arten och hela släktet eftersom den enda tillgängliga informationen idag kommer från en Balkanpopulation av samma taxon [55]. Det rapporterade 2C-värdet där, 2,49 pg, är placerat precis vid den nedre gränsen för variationsintervallet för den här undersökta datamängden. Ingen korrelation mellan genomstorleksvärden och populationshöjd hittades. DNA-mängden av individer visade en svag positiv signifikant korrelation medarbutininnehåll när data från 158 björnbärsväxter jämfördes (rho=0.187, p=0.018), medan ingen annan signifikant korrelation mellan genomstorlek och andra variabler hittades. Detta resultat överensstämmer med de rapporterade ökningarna i produktionen av specialiserade metaboliter som vanligtvis observeras i medicinska och aromatiska växter efter polyploidisering [29].

Nyproducerade sekvenser för rpl{0}}trnL och psbE-petN intergena spacers ställdes upp i två matriser (innehållande 566 respektive 874 bp) som var sammanlänkade i en enda matris på 1440 bp.Moderat nivåer av variation i dessa plastidregioner detekterades (sex nukleotidsubstitutioner och fyra indelar). Tio olika haplotyper hittades med en total haplotypdiversitet (Hd) på 0.468 (tabell 1). De flesta populationer (21) innehöll endast en haplotyp, medan fem av dem uppvisade en viss mångfald bland individer. Den mest förekommande haplotyp 1 visade den högsta frekvensen (71,4 procent), följt av haplotyp 2 (15,2 procent), medan resten av dem visade mycket lägre frekvenser (0,04–0,01 procent). Den geografiska fördelningen av haplotyper visas i figur 6. Haplotyp 1 hittades i 32 populationer – den var fixerad i 18 av dem – fördelade över alla provtagna regioner förutom de sydligaste lokaliteterna. Haplotyp 2 hittades i tio populationer och var den exklusiva haplotypen i de två sydligaste populationerna (HU och LV) samt i PR. Haplotyp 4 var privat från tre populationer från Pyrenéerna, medan haplotyp 8 förekom i två populationer från östra Iberiska halvön. När det gäller de evolutionära sambanden som visas i parsimoninätverket (Figur 6), är de flesta haplotyperna förbundna med ett eller två mutationssteg. Haplotyp 1 upptar en centralposition, med sju haplotyper kopplade till den.

Ett Mantel-test mellan pDNA-genetiska och kemiska parvisa distansmatriser visade svag men signifikant korrelation (r=0.301; p=0.048) mellan genetisk differentiering och koncentrationen av de fem kemiska komponenterna som uppmätts för 2016 datamängd. Manteltestet avslöjade inte någon signifikant korrelation mellan genetiskt och geografiskt avstånd bland de 25 populationer som provades 2016 (r=0.103, p=0.207) eller mellan de kemiska och geografiska parvisa avstånden mellan dessa 25 populationer (r=0.191, p=0.050). Den fytokemiska variationen som rapporteras här för vilda björnbärspopulationer över hela Spanien kompletteras därför av måttliga nivåer av pDNA-haplotypvariation, vilket är den nord-sydliga genetiska differentieringen som finns i björnbärspopulationer jämförbar med fylogeografiska mönster som finns i andra växter (t.ex. [56–58]. All denna homogenitet förväntas i växter med låg reproduktionsförmåga [59], som A. uva-ursi, som uppvisar dålig groningshastighet och hög dödlighet hos unga plantor [4]. Ändå korrelerade den blygsamma genetiska differentieringen som pDNA visar med biokemiska parvisa avstånd uppskattade från profiler för fem fenoliska figurer. Figur 6. Geografisk fördelning av pDNA-haplotyper på iberiska populationer av Arctostaphylos uva-ursi. Populationskoder motsvarar de i Tabell S1, och cirkeldiagram representerar procentandelen individer som visar varje haplotyp i varje population. rektangel, det statistiska sparsamhetsnätverket som visar de evolutionära sambanden mellan te n plastidhaplotyper som finns i A. uva-ursi populationsis representerade. Varje remsa längs linjerna som förbinder haplotyperna indikerar ett mutationssteg i pDNA-regionerna som sekvenserades i denna studie. Ett manteltest mellan pDNA:s genetiska och kemiska parvisa distansmatriser visade svag men signifikant korrelation (r=0.301; p {{28 }}.048) bland genetisk differentiering och koncentrationen av de fem kemiska komponenterna uppmätt för 2016 års datamängd. Mantel-testet avslöjade inte någon signifikant korrelation mellan genetiskt och geografiskt avstånd bland de 25 populationerna under 2016 (r=0.103, p=0.207) eller mellan de kemiska och geografiska parvisa avstånden bland dessa 25 populationer ( r=0.191, sid=0.050). Den fytokemiska variationen som rapporteras här för björnbärsvilda populationer över hela Spanien kompletteras därför av måttliga nivåer av pDNA-haplotypvariation, vilket är den nord-sydliga genetiska differentieringen som finns i björnbärspopulationer jämförbar med fylogeografiska mönster som finns i andra växter (t.ex. [56–58]). All denna homogenitet förväntas inplantor med låg reproduktionsförmåga [59], som A. uva-ursi, som uppvisar låga groningshastigheter och hög dödlighet hos unga plantor [4]. Ändå korrelerade den blygsamma genetiska differentieringen som pDNA visar med biokemiska parvisa avstånd uppskattade från profiler Detta mönster av genetisk och fytokemisk variation (som, som nämnts, inte var associerad med geografiska avstånd), såväl som den svaga men signifikanta korrelationen mellan genomesstorlek och arbutininnehåll, kan indikera att naturlig genomisk variation påverkar utbytet av fenolföreningar i A. uva-ursi. Men hypervariabel molekylär m arkers i en mer omfattande populationsprovtagning är nödvändiga för att bekräfta dessa fylogeografiska mönster och sambandet mellan genetisk och biokemisk variabilitet.

