Citralinnehållande eteriska oljor som potentiella tyrosinashämmare: en biostyrd fraktioneringsmetod

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt:

Överdriven melaninproduktion orsakar allvarliga dermatologiska tillstånd såväl som mindre estetiska problem (dvs. fräknar och solar lentigo). Nedregleringen av tyrosinas är en utbredd metod för behandling av sådana störningar, och växtextrakt har ofta visat sig vara värdefulla källor förtyrosinasinhibitorer. Citral (en blandning av neral och geranial) är en viktig doftingrediens som har visat antityrosinas potential. Den är starkt koncentrerad i de eteriska oljorna (EO) från Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. och Verbenaofficinalis L. Dock har endast L. cubeba EO undersökts för använda som ett potentiellt hudblekmedel. Detta arbete utvärderar in vitrotyrosinashämmande aktivitet av dessa EOs och studier, med användning av bioanalysorienterad fraktionering, huruvida deras olika kemiska sammansättning påverkar de övergripande EO-hämmande aktiviteterna via möjliga synergistiska, additiva och/eller kompetitiva interaktioner mellan EOs komponenter. Den hämmande aktiviteten av C. schoenanthus EO och den hos M. officinalis EO, med försumbara (plus)-citronellal mängder, var i linje med deras citralhalt. Å andra sidan inhiberade L. cubebaand V. officinalis EOstyrosinasi betydligt större utsträckning då de innehöll -myrcen, vilket bidrog till den övergripande EO-verksamheten. Liknande observationer gjordes för M. officinalis EO, som har hög (plus)-citronellalhalt som ökade citralaktivitet.

Nyckelord:tyrosinashämning; eteriska oljor; citral

cistanche har en blekande funktion

Introduktion

Tyrosinasär nyckelenzymet i biosyntesen av melaninpigment i flera bakterier, svampar, växter, djur och människor. Hos människor katalyserar tyrosinas de hastighetsbegränsande stegen i melaninbiosyntesvägen. Denna biosyntes kännetecknas av flera enzymatiska och kemiska reaktioner som leder till melaninbildning från aminosyran L-tyrosin, där tyrosinas katalyserar dess hydroxylering till o-dopakinon via mykofenolat- och difenolaktiviteter. Även om det finns andra enzymer involverade i melanogenes, kan endast de tyrosinaskatalyserade reaktionerna inte inträffa spontant, medan de återstående stegen kan fortgå utan enzymaktivitet vid fysiologiskt pH [1]. Av denna anledning är nedreglering av tyrosinas ett mycket utbrett tillvägagångssätt för att reducera överskott av melanin produktion, och användningen av tyrosinashämmare som hudblekande medel har visat betydande klinisk och kosmetisk framträdande roll [2].

På EU-marknaden ärtyrosinashämmare som används som hudblekande medel kan grupperas i två huvudkategorier: de som är förbjudna enligt EU:s kosmetikaförordning 1223/2009 (dvs. hydrokinon och monobensyleterhydrokinon) på grund av deras allvarliga biverkningar, men som fortfarande används för att behandla hyperpigmentering under medicinsk övervakning och tyrosinashämmare som är tillåtna för användning i kosmetikaprodukter (dvs. arbutin, aloesin, kojinsyra) [2,3]. Denna andra grupp kännetecknas dock fortfarande av potentiellt signifikanta biverkningar; Kliniska studier på kojinsyra har verkligen visat på fall av erytem, ​​stickande känslor och kontakteksem efter applicering. På samma sätt har Europeiska vetenskapliga kommittén för konsumentsäkerhet uttryckt oro angående användningen av arbutinas, en kosmetisk ingrediens [2], på grund av den potentiella hydrolysen av dess glykosidbindning som frisätter hydrokinon. Det finns därför ett behov av nya molekylmallar och/eller blandningar av bioaktiva föreningar för att behandla hyperpigmentering.

Växter har varit värdefulla källor till hudblekande medel, och tre av fem av de mest använda medlen, både medicinskt och kosmetiskt, är växtspecialiserade metaboliter (dvs. hydrokinon, -arbutin, aloesin). Hittills har fenolföreningar huvudsakligen undersökts som potentiellatyrosinasinhibitorer, och dessa inkluderar flavonoider (t.ex. quercetin [4]), stilbener (t.ex. resveratrol [1]), fenylpropanoider (t.ex. kanelaldehyd [5] och eugenol [6]) och fenolsyror (t.ex. anissyra och bensoesyra [7]). Intresset för forterpenoider har varit betydligt lägre och de har relativt sett undersökts som antityrosinasmedel.

