Fenyletanolglykosider från Herba Cistanche förbättrar den hypoxiska tumörens mikromiljö och förstärker effekterna av oxaliplatin via HIF-1-signalvägen

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG och JIANHUA YANG

Abstrakt.

Levercancer är en av de vanligaste typerna av maligna tumörer och kännetecknas av hög malignitet, snabb progression, hög sjuklighet och mortalitet. Oxaliplatin (OXA) har rapporterats ha markant effektivitet mot avancerad levercancer med tolerabel toxicitet. I solida tumörer främjar den hypoxiska mikromiljön epitelial-mesenkymal övergång (EMT), vilket också kan inducera läkemedelsresistens hos levercancer mot platinaläkemedel. HerbaCistanche (Cistanche tubulosa) har använts ofta i traditionell kinesisk medicin och fenyletanoidglykosiderna från HerbaCistanche(CPhG) är de viktigaste aktiva komponenterna. Den aktuella studien syftade till att undersöka effekterna av CPhGs på livskraft, apoptos, migration och invasion av levercancerceller. HepG2 levercancerceller delades in i kontrollgrupperna DMSO, CoCl2, OXA, OXA plus CoCl2 och CPhGs plus OXA plus CoCl2. Därefter utfördes omvänd transkriptions-kvantitativ PCR och western blot-analys för att bestämma expressionsnivåerna av hypoxiinducerbar faktor 1 (HIF-1), lysyloxidasliknande 2 (LOXL2) och EMT-relaterade gener och proteiner (dvs. E ‑cadherin och Twist), för att undersöka effekterna av CPhG på levercancer. Resultaten visade att CPhGs kunde förstärka effekterna av OXA på levercancer och hämma migrationen, invasionen och apoptoshastigheten av levercancerceller. Dessutom inducerade CPhGs-behandling effektivt nedreglering av HIF-1, LOXL2 och Twist, och uppreglering av E-cadherin. De nuvarande fynden indikerade att CPhG utlöste en signifikant ökning av känsligheten för OXA och undertryckande av hypoxiinducerad EMT i levern

cistanche fördel: anti-Lever cancer

Introduktion

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 levercancerrelaterade dödsfall till 2030, och av de nyligen bekräftade fallen kommer de på Kinas fastland att stå för 46,6 procent.

Oxaliplatin (OXA) har rapporterats utöva hämmande effekter på tillväxten av levercancer med tolerabel toxicitet i kliniska sammanhang. Icke desto mindre hämmas den totala effektiviteten av platinabaserad läkemedelsbehandling av tumörcellsresistens (4). Det är väl erkänt att levercancer uppvisar lägre känslighet för kemoterapi jämfört med andra typer av cancer. Levercancers multidrogresistens har bidragit till dess resistens mot ett flertal terapeutiska medel (5). I en tidigare studie rapporterade Xie och Zhong (6) att HepG2-celler uppvisade dålig känslighet för adriamycin, 5-fluorouracil och cisplatin under hypoxiska förhållanden. Trots att platinabaserade kemoterapimedel är de viktigaste behandlingsalternativen för cancer finns det resistens mot dessa läkemedel bland patienter. Dessutom är prognosen för patienter med levercancer fortfarande dålig (7,8). Hittills har omfattande ansträngningar gjorts för att undersöka läkemedelsresistens och förbättra läkemedelskänsligheten hos patienter med levercancer.

Under hypoxiska förhållanden inträffar revaskularisering i cancerceller, vilket kan leda till epitelial-mesenkymal övergång (EMT) och vaskulär mimik (VM). EMT och VM kan därefter främja invasion och fjärrmetastaser. Dessutom har EMT spekulerats i att tjäna en roll som drivkraften för cancerprogression (9). Dessutom är hypoxiinducerbara faktorer (HIF) involverade i nykärlbildning, energimetabolism, cellulär proliferation, invasion och metastaser (10).