CISTANCHE HAR ANTIOXIDATIONSEFFEKT

3. Material och metoder

3.1. Växtmaterial

För fytokemisk analys togs totalt 249 bärbärsplantor som växte i 42 populationer under hösten 2014, 2015 och 2016, vilket är representativt för den naturliga fördelningen av denna växtart på den iberiska halvön (Figur 1 och Tabell S1). Först, hösten 2014, samlade vi terminalskott från 80 växter i tio spanska populationer (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC och SE) belägna på ett relativt litet område (80 × 50 km ungefär) i norra Spanien men på ett brett höjdområde (424–1410 m ö.h.). För det andra, hösten 2015, samlade vi in ​​48 växter från sex av dessa populationer (AG, LI, LO, PA, SE och SR) och 46 bärbärsplantor från sex populationer belägna på lägre breddgrader (AL, CH, ET, HU, LV och PI). För varje population tog vi prov på åtta plantor som var åtskilda på minst 5 m, förutom i HU, där vi bara hittade sex individer. För det tredje, hösten 2016, provtogs totalt 140 plantor på 29 olika platser (1–6 individer från varje), inklusive 26 nya spanska orter (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY, LN och ZU). Vår provtagning sträcker sig över ett höjdområde från 534 till 1750 m. Sammantaget representerar de 42 populationerna ett brett spektrum av klimatförhållanden (tabell S1): maximal medeltemperatur visade 2-faldig variation (13–26 ◦C) och årlig nederbörd pendlade från 399 (ZU) till 1589 mm (PT). Global strålning varierade från 4,2 till 5,1 kWh/m2d. Sex till tio terminalskott (15–20 cm långa) samlades in för varje planta för att få 6–15 g friska blad, som därefter skars ut och torkades vid 60 ◦C till konstant vikt (3–4 dagar). Efter torrviktsbestämningar homogeniserades bladen manuellt i en mortel och lagrades vid 4 ◦C tills de analyserades. Detta växtmaterial användes för totala fenoler och HPLC-bestämningar.

Bladmaterial för flödescytometriska bedömningar erhölls från färska blad från 178 individer som tillhörde totalt 37 populationer (tabell 1). Prover togs från 33 av populationerna som nämns ovan och från fyra nya populationer (BE, JO och PR i Spanien och EN i Andorra) där löv samlades in våren 2017 och därför inte ingick i den fytokemiska analysen (Figur 1 och Tabell S1). Från en till sex individer per population mättes dubbelt. Bladmaterial för DNA-extraktion torkades i silikagel och förvarades vid rumstemperatur. DNA-diversitetsanalyser utfördes i totalt 105 växter från 35 platser (tabell 1).

Växtkuponger för de 46 björnbärspopulationerna som studerats deponeras i herbariet BC, på Institutet Botànic de Barcelona, ​​i herbariet BCN, i Centre de Documentació de Biodiversitat Vegetal, Universitat de Barcelona eller i herbariet JACA, av Instituto Pirenaico de Ecología( CSIC).

3.2. Beredning av bladextrakt och bestämning av totala fenoler

Tre kopior av extrakt av bärbärsblad framställdes genom att använda 50 mg torkat prov och 10 ml 80 procent metanol. Rören inkuberades i 3 0 min i ett ultraljudsbad och sedan filtrerades extrakten (0,45 mm) och lagrades vid 4 ◦C tills analys. Den totala fenolhalten bestämdes i extrakten framställda från prover som samlats in 2014 och 2015. Vi följde en Folin-Ciocalteumetod [60,61] med små modifieringar: till 0,1 ml extrakt, 0,4 ml metanol (80 procent), 0,5 ml Folin- Ciocalteu-reagens och 8 ml ultrarent vatten tillsattes. Efter 5 min i ett ultraljudsbad tillsattes 1 ml Na2CO3 20 % (vikt/volym). Proverna lämnades i mörker i 30 minuter innan absorbansen mättes vid 760 nm med en UV-synlig spektrofotometer (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). Resultaten uttrycktes i gallussyraekvivalenter (GAE); det vill säga mg gallussyra/g dr vikt, med en standardkurva för gallussyra (40–340 µg/g).