Citral är bland det begränsade antalet terpenoidderivat med antityrosinasegenskaper som har studerats. Det är en blandning av två isomerer, cis- och trans-3,7-dimetyl-2,6-oktadienal (dvs. neral och geranial), som har visat sig blockera svampens enzymatiska aktivitet in vitrotyrosinas[8]. Förutom dess betydelse som en luktande ingrediens i drycker, livsmedel och kosmetika, har citral visat lovande biologiska aktiviteter in vitro, inklusive antisvamp-, antibakteriella, antioxidant- och antiinflammatoriska effekter [9–11]. Dessutom har nyare studier betonade att citral har potentiell terapeutisk betydelse som en glattmuskelavslappnande och lokalbedövningsmedel, eftersom det främjar avslappning i luftrör, livmoder och aorta glatta muskler och hämmar nervexcitabilitet i djurmodeller [12-15].

Citral erhålls från eteriska oljor (EO) från flera botaniska arter, inklusive Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. och Verbena officinalis L. Till författarnas bästa kunskap, endast L. cubeba EO har undersökts för sintyrosinashämmande aktivitet [16]. Därför syftar denna studie till att utvärdera de tyrosinashämmande aktiviteterna av C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis och V. officinalis EOs, med hjälp av en kolorimetrisk analys in vitro, för att bedöma om de olika kemiska sammansättningarna påverkar den övergripande EO-hämmande aktiviteten via någon möjliga synergistiska, additiva och/eller kompetitiva interaktioner mellan deras komponenter. Denna studie använder en abioassay-vägledd fraktioneringsmetod för att heltäckande utvärdera de EO-beståndsdelar och deras enantiomerer, när de är kirala, som bidrar till den EO-hämmande aktiviteten mot en svampkälla för tyrosinas, vilket är ett bra modellsystem för preliminär screening avtyrosinashämmare [17].

2. Resultat och diskussion

2.1. Kemisk sammansättning och citralhalt i den undersökta eteriska oljan

I vårt försök att heltäckande karakterisera alla potentiella EO-komponenter som bidrar till den övervägda biologiska aktiviteten, analyserades de undersökta EO:erna av GC, med både FID- och MS-detektion. De normaliserade relativa procentsatserna (beräknade från de absoluta områdena normaliserade till den interna standarden C13 med användning av responsfaktorer [18,19]) av alla detekterade föreningarna bestämdes och användes för att jämföra EO-kompositioner. Figur 1 rapporterar GC-MS-profilen för de undersökta EOs analyserade med en konventionell kolumn. Tabell 1 listar, för varje undersökt EO, de föreningar som visade en normaliserad procentuell mängd över 0.1, medan de fullständiga EO-kemiska sammansättningarna rapporteras i tilläggsmaterialen (tabellerna S1–S5).

Alla de undersökta EO är rika på neral (cis{{0}},7-dimetyl-2,6-oktadienal) och geranial (trans-3,{ {5}}dimetyl-2,6-oktadienal), som är de vanligaste föreningarna. Förhållandet mellan pelargon och pelargon var mycket lika i alla undersökta EO och motsvarade 0.74 ± 0,05. C. schoenanthus och L. cubeba EO uppvisar det högsta neral- och geranialinnehållet, vilket står för i genomsnitt 60 procent av hela deras EO-kompositioner, och som är 1.5-gånger större än i V. officinalis EO och i de tre M. officinalis EOs (dvs prov 1, 2 och 3). De ytterligare syresatta föreningarna som är gemensamma för alla EO är 6-metyl-5-hepten-1-on, linalool och citronellal. Den senare är betydligt mer rikligt förekommande i M. officinalis EO 1 än i de andra undersökta EO, inklusive M. officinalis EO2 och 3.