Lysyloxidas (LOX)-liknande 2 (LOXL2) protein är en medlem av LOX-familjen och är nära besläktat med den kovalenta tvärbindningen av kollagen och elastin, vilket kan resultera i fibros och är avgörande för integriteten av den extracellulära matrisen ( 11). I en tidigare studie ansågs LOXL2 vara nära besläktad med metastasering av cancerceller (12). Dessutom har LOXL2 visats modulera patogenesen och progressionen av många typer av malign cancer genom extra- och intracellulära vägar, vilket var viktiga index för utvärderingen av dålig prognos (13,14).Herba Cistancheär en stärkande ört som är vanligen spridd i ökenregioner och som ofta har använts i traditionell kinesisk medicin (15,16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa)är en naturlig örtmedicin som vanligtvis planteras i den autonoma regionen Xinjiang. Fenyletanoidglykosiderna från Herba Cistanche (CPhGs) fungerar som en av de viktigaste aktiva komponenterna i Herba Cistanche. Tidigare indikerade Hu et al (17) att CPhGs kunde dämpa leverskada hos H22-tumörbärande möss och hämma tillväxten av cancerceller. Det föreslogs att den underliggande mekanismen kan vara relaterad till en minskning av serum-fetoprotein och kan förbättra immuniteten hos mössen.

I den aktuella studien inducerades en hypoxisk modell av HepG2 levercancerceller med hjälp av CoCl2. På grundval av detta syftade den aktuella studien till att undersöka effekterna av OXA på proliferation, apoptos, migration och invasion av cancerceller i närvaro av CPhGs under hypoxiska förhållanden. Dessutom upptäcktes mRNA- och proteinexpressionsnivåerna för HIF-1, LOXL2, E-cadherin och Twist. Dessutom undersöktes de exakta mekanismerna bakom effekterna av CPhG på patogenesen av levercancer.

fördelen med cistanche-extrakt: behandling av levercancer

Material och metoder

Cellinje. Levercancercellinjen HepG2, som identifierats med STR-metoden, tillhandahölls av Clinical Research Institution, First Affiliated Hospital vid Xinjiang Medical University (Urumqi, Kina). Cellerna odlades i DMEM med hög glukoshalt (HyClone; Cytiva) innehållande 10 procent fetalt bovint serum (FBS; Hyclone; Cytiva) vid 37˚C i en inkubator innehållande 5 procent CO2.

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 procent, varav halten echinakosid och verbascose var 44,5 respektive 16,1 procent. Stammar av C. tubulosa (Schrenk) Wight samlades in i oktober 2016 från Xinjiang, Kina. Anläggningen identifierades av Dr Junping Hu. Alla dessa kupongexemplar (nr 201610) har deponerats på Plant Herbarium, School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Xinjiang, Kina.

Experimentell design. HepG2-celler (5x104/ml) behandlades med olika koncentrationer av CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 och 500 µg/ml) i 48 timmar vid 37˚C (24 timmar efter sådd) till screening av CPhGs-L/M/H-dos. HepG2-celler (5x104/ml) delades in i följande grupper: i) Kontrollgrupp, odlad i DMEM med hög glukoshalt; ii) DMSO-grupp, odlad i 0,1 % DMSO (volym/volym); iii) CoCl2-grupp (hypoximodellgrupp), odlad i serumfritt DMEM innehållande 100 µM CoCl2; iv) OXA

grupp (positiv kontrollgrupp), odlad i 5 µM OXA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) OXA plus CoCl2-grupp, odlad i 5 µM OXA kombinerad med 100 µM CoCl2; och vi) CPhGs-grupper, behandlade med CPhGs-L/M/H (25, 50 respektive 100 µg/ml) kombinerat med 5 µM OXA och 100 µM CoCl2.