3.3. Arbutin och andra fenoliska metaboliter Bestämning

Fenolhalten i metanoliska extrakt av bärbärsblad kvantifierades med RP-HPLC med ett HPLC-UV/Vis-system (LaChrom Merck Hitachi L-7400) med en Kinetex 5 µm-EVO C18(250 mm × 4,6 mm ) kolonn och absorbans bestämd vid 280 nm. Extrakt från prover insamlade 2014 och 2015 späddes 1:10 (v/v) och injicerades med en mobil fas av metanol och acetonitril. Gradientprogrammet bestod av 0–5 min, 25 procent av metanol; 5–6 min, 100 procent ; 6–10 min, 100 procent; och 10–20 min, återigen 25 procent metanol. Flödeshastigheten var 1 ml/min och injektionsvolymen var 20 µL. Under dessa förhållanden är retentionstiden förarbutinvar 2,6 min, vilket gjorde det möjligt för oss att bestämma koncentrationen av denna förening med hjälp av en kalibreringskurva upprättad med 6 spädningar av en standard, från 40 till 340 µg/g, med en korrelationskoefficient på r=0. 9997. Extrakt från prover som tagits 2016 analyserades med en mobil fas av metanol och vatten med följande gradientprogram: 0–5 min, 10 procent metanol; 5–6 min, 20 procent ; 6–10 min, 20 procent ; 10–11 min, 30 procent ; 11–15 min, 30 procent ;15–16 min, 40 procent ; 16–20 min, 40 procent ; 20–21 min, 50 procent ; 21–25 min, 50 procent ; 25–26 min, 60 procent ; 26–30 min, 60 procent ;30–31 min, 10 procent ; och 31–36 min, återigen 10 procent metanol. Under dessa förhållanden bestämde viarbutin ochandra 4 fenolföreningar: koffeinsyra, katekin, myricetin och quercetin-3-O-glukopyranoside med hjälp av motsvarande kalibreringskurvor etablerade med 5 utspädningar av standarder (25–500 µg/mL) ,som visade korrelationskoefficienter på {{10}}.9992 för katekin (retentionstid 12,0 min), 0,9924 för koffeinsyra (retentionstid 13,4 min), 0,9981 för quercetin{{16} }O-glukosid (retentionstid 23,4 min) och 0,9997 för myricetin (retentionstid 25,1 min).

Metanol och acetonitril var i HPLC-kvalitet och köptes från Panreac (Barcelona, ​​Spanien). Standarder (renhet Större än eller lika med 98 procent)arbutin, koffeinsyra och gallussyra, samt Folin-Ciocalteu-reagenset köptes från Sigma-Aldrich (Barcelona, ​​Spanien). Catechin och quercetin-3-O-glukopyranosidestandarder köptes från Extrasynthese (Genay Cedex, Frankrike), medan myricetin köptes från Alfa Aesar (Karlsruhe, Tyskland).

Resultaten av kemiska bestämningar analyserades med SPSS v. 25-programvara och R 3.5.2. Efter att ha testat data för normalitet och homoskedasticitet utförde vi variansanalysen av olika uppsättningar av data och medelseparationstest (Tukey och Tamhane) eller icke-parametriska tester som Kruskal–Wallis och Dunns multipla jämförelsetest med Bonferroni-korrigering. Vi uppskattade också korrelationskoefficienter (Pearson eller Spearman beroende på om data följde en normal fördelning) mellan variabler, inklusive genomstorlek.

CISTANCHE HAR ANTIOXIDATIONSEFFEKT

3.4. Genomstorleksuppskattningar och DNA-sekvensering

Genomstorleken för björnbärsväxter uppskattades med flödescytometri vid Centers Científicsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB) enligt procedurerna som förklaras i Pellicer et al. [62].Petunia hybrida Vilm. 'PxPc6' (2C=2.85 pg) användes som intern standard. Frön av standarden tillhandahölls av Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS—I2BC (Gif-sur-Yvette, Frankrike). Nukleärt DNA-innehåll (2C) beräknades genom att multiplicera det kända DNA-innehållet i standarden med kvoten mellan topppositioner (mod) för målarten och standarden i histogrammet av fluorescensintensiteter, förutsatt en linjär korrelation mellan de fluorescerande signalerna från de färgade kärnorna i det okända provet, den kända interna standarden och DNA-mängden [63].