Mängden av kolvätefraktionen varierar avsevärt i de olika EOs.M. officinalis EO 1 innehåller endast trans- -karyofyllen och -humulen som seskviterpenkolväten, vilka står för 2,7 procent respektive 0,13 procent av den totala EO. C. schoenanthus EO uppvisar en något rikare kolvätefraktion än M. officinalis EO 1 (dvs. 7.0 procent ), som innehåller båda monoterpenerna (dvs. kamfen, cis{{1{{20 }}}}ocimen, limonen, -pinen, trans- -ocimene, -thujene) och seskviterpener (dvs. trans- -karyofyllen, -kadinen, δ-kadinen, germacren D, -elemen) i måttlig belopp. I L. cubeba och V. officinalis EO står kolvätefraktionen för 20 procent av den totala EO och limonen är den vanligaste föreningen (dvs. 15,0 respektive 10,9 procent), följt av -pinen, pinen , sabinen, trans- -karyofyllen, -myrcen, kamfen och -kopen. Slutligen kännetecknas M. officinalis EO 2 och 3 av den högsta kolvätefraktionshalten (38,8 procent respektive 31,8 procent av den totala EO). I båda proverna innehåller kolvätefraktionen huvudsakligen seskviterpener, nämligen trans- -karyofyllen (27,8 procent respektive 20,0 procent) och -humulen (3,0 procent och 2,6 procent), och en reducerad monoterpenfraktion som huvudsakligen kännetecknas av limonen ( 4,2 procent respektive 3,2 procent).

Tre prover av L. cubeba, V. officinalis och C. schoenanthus Eos producerade under olika år samt tre prover av M. officinalis EO från olika tillverkare undersöktes. GC-MS-analyser av C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis och V. officinalis avslöjade inga signifikanta kvalitativa och kvantitativa skillnader i den kemiska sammansättningen av de tre proverna från olika produktionsår. Detta kan tillskrivas optimala lagringsförhållanden, dvs i en bärnstensfärgad glasbehållare vid 4 ◦C i mörker med ett försumbart huvudutrymme. Å andra sidan visade GC-MS-analyser signifikanta skillnader i mängden citronellal och trans{{4 }}karyofyllen i de tre undersökta M. officinalis EOs. Citronella uppgick till 19,6 procent, 0,26 procent och 0,31 procent i M. officinalis EO 1, 2 respektive 3. Tvärtom, som tidigare beskrivits, är trans- -karyofyllen betydligt mer förekommande i M. officinalis EOs 2 och 3 än i M. officinalis EO 1. Dessa resultat överensstämmer med resultaten som rapporterats av Seidler-Lozykawska et al., som lyfte fram signifikanta skillnader i citral-, citronellal- och trans- -karyofyllenförekomster i EOs erhållna från 22 utvalda M. officinalis-genotyper som härstammar från europeiska botaniska trädgårdar [20].

En sann kvantifiering utfördes av den externa standardkalibreringen för att noggrant utvärdera mängden potentiella bioaktiva specialiserade föreningar (dvs. neral, geranial, limonen, -myrcen och citronellal. Tabell 2 och 3 rapporterar de diagnostiska joner (m/z) som används för SIM- MS-kvantifiering av markörföreningarna som undersöks tillsammans med kalibreringsintervallet, kalibreringskurvans ekvation, korrelationsvärden och regressionsstandardfel för varje analyt respektive kvantifieringsresultaten.

2.2. In vitro-hämmande aktivitet av de undersökta eteriska oljorna mot svamptyrosinas

Som tidigare beskrivits uppvisar EO:erna av C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba och V. officinalis höga nivåer av citral, vilket kännetecknas av icke-konkurrerande hämmande aktivitet mot en svampkälla av tyrosinas [8,16,21] . Denna studie syftade till att undersöka in vitrotyrosinashämmande aktiviteter av dessa EOs för att undersöka om deras hämmande aktivitet kan tillskrivas endast deras citralhalt, eller om det finns andra bioaktiva föreningar som påverkar de hämmande effekterna av EO:erna.

Svamptyrosinasantogs här på grund av dess höga homologi med humantyrosinas, dess relativt låga kostnad och lättillgänglighet, vilket gör det till ett bra modellsystem för preliminär screening av tyrosinashämmare [17]. Precisionen i in vitrotyrosinasinhiberingstestet utvärderades i termer av repeterbarhet (genom att utföra den enzymatiska inhiberingsanalysen fem gånger på samma dag) och mellanprecision (genom att upprepa den enzymatiska inhiberingsanalysen fem gånger var fjärde vecka under en period av sex månader). Tabell 4 rapporterar variationskoefficienten (CV) för inhiberingstester utförda med kojinsyra, som användes som en positiv kontroll, och med L. cubeba EO. Resultaten var tillfredsställande eftersom CV aldrig översteg 7 procent för repeterbarhet och 10 procent för medelprecision. Tabell 4 rapporterar variationskoefficienten för inhiberingstester utförda med kojinsyra, använd som positiv kontroll, och med L. cubeba EO. Liknande precisionsvärden erhölls för alla testade EO.