Cellviabilitetsanalys. Cellviabiliteten bestämdes med hjälp av en Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-analys enligt tillverkarens instruktioner (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) och som tidigare beskrivits (18). Celler (2.0x103 celler/brunn) såddes i plattor med 96 brunnar. Därefter, ~24 timmar efter sådd, behandlades celler i 48 timmar enligt behandlingsförhållandena i varje grupp. Mediet ersattes sedan med 100 µl DMEM med hög glukoshalt, följt av tillsats av 10 µl CCK-8-reagens; cellerna inkuberades under 1 timme vid 37°C. Optisk densitet mättes med hjälp av en mikroplattläsare (Thermo Fisher Scientific, Inc.) vid 450 nm. Sex replikat framställdes för varje tillstånd.

Bestämning av apoptotisk hastighet. Den apoptotiska hastigheten bestämdes med användning av ett Annexin V/PI Apoptotic Detection Kit (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). HepG2-celler (5x105) inokulerades i 6-brunnars plattor vid 37˚C i 5 procent CO2. Därefter, ~24 timmar efter behandling, odlades cellerna i serumfritt DMEM i 4 timmar. Cellerna smältes sedan med användning av 0,25 procent trypsiniserad (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), följt av minst tre tvättar med förkyld PBS. Efter centrifugering vid 167,7 xg i 5 minuter vid 4˚C återsuspenderades cellerna med 1X bindningsbuffert och koncentrationen justerades till 1~5x106/ml och färgades sedan med 5 µl Annexin V-FITC och 5 µl PI under 15 minuter vid rumstemperatur. Cellerna genomgick sedan flödescytometri med en BD LSRFortessa flödescytometer (BD Biosciences) och FlowJo

10.6.2 programvara (Tree Star, Inc.).

Sårläkningsanalys. De hämmande effekterna av CPhG på cellmigration undersöktes med en sårläkningsanalys (19). Cellerna såddes i 6-brunnars plattor tills ett 100 procent sammanflytande monolager erhölls. Därefter sårades cellerna med en 200 µl pipettspets, tvättades med PBS och inkuberades med behandlingar i ett serumfritt medium. Efter läkemedelsbehandling mättes sårläkningshastigheten till 0, 12, 24 respektive 48 timmar. Sårbilder togs med ett fluorescerande mikroskop (Nikon Ti‑S, Japan) under en förstoring på x10. Sårtillslutningen mättes med såravståndet i varje period och uttrycktes som procent av det initiala såravståndet vid 0 timmar.

Transwell-analyser. Cellinvasion bedömdes med Transwell-analyser. Celler (1x105 celler/ml) suspenderades i 200 µl DMEM med hög glukoshalt utan FBS. Cellerna såddes sedan på Matrigel-belagda övre brunnar täckta med ett polyetentereftalatfiltermembran (porstorlek, 8,0 µm). Totalt 500 µl DMEM med hög glukoshalt innehållande 10 procent FBS placerades i den nedre kammaren. Bomullsservetter användes för att ta bort cellerna på den övre ytan av filtret efter 48 timmar vid 37˚C. Cellerna som invaderade genom membranet fixerades med 4 procent paraformaldehyd under 30 min. Därefter färgades cellerna med 0,1 procent kristallviolett under 15 minuter vid rumstemperatur. Invaderande celler observerades under ett fluorescerande mikroskop (Nikon Ti‑S) med en förstoring av x100.

Kvantitativ PCR för omvänd transkription (RT-qPCR). Totalt RNA extraherades från HepG2-celler med användning av TRIzol®-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) och cDNA-syntes utfördes med användning av PrimeScript RT-reagenskit (Takara Bio, Inc.) enligt tillverkarens protokoll. qPCR utfördes på ett 7500 Real-Time PCR-system (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) med användning av TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) enligt tillverkarens protokoll. Primers som används för qPCR är listade i tabell I. PCR-förhållanden bestod av denaturering vid 95°C i 30 sekunder, följt av 40 cykler av denaturering vid 95°C i 5 sekunder och hybridisering vid 60°C i 30 sekunder. Slutligen analyserades amplifieringsresultaten med 2‑ΔΔCq-metoden (20).