Ungefär 20 mg kiseldioxidtorkad bladvävnad användes för DNA-extraktion med användning av ett CTAB-protokoll [64] med mindre modifieringar. Kvaliteten på totalt DNA kontrollerades med en NanoDrop 1000 spektrofotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA). De plastidintergena regionerna rpl32-trnLand psbE-petN, såväl som den nukleära ribosomala DNA-regionen ITS, amplifierades och sekvenserades i tre individer per population. Sekvenser av ITS visade ingen variabilitet inom de 105 analyserade individerna, förutom några få positioner som visar intragenomiska nukleotidpolymorfismer. Därför uteslöts denna nukleära ribosomala DNA-region från ytterligare analys. Andra plastid-DNA-regioner (dvs. ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; och trnL-trnF) testades också men de kasserades på grund av låg variabilitet eller sekvenseringsproblem. Amplifieringsförfarandet utfördes såsom beskrivs i Vitales et al. [65]. Direkt sekvensering av de amplifierade DNA-segmenten utfördes med Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) vid Unitatde Genòmica, CCiTUB, på en ABI PRISM 3700 DNA-analysator (PE Biosystems). rpl32-trnL ochpsbE-petN-sekvenserna sattes ihop med BioEdit version 7.1.3.0 [66], justerade med ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] och justerades manuellt. GenBank-åtkomstnummer finns i Tabell S2.

3.5. Genomstorlek och genetisk analys

Ett icke-parametriskt Kruskal-Wallis-test utfördes för att kontrollera statistiskt signifikanta skillnader mellan 2C-värden mellan populationer. Dunns multipla jämförelsetest utfördes också för att fastställa vilka populationer som visade signifikanta skillnader mellan dem. Bonferroni-korrigeringen användes för att minimera typ I-felet (falskt positivt).

Genetiska mångfaldsparametrar (polymorfa platser, informativa platser för sparsamhet, antalet haplotyper och total haplotypdiversitet) uppskattades med hjälp av DnaSP v6 [68]. Plastidhaplotyper bestämdes i en kombinerad datamängd som inkluderade både rpl32-trnL- och psbE-petN-regionerna. Indels kodifierades med FastGap v.1.2 [69] och behandlades som enkelmutationshändelser. De evolutionära förhållandena mellan haplotyper härleddes baserat på ett sparsamhetsnätverk konstruerat med hjälp av TCS [70] som implementerat i PopArt [71]. Det maximala antalet skillnader till följd av singelsubstitutioner bland haplotyper beräknades med 95 procents konfidensgränser.

För att analysera sambandet mellan genetiska och kemiska data utfördes ett Mantel-test. Först uppskattade vi det fenotypiska avståndet bland 25 populationer med hjälp av data från björnbärsväxter som samlades in 2016, som hade mätts för fem fenoliska komponenter (dvs.arbutin, katekin, koffeinsyra, quercetin och myricetin). Vi använde R Commander för att standardisera dessa data [72], och därefter för att beräkna det kemiska avståndet som härrör från den standardiserade matrisen med funktionen "Dist" onR baserat på euklidiska avstånd. För det andra beräknades en Neis populations genetiska parvisa distansmatris mellan de 25 populationerna med hjälp av DnaSP v6. Slutligen beräknade vi de parvisa geografiska avstånden bland dessa populationer med hjälp av paketet "geodist" i R. Parvisa korrelationer mellan avståndsmatriser beräknades med ett Mantel-test med 10,000 permutationer med funktionsmanteln tillgänglig i R-paketet "vegan" [ 73].

4. Sammanfattningar

Alla analyserade björnbärsplantor visadearbutininnehåll högre än 7 procent; därför är detta växtmaterial lämpligt för örtberedningar. Vår analys avslöjade högre arbutininnehåll än de (upp till 9 procent) som hänvisas till av Parejo et al. [40], som analyserade fyra populationer belägna i nordöstra Pyrenéerna vid 1580–2030 m och upptäckte låga skillnader i arbutininnehåll bland populationer. Dessutom ligger de flesta av de värden som bestäms häri inom området för det växtmaterial som valts ut för odling i Polen [74] och i överensstämmelse med de högaarbutininnehållet i prover av spanska bärbärsblad rapporterade av Sonnenschein och Tegtmeier [42] vid val av växter för odling i Tyskland. Elitgenotyper av A. uva-ursi kunde förökas vegetativt, men de flesta av de erhållna klonerna misslyckades under fältetablering, vilket begränsade utnyttjandet av dessa resurser. Vi beskrev också den existerande variationen i innehållet av tre flavonoider (katekin, myricetin och quercetinglucoside), såväl som av koffeinsyra, bland spanska bärbärspopulationer, och hur klimatfaktorer (främst global strålning och nederbörd), som korrelerade till latitudinella och höjdled. gradienter, påverkar den variationen. Samtidigt, trots de låga nivåerna av haplotyp och genomstorleksvariabilitet bestämd i Iberian A. uva-ursi, var genetisk och cytogenetisk differentiering av populationer svagt men signifikant associerad med fytokemisk mångfald. Sammantaget visar dessa resultat att effekten av både genetiska och abiotiska faktorer måste övervägas för att förklara intraspecifik fytokemisk variation som finns i växter från vilda populationer.