Citral koncentration-responskurva studerades genom att plotta den observerade hämmande aktiviteten som en funktion av dess koncentration i reaktionsblandningen. Alla EO testades med en koncentration av 166,7 µg/ml, vilket gav, oavsett EO, en resulterande citralkoncentration inom dess linjäritetsområde för koncentration-responskurvan (y=0.3956x plus 1.8094,R{{7} }.9951, regressionsfel: 2,08448, linjäritetsområde: 6,7–166,7 µg/mL) och genererade inga löslighetsproblem i reaktionsblandningen.

Låddiagrammet som rapporteras i figur 2 visar procentandelen avtyrosinashämning för varje EO. För EO:er av L. cubeba, V. officinalis och C. schoenanthus, motsvarar resultaten som rapporterats i figur 2 den svamptyrosinashämmande aktiviteten för EO:er av 2020, eftersom variansanalysen inte visade några statistiskt signifikanta skillnader mellan EO:er av olika produktionsår (p > 0,05). När det gäller L. cubeba och C. schoenanthus EOs, är dessa resultat i god överensstämmelse med resultaten från de kvantitativa GCMS-analyserna som avslöjade en nästan identisk mängd citral i EO:erna från olika produktionsår. Batch 2020 av V. officinalis EO innehåller en något högre citralmängd än satserna 2019 och 2018. Enligt citralkoncentration-responskurvan är dock citralöverskottet i batch 2020 inte tillräckligt för att fastställa en statistiskt signifikant högre procentandel av enzymatisk hämning med tanke på den slumpmässiga inhiberingen fel i samband med mätningarna. För ytterligare detaljer, se figur S1 i tilläggsmaterialet. Å andra sidan avslöjade variansanalysen (ANOVA) följt av Tukey–Kramer post-hoctest att de tre testade M. officinalis EO, tillhandahållna av distinkta tillverkare, hämmade svamptyrosinasi olika utsträckning, vilket kommer att beskrivas närmare i följande stycken. De största hämmande aktiviteterna observerades för EO av L.cubeba, M. officinalis 1 och V. officinalis, som hämmade 59 ± 6 procent, 55 ± 7 procent och 52 ± 6 procent avtyrosinasaktivitet, respektive när den testades vid en koncentration av 166,7 µg/ml. Statistiskt signifikanta (p < 0.05)="" lägre="" aktiviteter="" observerades="" för="" eo="" hos="" c.="" schoenanthus="" och="" m.="" officinalis="" 2="" och="" 3="" vars="" enzymhämmande="" aktivitet="" var="" 42="" ±="" 5="" procent,="" 40="" ±="" 5="" procent="" och="" 38="" ±="" 6="" procent="" respektive.="" tabell="" 5="" tillhandahåller="" inhibitorkoncentrationen="" som="" halverade="" enzymaktiviteten="" under="" de="" givna="" experimentella="" förhållandena="" (ic50)="" för="" varje="" undersökt="" inhibitor="" (dvs.="" eos,="" enstaka="" föreningar="" och="" kojinsyra).="" alla="" eos="" hämmade="" effektivt="" svamptyrosinas="" och="" visade="" en="" hämmande="" aktivitet="" som="" i="" genomsnitt="" var="" 100-="" gånger="" lägre="" än="" den="" för="" kojicacid,="" som="" användes="" som="" positiv="">

2.3. Identifiering av ytterligare bioaktiva komponenter, förutom citral, genom bioassay-guidad fraktionering Histogrammet som rapporteras i figur 3 jämför procentandelen experimentellt uppmätta enzymatiska hämningar med de värden som skulle förväntas om neral och geranial (betraktad som summa, dvs. citral) var endast aktiva föreningar i de undersökta EO. Dessa värden mättes via interpolation från citralkoncentration-responskurvan. Som kan noteras uppvisade C. schoenanthus, M. officinalis 2 och M. officinalis 3 hämmande aktiviteter som var i linje med deras citralinnehåll, medan L. cubeba, M. officinalis 1 och V. officinalis EO hämmade svamp tyrosinas i större utsträckning än förväntat. En biostyrd metod antogs för att identifiera de ytterligare föreningar som bidrar till citralaktivitet. De syresatta och kolvätefraktionerna av L. cubeba, M. officinalis 1 och V. officinalis EO isolerades genom flashkromatografi och testades individuellt för deras svamptyrosinashämmande aktiviteter. Fraktionerna fytohemiskt testade för deras svamptyrosinashämmande aktiviteter. Fraktionerna fytohemiska fraktioner testades vid samma koncentration som deras resulterande koncentration när de testades 166,7 µg/mL av respektive EO (se avsnittet Material och metoder i avsnitt 3.2). Tabell 6 rapporterar koncentrationen av neral, geranial, citronellal, limonen, och -myrcen i de syresatta och kolvätefraktionerna av de fraktionerade EO:erna.