Western blot-analys. Proteiner extraherades från celler behandlade under 48 timmar genom homogenisering i RIPA-lysbuffert (Thermo Fisher Scientific, Inc.) innehållande proteas- och fosfatasinhibitorer. Cellproteininnehåll bestämdes med användning av BCA-metoden. Proteiner (40 µg) separerades sedan med SDS-PAGE på en 10 procent gel och överfördes till ett PVDF-membran. Membranet blockerades i 5 procent fettfri mjölk under 1 timme vid 4˚C och inkuberades med följande primära antikroppar: ‑aktin (1:5,000; kat.nr. bs-0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; cat. no. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; cat. no. ab179810; Abcam), E-cadherin (1:1,000 ; kat.nr bs‑10009R; BIOSS) och Twist1 (1:500; kat.nr bs-2441R; BIOSS) över natten vid 4˚C. Membranet inkuberades sedan med get-anti-kanin IgG H&L sekundära antikroppar (1:2 000; kat.nr ab205718; Abcam) i 4 timmar vid rumstemperatur. Efter tvätt med TBS‑0,05 procent Tween‑20, visualiserades blottarna med hjälp av Enhanced Chemiluminescence-systemet (Amersham; Cytiva). Den relativa intensiteten för banden semikvantifierades genom densitometrisk analys med hjälp av ImageJ2x-programvaran (version 2.1.4.7; Rawak Software Inc.), och densitometriska kurvor av resultaten normaliserades till intensiteten av ‑aktin.

Statistisk analys. SPSS 19.0 programvara (SPSS, Inc.) användes för dataanalys. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse och analyserades med envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test. P<0.05 was="">anses indikera en statistiskt signifikant skillnad. Alla experiment utfördes åtminstone i tre exemplar.

Resultat

Effekter av CPhGs på cellviabilitet. HepG2-celler behandlades med olika koncentrationer av CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 och 500 µg/ml) under 48 timmar (24 timmar efter sådd). Som visas i Fig. 1, var det en signifikant minskning av livsdugligheten hos celler behandlade med 200 och 500 µg/ml CPhG jämfört med kontrollgruppen (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhG förstärker effekterna av OXA på levercancer. Effekterna av CPhGs på OXA-modulerad HepG2-cellviabilitet utvärderades därefter (Fig. 2). Efter ~48 timmar minskade kombinationen av CPhGs och OXA signifikant livsdugligheten för HepG2-celler jämfört med den i OXA plusCoCl2-grupp. Specifikt hämmade CPhGs-M plus OXA plus CoCl2 och CPhGs-H plus OXA plus CoCl2 signifikant livsdugligheten för HepG2-celler jämfört med i OXA plus CoCl2-gruppen (P<0.05 and=""><0.01,>

CPhGs hämmar migration och invasion av levercancerceller. För att ytterligare studera den invasiva potentialen och migrationsförmågan hos levercancerceller efter behandling med CPhGs och OXA, utfördes sårläknings- och Transwell-analyser. Sårläkningsanalysen indikerade att, jämfört med den i DMSO-gruppen, migrationen av HepG2-celler minskade efter behandling med CoCl2, OXA och CPhGs (200 eller 500 µg/ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

Effekter av CPhGs och OXA på apoptos. Efter behandling med kombinationen av CPhGs och OXA för