CISTANCHE EFFEKTER

Referenser

1. Moore, BD; Andrew, RL; Külheim, C.; Foley, WJ Förklara intraspecifik mångfald i växt sekundära metaboliter i ett ekologiskt sammanhang. Ny Phytol. 2014, 201, 733–750. [CrossRef] [PubMed]

2. Cheynier, V.; Comte, G.; Davies, KM; Lattanzio, V. Växtfenoler: senaste framsteg på deras biosyntes, genetik och ekofysiologi. Plant Physiol. Biochem. 2013, 72, 1–20. [CrossRef]

3. Bernal, M.; Llorens, L.; Julkunen-Tiitto, R.; Badosa, J.; Verdaguer, D. Höjd- och säsongsförändringar av fenoliska föreningar i Buxus sempervirens blad och nagelband. Plant Physiol. Biochem. 2013, 70, 471–482.[CrossRef] [PubMed]

4. Upton, R. (Ed.) Uva-ursi Leaf. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Standard för analys, kvalitetskontroll och terapi; American Herbal Pharmacopoeia: Scotts Valley, CA, USA, 2008; 30p.

5. Europeiska läkemedelsmyndigheten. Utvärderingsrapport om Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Folium. EMA/HMPC/750266/2016; Europeiska läkemedelsmyndigheten: Amsterdam, Nederländerna, 2018.6. Kanlayavattanakul, M.; Lourith, N. Växter och naturliga produkter för behandling av hudhyperpigmentering—En recension. Planta Med. 2018, 84, 988–1006. [CrossRef]

7. Migas, P.; Krauze-Baranowska, M. Betydelsen av arbutin och dess derivat i terapi och kosmetika. Phytochem. Lett. 2015, 13, 35–40. [CrossRef]

8. Seo, DH; Jung, JH; Lee, JE; Jeon, EJ; Kim, W.; Park, CS Bioteknologisk produktion av arbutin (- och -arbutin), hudblekande medel och deras derivat. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 95, 1417–1425.[CrossRef]

9. Zhu, X.; Tian, ​​Y.; Zhang, W.; Zhang, T.; Guang, C.; Mu, W. Nyligen framsteg vad gäller biologisk produktion av -arbutin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Davey, M. Sekundär metabolism i växtcellskulturer. I Encyclopedia of Applied Plant Sciences, 2nd ed.;Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, Eds.; Elsevier: London, Storbritannien, 2017; Volym 2, s. 462–467. [CrossRef]

11. Kurkin, VA; Ryazanova, TK; Daeva, ED; Kadentsev, VI Beståndsdelar av Arctostaphylos uva-ursi leaves.Chem. Nat. Compd. 2018, 54, 278–280. [CrossRef]

12. Panda, A.; Petrucci, R.; Marrosu, G.; Multari, G.; Romana-Gallo, F. HPLC-PDAESI-TOF/MS metabolisk profilering av Arctostaphylos pungens och Arctostaphylos uva-ursi: En jämförande studie av fenoliska föreningar från metaboliskt bladextrakt. Fytokemi 2015, 115, 79–88. [CrossRef]

13. Olennikov, DN; Chekhirova, GV 60-Galloylpicein och andra fenoliska föreningar från Arctostaphylos uva-ursi.Chem. Nat. Compd. 2013, 49, 1–7. [CrossRef]

14. Brewer, MS Naturliga antioxidanter: källor, föreningar, verkningsmekanismer och potentiella tillämpningar.Compr. Rev. Food Sci. Mat Saf. 2011, 10, 221–247. [CrossRef]

15. Amarowicz, R.; Pegg, RB; Rahimi-Moghaddam, P.; Bare, B.; Weil, JA Friradikalfångande kapacitet och antioxidantaktivitet hos utvalda växtarter från de kanadensiska prärierna. Food Chem. 2004, 84, 551–562.[CrossRef]

16. Carpenter, R.; O'Grady, MN; O'Callaghan, YC; O'Brien, NM; Kerry, JP Utvärdering av antioxidantpotentialen hos druvfrö- och bärbärsextrakt i rått och kokt fläsk. Kött Sci. 2007, 76, 604–610. [CrossRef][PubMed]

17. Mekini´c, IG; Skroza, D.; Ljubenkov, I.; Katalini'c, V.; Šimat, V. Antioxidant och antimikrobiell potential av fenoliska metaboliter från traditionellt använda medelhavsörter och kryddor. Foods 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. Mohd Azman, NA; Gallego, MG; Segovia, F.; Abdullah, S.; Shaarani, SM; Almajano, MP Studie av egenskaperna hos björnbärsbladextrakt som en naturlig antioxidant i modellmat. Antioxidants 2016, 5, 11.[CrossRef] [PubMed]