När det gäller L. cubeba och V. officinalis EO, hämmade både de syresatta fraktionerna och kolvätefraktionerna svamptyrosinas, om än i olika utsträckning. Aktiviteterna för de syresatta fraktionerna (53 ± 3 procent respektive 44 ± 5) står för det mesta av EOsanti-tyrosinaspotential och var i linje med respektive citralinnehåll, vilket tyder på att föreningarna som bidrar till citralaktivitet tillhör kolvätefraktionerna. Kolvätefraktionerna av L. cubeba och V. officinalis EO har ganska likartade kemiska sammansättningar. Limonen (68,4 respektive 50,3 procent), trans- -karyofyllen (12,0 respektive 7,8 procent), -pinen (1,7 respektive 7,5 procent), -pinen (2,5 respektive 12,9 procent), sabinen (2,7 respektive 3,8) och -myrcen (2,0 respektive 2,4 procent) är de vanligaste föreningarna i båda fraktionerna och finns i ganska liknande mängder, förutom -pinen och -pinen, som råder i V. officinalis EO-kolvätefraktionen.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 procent i båda EO, limonen (97 och 94 procent i L. cubeba respektive V. officinalis EO) och sabinen (87 procent i båda EO), medan olika enantiomera överskott observerades för -pinen ((-)- enantiomer: 38 procent i L. cubebaEO och 73 procent i V. officinalis EO) och -pinen ((-)-enantiomer: 67 procent i L. cubeba EO och 88 procent i V. officinalis EO). I båda EO står (-)-limonen för mer än 50 procent av hela fraktionen. Men även om tidigare studier har rapporterat en hämmande aktivitet mot svamptyrosinas på grund av dess höga förekomst [22,23], visade (-)-limonen här ingen tyrosinashämmande aktivitet. Liknande resultat erhölls för (plus)-limonen, den racemiska blandningen och föreningarna (-)-trans- -karyofyllen, (±)- -pinen och (±)- -pinen . Sabinene testades inte eftersom det redan hade visat sig ha försumbar svamptyrosinashämmande effekter [8]. I överensstämmelse med tidigare fynd [8] minskade myrcen svamptyrosinasaktivitet. När den testades vid den koncentration som observerades i 166,7 µg/ml av L. cubeba och V. officinalis EO, överbryggade -myrcenaktivitet gapet mellan EO:s förväntade hämmande effekter om citral var den enda aktiva föreningen och de experimentella resultaten. I motsats till observationerna av Matsuura et al. [8], -myrcene visade sig vara en mer potent svamptyrosinashämmare än citral, eftersom dess IC50 var nästan tio gånger lägre (13,3 µg/mL mot 121,8 µg/mL). Denna skillnad kan tillskrivas de olika substrat som används; Matsuura et al. undersökte endast svamptyrosinasdifenolasaktivitet, eftersom de använde L-DOPA som substrat, medan L-tyrosin användes i denna studie. De nuvarande fynden tyder på att -myrcen kan vara mer effektivt för att hämma svamptyrosinasmonofenolasaktivitet än difenolas.

M. officinalis EO 1 uppvisar en liten kolvätefraktion som står för mindre än 3 procent av det totala och har ingen tyrosinashämmande aktivitet. Den syresatta fraktionen av M. officinalisEO 1 hämmade emellertid svamptyrosinas i större utsträckning än vad som skulle förväntas från dess citralhalt (Figur 3). Denna fraktion innehåller betydande mängder citronellal förutom neral och geranial och den kirala analysen visade en högenantiomer renhet av citronellal till förmån för (plus) enantiomeren (98,3 procent). När den testades oberoende, vid en koncentration av 166,7 µg/ml, hämmade (plus )-citronellal svamptyrosinas i en försumbar utsträckning, även om dess aktivitet förbättrades signifikant när den testades i kombination med citral. Dessa resultat kan förklara skillnaderna som observerats i procentandelen svamptyrosinashämning i de olika M. officinalis EOs. M. officinalis EO 2 och 3 har mycket låga citronellalhalter, vilket kan vara anledningen till att deras hämmande aktiviteter är betydligt lägre än M. officinalis EO 1.