48 timmar färgades HepG2-cellerna med Annexin V-FITC och PI, följt av flödescytometri för att bestämma cellulär apoptos. Som visas i Fig. 4A uppvisade sambehandlingsgrupperna (CPhGs-L/M/H plus OXA plus CoCl2) en gradvis ökning av andelen apoptotiska celler med ökningen av CPhGs-koncentrationen. De flesta av cellerna som behandlats med CPhGs och OXA var lokaliserade i Q4-regionen, vilket indikerade att kombinationen av CPhGs och OXA inducerade apoptos i ett tidigt skede. Jämfört med OXA plus CoCl2-gruppen detekterades en signifikant ökning av den apoptotiska frekvensen av celler i grupperna behandlade med OXA, CoCl2 och måttliga eller höga doser av CPhGs (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Fig. 5A-D). Omvänt inducerade CoCl2 en signifikant ökning av mRNA-expressionsnivåerna för LOXL2, HIF-1 och Twist jämfört med de i DMSOgrupp (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Proteinuttrycksnivåer av HIF-1, LOXL2, E-cadherin och Twist efter CPhGs och OXA-saminkubation. Resultaten av western blotting avslöjade att proteinuttrycksnivåerna för HIF-1, LOXL2 och Twist uppreglerades under hypoxiska förhållanden jämfört med de i DMSO-gruppen. Däremot

proteinuttrycksnivåerna av E-cadherin nedreglerades under hypoxiska förhållanden (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

Diskussion

Hypoxi är ett vanligt inslag i cancermikromiljön; detta är främst förknippat med det faktum att spridningen avcancerceller är snabbare jämfört med kärlbildningen av avvikande nykärl. Dessutom påverkas andra biologiska processer, inklusive proliferation, metastaser och läkemedelskänslighet av hypoxi (21). Tumörens hypoxiska mikromiljö är avgörande för patogenes och progression av cancer, och den är också viktig för läkemedelsresistens och vaskularisering av levercancer (22).

I den föreliggande studien behandlades HepG2-celler med olika koncentrationer av CPhGs, bland vilka CPhGs (200 µg/ml) signifikant kunde inducera en minskning av cellviabiliteten. Noterbart kan CPhGs modulera cellulär livskraft på ett dosberoende sätt. Under hypoxiska förhållanden hämmade kombinationen av OXA och CPhGs (50 eller 100 µg/ml) signifikant livsdugligheten för HepG2-celler jämfört med enbart OXA-behandling. En liknande dosberoende trend observerades i migrations- och invasionsanalyser av levercancerceller. För närvarande har omfattande studier genomförts för att undersöka rollerna för cancercellapoptos i patogenesen av leversjukdom (23-26). Flera strategier har utvecklats för att behandla levercancer genom att främja apoptos (27-29); därför störning i

HepG2-cellapoptos kan fungera som en lovande kandidat för förebyggande och behandling av levercancer. Apoptosen av HepG2-celler förbättrades signifikant efter behandling med kombinationen av CPhGs-M/-H och OXA jämfört med den i celler som behandlats med enbart OXA. Därför indikerades det att CPhGs avsevärt kunde förstärka antitumöreffekterna av OXA.

HIF-1 kan uppreglera expressionsnivåerna av E-cadherin, N-cadherin och Vimentin, såväl som vissa transkriptionsfaktorer, såsom Snail1/2, Zeb1 och Twist1. Därefter kan detta leda till en förlust av cellulär polaritet, lossning av cell-cellövergångar, förändringar i cytoskelettprotein och migration och invasion av cancerceller, vilket kan resultera i translokation av cancerceller till cirkulationssystemet genom basilarmembranet och efterföljande metastaser (30). I den aktuella studien användes CoCl2 för att inducera en modell av hypoxi, vilket utlöste en ökning av livskraften för HepG2-celler, såväl som cellmigration och invasion. Dessutom ökade mRNA- och proteinexpressionsnivåerna av HIF-1 signifikant, vilket tyder på att CoCl2 inducerade genereringen av en

hypoxisk mikromiljö. Behandling med kombinationen av CPhGs och OXA hämmade markant mRNA- och proteinexpressionsnivåerna av HIF-1 inducerade av hypoxi. Dessa fynd antydde att CPhGs kunde försvaga mikromiljön av levercancer på ett dosberoende sätt.