19. Pegg, RB; Amarowicz, R.; Naczk, M. Antioxidantaktivitet hos polyfenoler från björnbärsblad (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) extrakt i köttsystem. I fenoliska föreningar i livsmedel och naturliga hälsoprodukter; Shahidi, F., Ho, CT, Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, USA, 2005; s. 67–82.[CrossRef]

20. Wrona, M.; Blasco, S.; Becerril, R.; Nerín, C.; Försäljning, E.; Asensio, E. Antioxidant- och antimikrobiella markörer av UPLC®–ESI-Q-TOF-MSE av en ny aktiv förpackning i flera lager baserad på Arctostaphylos uva-ursi. Talanta2019, 196, 498–509. [CrossRef]

21. Maier, M.; Olbermann, AL; Renner, M.; Weidner, E. Screening av europeiska medicinska örter på deras tannininnehåll—Nya potentiella garvningsmedel för läderindustrin. Ind. Crop. Driva. 2017, 99, 19–26. [CrossRef]

22. Boros, B.; Jakabová, S.; Madarász, T.; Molnár, R.; Galambos, B.; Kilár, F.; Fellinger, A.; Farkas, A. ValideradHPLC-metod för samtidig kvantifiering av bergenin, arbutin och gallsyra i blad av olika Bergenia-arter. Chromatographia 2014, 77, 1129–1135. [CrossRef]

23. Miaw-Ling, C.; Chur-Min, C. Samtidig HPLC-bestämning av hydrofilt vitmedel i en kosmetisk produkt. J. Pharm. Biomed. Anal. 2003, 33, 617–626. [CrossRef]

24. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Ett enda extraktionssteg i den kvantitativa analysen av arbutinin björnbärsblad (Arctostaphylos uva-ursi) genom högpresterande vätskekromatografi. Phytochem. Anal.2001, 12, 336–339. [CrossRef]

25. STRÖM. Världens växter online. Tillgänglig online: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (tillgänglig den 29 april 2020).

26. Saleem, A.; Harris, CS; Asim, M.; Cuerrier, A.; Martineau, L.; Haddad, PS; Arnason, JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD-metod för karakterisering av medicinska Ericaceae som används av Eeyou IstcheeCree First Nations. Phytochem. Anal. 2010, 21, 328–339. [CrossRef] [PubMed]

27. Stefanescu, BE; Szabo, K.; Mocan, A.; Crisan, G. Fenoliska föreningar från fem blad av Ericaceae-arter och deras relaterade biotillgänglighet och hälsofördelar. Molecules 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. Onda, Y.; Mochida, K. Utforska genetisk mångfald i växter med hjälp av sekvenseringstekniker med hög genomströmning. Curr. Genom. 2016, 17, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

29. Iannicelli, J.; Guariniello, J.; Tossib, VE; Regalado, JJ; Di Ciaccioa, L.; van Barene, CM; Pitta Álvarez, SI;Escandón, AS Den "polyploida effekten" vid uppfödning av aromatiska och medicinska arter. Sci. Hortic. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. Leitch, IJ; Leitch, AR Genomstorleksmångfald och evolution i landväxter. In-Plant Genome Diversity Volum 2, Fysisk struktur, beteende och utveckling av växtgenom; Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J., Wendel, JF, Eds.; Springer: Wien, Österrike, 2013; s. 307–322. [CrossRef]

31. Bennett, MD; Leitch, IJ Nukleära DNA-mängder i angiospermer—Framsteg, problem och framtidsutsikter.Ann. Bot. 2005, 95, 45–90. [CrossRef]

32. Gregory, TR (Red.) Genomets utveckling; Elsevier: San Diego, CA, USA, 2005.

33. Hoang, PN; Schubert, V.; Meister, A.; Fuchs, J.; Shubert, I. Variation i genomstorlek, cell- och kärnvolym, kromosomantal och rDNA-loci bland andmat. Sci. Rep. 2019, 9, 3234. [CrossRef]

34. Knight, CA; Molinari, N.; Petrov, DA Hypotesen om stora genombegränsningar: Evolution, ekologi och fenotyp. Ann. Bot. 2005, 95, 177–190. [CrossRef]

35. Pellicer, J.; Hidalgo, O.; Dodsworth, S.; Leitch, IJ Genomstorleksmångfald och dess inverkan på utvecklingen av landväxter. Gener 2018, 9, 88. [CrossRef]

36. Carev, I.; Rušˇci´c, M.; Skoˇcibuši´c, M.; Maravic, A.; Siljak-Yakovlev, S.; Politico, O. Fytokemisk och cytogenetisk karaktärisering av Centaurea solstitialis (Asteraceae) från Kroatien. Chem. Biodiverser. 2017, 14, e1600213.[CrossRef]