3. Material och metoder

3.1. Reagens

Dimetylsulfoxid (DMSO), svamptyrosinas från Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tyrosin, kojinsyra, citral, citronellal, -myrcen, (plus )-limonen, (-)-limonen, (±)-limonen, ( ±)- och pinen köptes från Merck Life Science Srl (Milano, Italien). Litsea cubeba, Verbena officinalis och Cymbopogon schoenanthus EOs levererades av Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italien). Tre partier av olika år (dvs 2020, 2019, 2018) testades för varje. Tre prover av Melissa officinalis EOs undersöktes; ett tillhandahölls av Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), ett av ErboristeriaMagentina Srl, medan det sista köptes från en lokal butik och var från SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Italien). I texten hänvisar författarna till de olika EO av Melissaofficinalis som M. officinalis EOs 1, 2 respektive 3. De tillhandahållna EO erhölls enligt de förfaranden som beskrivs i den europeiska farmakopén [24]. Melissa officinalis och Verbena officinalis EO framställdes genom hydrodestillation från bladen respektive plantans delar; på liknande sätt erhölls Litsea cubeba och Cymbopogon schoenanthus EO genom ångdestillation av färsk frukt respektive färska luftdelar. Varje EO analyserades individuellt av GC-MS så snart den köptes/tillhandahölls av motsvarande tillverkare, varje lagringsår och strax före studien av dess svamptyrosinashämmande aktivitet.

3.2. In vitro tyrosinashämmande analys

Detyrosinashämmande aktiviteter för EO och isolerade föreningar undersöktes in vitro med användning av en kolorimetrisk avläsningsbaserad enzymanalys optimerad av Zengh et al. [25], med små modifieringar. De tyrosinashämmande aktiviteterna hos EOs, såväl som deras respektive kolväte och syresatta fraktioner och rena föreningar undersöktes i glaskroppen en kolorimetrisk avläsningsbaserad enzymanalys som optimerades av Zengh et al. [25]med små modifieringar: analysen utfördes vid rumstemperatur ochtyrosinasinhibering mättes med hänsyn till kontroll och provabsorbans efter 6 minuters inkubation, snarare än efter 20 minuter, för att fungera under den linjära delen av enzymreaktionen, vilket ger mer exakta hämningsresultat [26,27]. Svamptyrosinas från Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach valdes ut för denna studie. L-tyrosin användes som substrat, vilket innebär att den totala tyrosinashämmande aktiviteten undersöktes utan att skilja mellan tyrosinasmonofenolas- och difenolasaktivitet. Fotometriska mätningar vid 475 nm utfördes på en Thermo spectronic Genesys6 och den positiva kontrollinhibitorn användes som. Lösningarna av de undersökta potentiella inhibitorerna (EOs, EO-isolerade fraktioner, EO-individuella föreningar och kojicacid) framställdes i DMSO. Tabell 7 rapporterar de testade koncentrationerna för varje undersökt potentiell inhibitor. Svampentyrosinaslösning 200 U/mL (27,9 µg/ml) bereddes i natriumfosfatbuffert (pH 6,8) och alikvoter på 9 ml lagrades vid -18 ◦C och tinades strax före experimenten. Tyrosinlösning 0,1 mg/ml bereddes i natriumfosfatbuffert (pH 6,8) och förnyades dagligen. Reaktionsblandningens komponenter placerades i flaskan i följande ordning: 1 ml svamptyrosinaslösning 200 U/ml; 1 ml natriumfosfatbuffertlösning; 10 µL EO/enkelförening/kojinsyralösning; och slutligen 1 ml tyrosinlösning 0,1 mg/ml. Den slutliga DMSO-procenten i reaktionsblandningen var 0,3 procent. Analysen utfördes i en förseglad 4 ml flaska för att undvika förlust av eventuella EO-komponenter till den omgivande miljön och för att minimera deras frisättning till huvudutrymmet ovanför reaktionsblandningen. Reaktionsblandningen inkuberades i ett termostatiskt vattenbad vid 25 ◦C under 6 min. Därefter registrerades absorbansen vid 475 nm, eftersom denna våglängd tillåter identifiering av dopakrom. Absorbansen motsvarande 100 procent av tyrosinasaktiviteten mättes genom att ersätta EOs/enskilda föreningen/kojinsyralösningen med 10 µL ren DMSO. Blanklösningar framställdes enligt följande: 2 mL natriumfosfatbuffertlösning, 10 µL EO/enskild förening /kojinsyra/DMSO-lösning och 1 ml tyrosinlösning 0,1 mg/ml. Procentandelen tyrosinasinhibering mättes enligt ekvationen nedan: procent hämning=∆A (Kontroll) − ∆A (Sample) / ∆A (Kontroll) × 100,∆A (Kontroll) eller (Sample) {{ 33}} A475 (kontroll) eller (prov) − A475 (kontroll tom) eller (prov tom).