E-cadherin är en Ca2 plus-beroende adhesionsmolekyl, som har en nyckelroll i cell-celladhesion, upprätthållande av integriteten av vävnadsstruktur och signalöverföring. I fall av nedreglering eller till och med förlust av adhesionsfunktion kan cancerceller uppvisa okontrollerad proliferation och dedifferentiering, vilket kan främja ökad invasion av cancerceller och efterföljande metastaser (31). Dessutom är E-cadherin avgörande för att hämma EMT av cancerceller, vilket är nära associerat med differentiering, invasion, metastasering och prognos av flera epiteliala maligniteter. EMT-inducerande transkriptionsfaktorer (EMT-TFs), som Twist, Snail och Zeb, är avgörande för EMT. Hypoxi har rapporterats aktivera signalvägar som inducerar EMT-TF-uttryck; särskilt kan det direkt främja EMT via transkriptionell aktivering av dessa faktorer (32). Vridningen är en mycket konserverad helix-ring-helix

transkriptionsfaktor som nyligen har identifierats de senaste åren. High Twist-uttryck har detekterats i många typer av cancerceller (33). Därför är det viktigt att undersöka sambandet mellan Twist-uttryck och migration eller metastasering av cancerceller, såväl som klinisk förebyggande och behandling av metastaser (34). I den aktuella studien avslöjades det att mRNA- och proteinexpressionsnivåerna för E-cadherin nedreglerades i närvaro av hypoxi, medan mRNA- och proteinexpressionsnivåerna för Twist var förhöjda. Dessa fynd överensstämde med resultaten av invasions- och migrationsanalyser, vilket antydde att hypoxi kan bidra till förekomsten av EMT. Efter behandling med OXA nedreglerades proteinuttrycksnivåerna av E-cadherin; detta indikerade att OXA uppvisade dålig effektivitet i att hämma tillväxten av levercancerceller, medan det kunde främja EMT. I kombination med CPhGs uppvisade emellertid HepG2-cellers känslighet för OXA markant förbättring i närvaro av hypoxi. Dessutom kan sambehandling med CPhGs och OXA hämma cellulär viabilitet, migration och invasion av HepG2-celler. Den aktuella studien upptäckte endast

Twist och E-cadherin uttryck; därför syftar framtida studier på att fokusera på fler EMT-relaterade markörer, för att utvärdera den hämmande effekten av CPhG på hypoxiinducerad EMT vid levercancer.

HIF-1 har rapporterats främja uttrycket av LOXL2 och förstärka migrationen och invasionen av levercancerceller, vilket kan vara nära relaterat till den dåliga prognosen för levercancer (30). I en tidigare studie ökade uttrycksnivåerna av LOXL2 i intilliggande levercancervävnader markant jämfört med de i cancervävnaderna (35). Dessutom var det nära relaterat till invasionen och metastaseringen av levercancer. LOXL2-gentystnad av litet störande RNA hämmade spridningen av HepG2- och SMCC-7721-celler, vilket resulterade i cellcykelstopp av cancerceller och ökad apoptos (36). Shao et al (35) undersökte korrelationen mellan LOXL2 i levercancerprover, och klinikopatologiska faktorer, VM och prognos bland 201 fall som opererades för behandling. Det antogs att LOXL2 tjänade viktiga roller i patogenesen och progressionen av levercancer, vilket kan fungera som ett mål för läkemedelsutveckling. Dessutom visade Peng et al (37) att LOXL2 kunde aktivera signalvägarna Snail/E-cadherin och Src kinas/Focal adhesion kinas, vilket kan bidra till patogenesen och progressionen av EMT hos magcancerceller. I den föreliggande studien, under hypoxiska förhållanden, ökade mRNA- och proteinuttrycksnivåerna för LOXL2, medan dess uttryck nedreglerades efter behandling med OXA. Dessutom resulterade behandling med en kombination av CPhGs och OXA i uppenbar nedreglering av LOXL2-uttryck, vilket effektivt kan hjälpa OXA:s antitumöreffekter på levercancer.