37. Cole, IB; Cao, J.; Alan, RA; Saxena, PK; Murch, SJ Jämförelser av Scutellaria baicalensis, Scutellarialateriflora och Scutellaria racemosa: Genomstorlek, antioxidantpotential och fytokemi. Planta Med. 2008,74, 474–481. [CrossRef]

38. Carvalho, YGS; Vitorino, LC; de Souza, UJB; Bessa, LA Nya trender inom forskning om den genetiska mångfalden av växter: Implikationer för bevarande. Mångfald 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. Wei, S.; Yang, W.; Wang, X.; Hou, Y. Hög genetisk mångfald i en utrotningshotad medicinalväxt, Saussureainvolucrata (Saussurea, Asteraceae), i västra Tianshanbergen, Kina. Conserv. Genet. 2017, 18,1435–1447. [CrossRef]

40. Chang, YJ; Cao, YF; Zhang, JM; Tian, ​​LM; Dong, XG; Zhang, Y.; Qi, D.; Zhang, XS Studie om kloroplastDNA-diversitet av odlade och vilda päron (Pyrus L.) i norra Kina. Träd Genet. Genomes 2017, 13, 44.[CrossRef]

41. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Variation av arbutinhalten i olika vilda populationer av Arctostaphylos uva-ursi i Katalonien, Spanien. J. Örter Kryddor Med. Plants 2002, 9, 329–333. [CrossRef]

42. Sonnenschein, M.; Tegtmeier, M. Experiment på domesticering av björnbär (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). J. Med. Kryddväxter 2012, 17, 124–128.

43. Chen, HY; Lin, YC; Hsieh, CL Utvärdering av antioxidantaktivitet av vattenhaltigt extrakt av vissa utvalda näringsväxter. Food Chem. 2008, 104, 1418–1424. [CrossRef]

44. Del Valle, JC; Buide, ML; Casimiro-Soriguer, I.; Whittall, JB; Narbona, E. Om flavonoidackumulering i olika växtdelar: Variationsmönster bland individer och populationer i strandcampionen (Silene littorea). Främre. Plant Sci. 2015, 6, 939. [CrossRef]

45. Martínez-Cadenas, C.; López, S.; Ribas, G.; Flores, C.; García, O.; Sevilla, A.; Smith-Zubiaga, I.; Ibarrola-Villaba, M.; Pino-Yanes, MM; Gardeazabal, J.; et al. Samtidigt renande selektion på den förfäders MC1R-allel och positiv selektion på melanomriskallelen v60l i sydeuropéer.Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 2654–2665. [CrossRef]

46. ​​Jakaaola, L.; Hohtola, A. Effekt av latitud på flavonoidbiosyntes i växter. Växtcellsmiljö. 2010, 33,1239–1247. [CrossRef]47. Martz, F.; Peltola, R.; Fontana, S.; Duval, RE; Julkunen-Tiitto, R.; Stark, S. Effekt av latitud och höjd på den terpenoida och lösliga fenoliska sammansättningen av enbär (Juniperus communis) nålar och utvärdering av deras antibakteriella aktivitet i den boreala zonen. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 9575–9584. [CrossRef]

48. Yang, B.; Zheng, J.; Laaksonen, O.; Tahvonen, R.; Kallio, H. Effekter av latitud och väderförhållanden på fenolföreningar i vinbärssorter (Ribes spp.). J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3517–3532. [CrossRef][PubMed]

49. Lätti, AK; Jaakola, L.; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Antocyanin och flavonolvariation i myrbilsbär (Vaccinium uliginosum L.) i Finland. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 427–433. [CrossRef] [PubMed]

50. Lätti, AK; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Analys av antocyaninvariation i vilda populationer av blåbär (Vaccinium myrtillus L.) i Finland. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 190–196. [CrossRef]

51. Monschein, M.; Iglesias, J.; Kunert, O.; Bucar, F. Fytokemi hos ljung (Calluna vulgaris (L.) Hull) och dess altitudinella förändring. Phytochem. Upps. 2010, 9, 205–215. [CrossRef]

52. Perry, NB; Burgess, EJ; Rodríguez Guitián, MA; Romero Franco, R.; López Mosquera, E.; Smallfield, BM; Joyce, NI; Littlejohn, RP Sesquiterpene laktones in Arnica montana: Helenalin and dihydrohelenalinchemotypes in Spain. Planta Med. 2009, 75, 660–666. [CrossRef] [PubMed]

53. Abdala-Roberts, L.; Assmann, S.; Berny-Mier, Y.; Terán, JC; Covelo, F.; Glauser, G.; Moreira, X. Biotiska och abiotiska faktorer förknippade med höjdvariation i växtegenskaper och växtätande hos en dominerande ekart.Am. J. Bot. 2016, 103, 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. Bentley, J.; Moore, JP; Farrant, JM Metabolomics som komplement till fylogenetiken för att bedöma intraspecifika gränser i den uttorkningstoleranta medicinbusken Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae). Phytochemistry 2019, 159, 127–136. [CrossRef] [PubMed]