3.3. Flash-kolonnkromatografi

EO-fraktionering utfördes på ett flashkolonnkromatografisystem PuriFlash450 av Sepachrom (Rho, Milano, Italien), utrustad med både UV- och ELSD-detektorer. Mängden fraktionerad EO: 900,0 mg. Stationär fas: sfäriska silikagelpartiklar, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) var från Sepachrom; mobil fas:petroleter (A) och etylacetat (B); flödeshastighet 25 ml/min. Linjär gradienteluering antogs från 100 procent av A till 80 procent av A och 20 procent av B under 20 minuter.

3.4. Analysvillkor

EOs-lösningarna och de av deras respektive fraktioner framställdes i cyklohexan med en koncentration av 5,0 mg/ml och analyserades med GC-MS. Citral, citronellal, -myrcen och limonen kvantifierades i varje EO och motsvarande isolerade fraktioner med användning av den externa standardkalibreringsmetoden. Lämpliga kalibreringsnivåer framställdes incyklohexan och analyserades med GC-MS. Tridekan (C13) 1.0 mg/ml användes som intern standard för att normalisera analytsignalerna. Tabell 2 sammanfattar det övervägda koncentrationsintervallet för varje kvantifierad förening.

GC-MS-analyser utfördes med en Gerstel MPS-2 multifunktionsprovtagare (Mülheim an der Ruhr, Tyskland) installerad på en Agilent 6890 N GC kopplad till en 5975 MSD och utrustad med en ChemStation Version E. 02.02.1431 databehandlingssystem (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA). GC-förhållanden: injektortemperatur: 250 ◦C; injektionsläge: split; förhållande: 1/20; bärargas: helium; konstant flödeshastighet: 1 ml/min; kolonner: Mega5 (95 procent polydimetylsiloxan, 5 procent fenyl) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, längd 25 m, från MEGA (Legnano, Italien). Temperaturprogram: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C(5 min). MSD-förhållanden: MS drivs i EI-läge (70 eV); skanningsområde: 35 till 350 amu; uppehållstid 40 ms; jonkällans temperatur: 230 ◦C; fyrpolstemperatur: 150 ◦C; överföringsledningstemperatur: 280 ◦C. EO-markörer identifierades genom att jämföra både deras linjehållningsindex (IT), beräknade mot en C9-C25-kolväteblandning, och deras masspektra antingen mot de för autentiska prover eller från kommersiellt tillgängliga massspektrala bibliotek (Adams, 2007). EO kirala analyser utfördes genom att använda samma analysbetingelser på en 2,3-di-O-metyl-6-Ot-butyldimetylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, längd 25 m från MEGA. Temperaturprogram: 40 ◦C(1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

GC-FID-analyser utfördes på samma instrument. GC-förhållanden: injektortemperatur: 250 ◦C; injektionsläge: split; förhållande: 1/20; bärargas: väte; flödeshastighet: 1 ml/min. Temperaturprogram: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

4. Sammanfattningar

Syftet med denna undersökning var (1) att på ett omfattande sätt undersöka in vitro-svampentyrosinashämmande aktiviteter av Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis och Verbena officinalis EOs och (2) för att avgöra om deras biologiska aktivitet endast tillskrivs deras citralinnehåll eller om det finns ytterligare bioaktiva monoterpener som bidrar till den undersökta biologiska aktiviteten genom att använda en bioassay-ledd fraktioneringsmetod. Denna studie har identifierat att i L. cubeba och V. officinalis EOs, bidrar -myrcen till de EOs hämmande aktiviteterna trots dess ringa mängd och det har visat sig ha större hämmande kraft mot citral. Det andra stora fyndet var att (plus)-citronellalförstärkt citralsvamptyrosinashämmande kraft, potentiellt viasynergistisk interaktion eftersom den inte visade någon aktivitet på egen hand. Det sistnämnda fyndet förklarade varför i M. officinalis EOs som bär försumbara (plus)-citronellal mängder, de hämmande aktiviteterna var i linje med deras citralhalt medan motsatsen gällde för M. officinalis EO med relativt hög (plus)-citronellal förekomst. även om ytterligare studier fortfarande krävs för att exakt definiera den typ av interaktioner som sker mellan -myrcen och citral och mellan citronellal och citral, och för att bedöma de hämmande aktiviteterna av dessa EO:er och enskilda föreningar på människortyrosinas, kan resultaten av denna studie hjälpa till att rationellt utforma blandningar av EO eller berikade EO som förbättrar deras biologiska effektivitet och ökar deras potential som adjuvans vid behandling av hyperpigmentering.