Det finns vissa begränsningar för denna studie. Den aktuella studien borde ha använt ytterligare två levercancercellinjer, inklusive SMCC-7721-cellinjen, men dessa kunde inte användas eftersom det inte var möjligt att köpa dessa cellinjer eftersom de var felidentifierade och härrörde från HeLa-celler. Dessutom analyserade den aktuella studien inte antioxidanteffekterna av olika koncentrationer av CPhGs i cellerna.

Sammanfattningsvis kan CPhGs alternera den hypoxiska tumörmikromiljön i levercancerceller genom att modulera HIF-1-signalvägen. Dessutom var känsligheten hos levercancerceller för OXA signifikant förhöjd som svar på behandling med en kombination av CPhGs och OXA. Dessa fynd kan ge en ny behandlingsstrategi för att förbättra levercancers känslighet för kemoterapi.

Erkännanden

Inte tillämpbar.

Finansiering

Den aktuella studien stöddes av Xinjiang Key Laboratory of Natural Drug Active Components and Drug Release Technology (bidrag nr. XJDX1713), Reserve Candidate Project for Leader of Scientific and Technological Innovation i Xinjiang Uygur autonoma region (bidrag nr. 2019XS14), National Natural Science Foundation of China (anslag nr. 81860735) och Bethune Charitable

Stiftelsen "Bethune·Quest-konstruktion av farmaceutisk vetenskaplig forskningskapacitet" (anslag nr. B-19-H-20200622).

Tillgänglighet av data och material

Datauppsättningarna som används och/eller analyseras under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.

Författarnas bidrag

LMW och JWZ utförde experimenten, utarbetade manuskriptet och bekräftade äktheten av alla rådata. JPH och JHY utformade föreliggande studie. Alla författare läste och godkände det slutliga manuskriptet.

Etiskt godkännande och samtycke till att delta

Inte tillämpbar.

Patientmedgivande för publicering

Inte tillämpbar.

Konkurrerande intressen

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Referenser

1. Hepatocellulärt karcinom. Nat Rev Dis Primers 2: 16019, 2016.

2. Gingold JA, Zhu D, Lee DF, Kaseb A och Chen J: Genomisk profilering och metabolisk homeostas i primära levercancer. Trender Mol Med 24: 395-411, 2018.

3. McGuire S: World cancer report 2014. Genève, Schweiz: World Health Organization, the international Agency for research on cancer, WHO press, 2015. Adv Nutr 7: 418-419, 2016.

4. Gholamreza K, Jadidi-Niaragh F, Jahromi AS, Zandi K och Hojjat-Farsangi M: Mekanismer för tumörcellresistens mot de aktuella målterapimedlen. Tumör Biol 37: 10021-10039, 2016.

5. Dong X och Mumper RJ: Nanomedicinska strategier för att behandla multiresistenta tumörer: Aktuella framsteg. Nanomedicine (Lond) 5: 597-615, 2010.

6. Xie Y och Zhong DW: AEG-1 är associerad med hypoxi-inducerad hepatocellulärt karcinom kemoresistens via reglerande PI3K/AKT/HIF-1alfa/MDR-1-väg. EXCL J 15: 745-757, 2016.

7. Xiong H, Ni Z, He J, Jiang S, Li X, He J, Gong W, Zheng L, Chen S, Li B, et al: LncRNA HULC utlöser autofagi via stabiliserande Sirt1 och dämpar kemokänsligheten hos HCC-celler. Onkogen 36: 3528-3540, 2017.

8. Gade TPF, Tucker E, Nakazawa MS, Hunt SJ, Wong W, Krock B, Weber CN, Nadolski GJ, Clark TWI, Soulen MC, et al: Ischemi inducerar vila och autofagiberoende i hepatocellulärt karcinom. Radiology 283: 702-710, 2017.

9. Siegel RL, Miller KD och Jemal A: Cancerstatistik, 2017. CA Cancer J Clin 67: 7-30, 2017.

10. Dong LQ, Shen BQ och Ma Y: Forskningsutveckling av hypoximikromiljö i hepatocellulärt karcinom. Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254-1258, 2018 (på kinesiska).