55. Siljak-Yakovlev, S.; Pustahija, F.; Šoli´c, EM; Boguni´c, F.; Muratovic, E.; Basic, N.; Catrice, O.; Brown, CSTowards en databas med genomstorlek och kromosomantal av Balkanfloran: C-värden i 343 taxa med nya värden för 252. Adv. Sci. Lett. 2010, 3, 190–213. [CrossRef]

56. Garrido, JL; Alcántara, JM; Rey, PJ; Medrano, M.; Guitian, J.; Castellanos, MC; Bastida, JM; Jaime, R.; Herrera, CM Geografisk genetisk struktur av iberiska aklejor (gen. Aquilegia). Plant Syst. Evol. 2017,303, 1145–1160. [Korsref

57. Listl, D.; Poschlod, P.; Reisch, C. Phylogeography of a tough rock survivor in European dry grasslands.PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

58. Olalde, M.; Herrán, A.; Espinel, S.; Goicoechea, P. Vita ekar phylogeography in the Iberian Peninsula.Ecol. Manag. 2002, 156, 89–102. [CrossRef]

59. Barrett, SCH Influenser av klonalitet på växternas sexuella reproduktion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112 8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. Skowyra, M.; Falguera, V.; Gallego, G.; Peiro, S.; Almajano, MP Effekten av Perilla frutescens-extrakt på den oxidativa stabiliteten hos modellmatemulsioner. Antioxidanter 2014, 3, 38–54. [CrossRef] [PubMed]

61. Pascoal, A.; Quirantes-Piné, R.; Fernando, AL; Alexopoulou, E.; Segura-Carretero, A. Fenolisk sammansättning och antioxidantaktivitet hos kenafblad. Ind. Crop. Driva. 2015, 78, 116–123. [CrossRef]

62. Pellicer, J.; Garnatje, T.; Molero, J.; Pustahija, F.; Siljak-Yakovlev, S.; Vallès, J. Ursprung och utveckling av sydamerikanska Artemisia-arter (Asteraceae); bevis från molekylär fylogeni, ribosomalt DNA och genomstorleksdata. Aust. J. Bot. 2010, 58, 605–616. [CrossRef]

63. Doležel, J. Flödescytometrisk analys av nukleärt DNA-innehåll i högre växter. Phytochem. Anal. 1991, 2,143–154. [CrossRef]

64. Doyle, JJ; Doyle, JL En snabb DNA-isoleringsprocedur för små mängder färsk bladvävnad. Phytochem. Bull.Bot. Soc. Am. 1987, 19, 11–15.

65. Vitales, D.; Feliner, GN; Vallès, J.; Garnatje, T.; Firat, M.; Álvarez, I. En ny omskrivning av medelhavssläktet Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae) baserad på plastid- och nukleära DNA-markörer. Phytotaxa 2018, 349, 1–17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: En användarvänlig redaktör och analysprogram för biologisk sekvensjustering för Windows95/98/NT. Nukleinsyror Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

67. Thompson, JD; Higgins, GD; Gibson, TJ CLUSTAL W: Förbättring av känsligheten för progressiv multisekvensanpassning genom sekvensviktning, positionsspecifika gapstraff och val av viktmatris. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 4673-4680. [CrossRef]

68. Rozas, J.; Ferrer-Mata, A.; Sánchez-DelBarrio, JC; Guirao-Rico, S.; Librado, P.; Ramos-Onsins, SE; Sánchez-Gracia, A. DnaSP 6: DNA-sekvenspolymorfismanalys av stora datamängder. Mol. Biol. Evol.2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, Version 1.2; Institutionen för biovetenskaper, Aarhus Universitet: Aarhus, Danmark, 2009; Tillgänglig online: http://www.aubot.dk/FastGap_home.htm (tillgänglig den 1 juli 2019).

70. Clement, M.; Posada, DCKA; Crandall, KA TCS: Ett datorprogram för att uppskatta genealogier av gener.Mol. Ecol. 2000, 9, 1657–1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Leigh, JW; Bryant, D. Popart: Fullständig programvara för haplotypnätverkskonstruktion. Metoder Ecol. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. Komma igång med R-befälhavaren: Ett grafiskt användargränssnitt för grundläggande statistik till RJ Stat. Softw.2005, 14, 1–42. [CrossRef]

73. Oksanen, J.; Blanchet, FG; Kindt, R.; Legendre, P.; O'Hara, RB; Simpson, GL; Solymos, P.; Stevens, M.; Wagner, H. Vegan: Community Ecology Package. R-paketversion 1.17-4. 2010. Tillgänglig online: http://CRAN.R-project.org/package=vegan (tillgänglig den 19 september 2010).74. Malinowska, H. Utvalda björnbär (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) från naturliga populationer i Polen. Acta Soc. Bot. Pol. 1995, 64, 91–96. [CrossRef]