Referenser

1. Pillaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Skin whitening agents: Medicinal chemistry perspective of tyrosinas inhibitors.J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Översikt över hudblekningsmedel med en inblick i den illegala kosmetiska marknaden i Europa. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Karakterisering av misstänkt illegal hudblekningskosmetika. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flavonoler från saffransblomma: Tyrosinashämmande aktivitet och inhiberingsmekanism. J. Agric. Food Chem.1999, 47, 4121-4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Kemisk sammansättning och tyrosinashämmande aktivitet av Cinnamomum cassia eterisk olja. Bot. Hingst. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Verkan av tyrosinas på orto-substituerade fenoler: Möjlig påverkan på brunfärgning och melanogenes. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tyrosinashämmare från kummin. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5338–5341. [CrossRef]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Tyrosinashämmande aktivitet av eteriska oljor av citrus. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2309–2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. In vitro bioaktiviteter av eteriska oljor som används för aknekontroll. Int. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Biologiska egenskaper hos citral och dess potentiella skyddande effekter mot cytotoxicitet orsakad av aspirin i IEC-6-cellerna. Biomed. Pharmacother. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; Nej, YH; Yuk, DY; Hong, JT Hämmande effekt av citral på NO-produktion genom undertryckande av iNOS-uttryck och NF-KB-aktivering i RAW264.7-celler. Båge. Pharm. Res. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA;Barbosa, R. Effekten av Lippia alba (Mill.) NE Brun eterisk olja och dess huvudbeståndsdelar, citral och limonen, på den luftrörsmjuka muskeln hos råttor. Biotechnol. Rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Tokolytisk aktivitet av Lippia alba eterisk olja och dess huvudbeståndsdelar, citral andlimonene, på den isolerade livmodern hos råttor. Chem. Biol. Påverka varandra. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Vasorelaxerande effekt av Lippia alba eterisk olja och dess huvudbeståndsdel, citral, på kontraktiliteten hos isolerad råttaorta. Biomed. Pharmacother. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Eterisk olja från Lippia alba och dess huvudbeståndsdel citral blockerar excitabiliteten hos ischiasnerver hos råtta. Braz. J. Med. Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Potentiell kosmetisk applicering av eterisk olja extraherad från Litsea cubeba-frukter från Kina. J. Essent. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA En omfattande genomgång av tyrosinashämmare. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Kvantitativ analys av eteriska oljor: En komplex uppgift. Smak Fragr. J. 2008, 23, 382-391. [CrossRef]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Eteriska oljor och flyktiga ämnen: Provberedning och analys. En recension.Flavour Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Utvärderingen av variationen av morfologiska och kemiska egenskaper hos de utvalda genotyperna av citronmeliss (Melissa officinalis L.). Ind. Crops Prod. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]

21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tyrosinashämmande aktivitet hos olivoljesmakföreningarna. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, MP; Benvenuti, S.; Gallone, A. Kemisk sammansättning och den anti-melanogena potentialen hos olika eteriska oljor. Smak Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]

23. Hu, JJ; Li, X; Liu, XH; Zhang, WP Hämmande effekt av eterisk citronolja på svamptyrosinasaktivitet in vitro. Mod. FoodSci. Technol. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]

24. Europarådet. European Pharmacopoeia, 10:e upplagan; Europarådet: Strasburg, Frankrike, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Karakterisering av tyrosinashämmare i kvistarna av Cudrania tricuspidata och deras struktur-aktivitetsstudie. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, JE Enzymanalysdesign för screening med hög genomströmning. Vid screening med hög genomströmning. Metoder inom molekylärbiologi (metoder och protokoll); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Clifton, NJ, USA, 2009; Volym 565, s. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Grunderna i enzymatiska analyser för HTS. I Assay Guidance Manual; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; Eli Lilly & Company och NationalCenter for Advancing Translational Sciences: Bethesda, MD, USA, 2004