11. Moon HJ, Finney J, Ronnebaum T och Mure M: Humant lysyloxidasliknande 2. Bioorg Chem 57: 231-241, 2014.

12. Ferreira S, Saraiva N, Rijo P och Fernandes AS: LOXL2-hämmare och bröstcancerprogression. Antioxidanter (Basel) 10: 312, 2021.

13. Philp CJ, Siebeke I, Clements D, Miller S, Habgood A, John AE, Navaratnam V, Hubbard RB, Jenkins G och Johnson SR: Extracellulär matrixtvärbindning förbättrar fibroblasttillväxt och skyddar mot matrisproteolys vid lungfibros. Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594-603, 2018.

14. Galván JA, Zlobec I, Wartenberg M, Lugli A, Gloor B, Perren A och Karamitopoulou E: Uttryck av E-cadherinrepressorer SNAIL, ZEB1 och ZEB2 av tumör- och stromaceller påverkar tumörknoppande fenotyp och antyder heterogenitet av stromal celler i pankreascancer. Br J Cancer 112: 1944-1950, 2015.

15. Gu C, Yang X och Huang L: Cistanches herba: A neuropharmacology review. Front Pharmacol 7: 289, 2016.

16. Fu Z, Fan X, Wang X och Gao X: Cistanches Herba: En översikt över dess kemi, farmakologi och farmakokinetiska egenskaper. J Ethnopharmacol 219: 233-247, 2018.

17. Hu Q, You SP, Liu T, Wang B, Liu X och Jiang Y: En undersökning om effekten av cistanche mot levercancer. Carcinog Teratog Mutagen 30: 194-199, 2018.

18. Mao J, Tian Y, Wang C, Jiang K, Li R, Yao Y, Zhang R, Sun D, ​​Liang R, Gao Z, et al: CBX2 reglerar proliferation och apoptos via fosforylering av YAP i hepatocellulärt karcinom. J Cancer 10: 2706-2719, 2019.

19. Qin Y, Liu HJ, Li M, Zhai DH, Tang YH, Yang L, Qiao KL, Yang JH, Zhong WL, Zhang Q, et al: Salidroside förbättrar den hypoxiska tumörens mikromiljö och reverserar läkemedelsresistensen hos platinaläkemedel via HIF-1 signalväg. EBioMedicine 38: 25-36, 2018.

20. Livak KJ och Schmittgen TD: Analys av relativa genuttrycksdata med hjälp av kvantitativ PCR i realtid och 2(-Delta Delta C(T))-metoden. Methods 25: 402-408, 2001.

21. Vaupel P: Tumörmikromiljöfysiologi och dess konsekvenser för strålningsonkologi. Semin Radiat Oncol 14: 198-206, 2004.

22. Chen C och Lou T: Hypoxi-inducerbara faktorer i hepatocellulärt karcinom. Oncotarget 8: 46691-46703, 2017.

23. Schwabe RF och Luedde T: Apoptos och nekroptos i levern: En fråga om liv och död. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15: 738-752, 2018.

24. Kanda T, Matsuoka S, Yamazaki M, Shibata T, Nirei K, Takahashi H, Kaneko T, Fujisawa M, Higuchi T, Nakamura H, et al: Apoptos och icke-alkoholiska fettleversjukdomar. World J Gastroenterol 24: 2661-2672, 2018.

25. Pittala S, Kremlin Y och Shoshan-Barmatz V: Inriktning på levercancer och associerade patologier hos möss med en mitokondriell VDAC1-baserad peptid. Neoplasia 20: 594-609, 2018.

26. Jing ZT, Liu W, Xue CR, Wu SX, Chen WN, Lin XJ och Lin X: AKT-aktivator SC79 skyddar hepatocyter från TNF-medierad apoptos och lindrar d-Gal/LPS-inducerad leverskada. Am J Physiol Gastrointest Lever Physiol 316: G387-G396, 2019.