Förkonditioneringsaktiverad AKT kontrollerar neuronal tolerans mot ischemi genom MDM2–p53 PathwayⅡ

3. Diskussion

Våra resultat avslöjar att IPC-medierad aktivering av PI3K/AKT-signalvägen utlöser neuronal IT genom att kontrollera MDM2-p53-komplexet i primära kortikala neuroner. Vi bekräftade först effektiviteten av förkonditioneringen när det gäller neuroskydd [33,39-41] med hjälp av en validerad IPC-experimentmodell.

Klicka för att cistanche tubulosa biverkningar för Neuron

Vi fann att experimentell IPC inducerad av en kort (20 min) syre- och glukosbrist (OGD) följt av 2 timmars återsyresättning resulterade i neuroskydd, vilket framgår av förhindrandet av både neuronal apoptos och kaspas-3-aktivering inducerad av förlängd OGD (90 min) följt av 4 timmars återsyresättning (OGD/R). Vi visar att IPC minskar kaspas-3-aktivering i kortikala neuroner, vilket korrelerar med mindre apoptos efter en efterföljande och allvarligare ischemisk förolämpning.

Balansen mellan pro- och antiapoptotiska signaler är grundläggande för att säkerställa neuronal överlevnad efter ischemi [3,33,38,42–44]. Även om relevansen av sådana händelser har visats i både hemorragiska och ischemiska in vivo-strokemodeller [43,45], är mekanismerna som reglerar dessa signalvägar ännu inte helt klarlagda i samband med ischemisk tolerans. Rollen av antiapoptotisk AKT och dess relaterade vägar har studerats omfattande i cancerceller [46,47] och hjärnvävnad [38,48]; Men än så länge är rollen för AKT/MDM2-p53-signalvägen i IPC-medierad neuronal tolerans mot ischemisk skada fortfarande svårfångad.

Här fann vi att aktiveringen av PI3K/AKT-signalvägen orsakad av IPC främjar fosforylering av MDM2 vid Ser166, vilket utlöser dess nukleära translokation och proteinstabilisering, vilket förhindrar p53-inducerad apoptos via caspas-3-aktivering efter ischemi. Aktiveringen av AKT via fosforylering främjar neuronal överlevnad [24,49] och kan bidra till induktion av IT [25,50]. Våra resultat visar att den relativa mängden AKT-protein är oförändrad under ischemiska eller förkonditionerande stimuli. Intressant nog fann vi att tidig PI3K-medierad fosforylering av AKT vid Ser473 förhindrar ischemi-inducerad p53-stabilisering i de förkonditionerade neuronerna.

Effekten berodde inte på modifieringar i p53-mRNA-nivåer [33,34,44] utan på minskade p53-proteinnivåer på grund av IPC före OGD/R. Eftersom MDM2 är huvudregulatorn för p53-stabilisering och också är ett direkt mål för AKT, pekar våra resultat på rollen för AKT/MDM2-p53-signalvägen i neuronal tolerans mot ischemi. MDM2 mRNA ökar snabbt efter OGD [34], men MDM2 aktivitet kontrolleras huvudsakligen av post-translationella modifieringar, särskilt fosforylering [51]. I god överensstämmelse med detta fann vi att en gång aktiverad av fosforylering efter IPC, AKT, i sin tur, fosforylerar MDM2 vid rest Ser166, som ligger nära den nukleära lokaliseringssignalen [52], och denna effekt bibehålls efter OGD/R-skada.

Våra resultat visar att fosforylering av MDM2 vid Ser166 är tillräcklig för att utöva den IPC-medierade neuroprotektiva effekten via p53-destabilisering. Således identifierade vi här en tidsberoende aktivering av AKT / MDM2-p53-vägen efter ischemisk skada och faktiskt visar vi att IPC-aktiverad AKT utlöste nukleär translokation av ektopisk MDM2, såväl som endogen proteinstabilisering.

Dessutom förblir AKT aktiv i kärnan, där PI3K också kan migrera som svar på oxidativ stress och sedan svara för AKT-fosforylering [53]. Hämningen av PI3K-medierad fosforylering av AKT eller AKT knockdown främjar retentionen av MDM2-protein i cytoplasman, och det förhindrar Ser166-fosforylering av MDM2, såväl som IPC-medierat neuroskydd mot ischemi-inducerad neuronal apoptos. Tvärtom visade vi att aktiv AKT binder till nukleärt MDM2-protein.

Som en konsekvens främjar aktiv AKT både fosforylering av MDM2 och dess nukleära stabilisering, vilket bidrar till IPC-medierat neuroskydd. Våra resultat avslöjar att IPC-främjat neuroskydd var beroende av PI3K-medierad AKT-aktivering, som fosforylerade MDM2 vid Ser166, vilket främjade MDM2-kärnackumulering efter en ischemisk förolämpning.

Följaktligen avskaffade hämning av PI3K/AKT av wortmannin eller AKT-utarmning av siRNA IPC-främjat neuroskydd, vilket ledde till p53-stabilisering och den efterföljande neuronala apoptosen efter ischemi. Därför hjälper våra resultat till att klargöra den väsentliga rollen för IPC-beroende aktivering av AKT-MDM2-vägen i neuronal överlevnad mot ischemisk skada.

P53-proteinet är involverat i kontrollen av neuronal död/överlevnad bestämmande prognos hos strokepatienter [34,42,54], såväl som hos TIA-patienter [3]. P53-stabilisering äventyrar förkonditioneringsmedierat neuroskydd mot ischemi/reperfusionsskada [33]. MDM2-p53-interaktionen kommer därför att vara avgörande för neuronal överlevnad i detta sammanhang [34] och för IPC-medierad tolerans mot ischemisk skada [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G i MDM2-promotorn bestämmer uttrycket av MDM2 och i sin tur modulerar återhämtningen av patienter som lider av stroke [34].

Dessutom observerade vi att en Tp53-gen SNP (rs1042522) modulerar mitokondriell p53-stabilisering och neuronal tolerans mot ischemi samtidigt som den förutsäger den funktionella återhämtningen av patienter som lider av en TIA före stroke [3]. Därför kommer kontrollen av p53 apoptotiska vägar att vara avgörande för att säkerställa den neuroprotektiva effekten av IPC.

Dessa resultat ger ett translationellt tillvägagångssätt för studien som skulle kunna implementeras i framtiden till förmån för patienterna, och de utgör PI3K/AKT-MDM2-p53 signalväg som ett viktigt mål för de förkonditioneringsfrämjade IT-strategierna vid ischemisk stroke. Sammanfattningsvis visar vi att den IPC-förstärkta PI3K/AKT-signalvägen främjar fosforylering av MDM2 vid Ser166, vilket leder till MDM2-kärntranslokation och dess stabilisering, vilket utlöser neuronal IT genom att främja p53-destabilisering och efterföljande inaktivering av apoptotisk död inducerad efter ischemi.

Våra resultat belyser de potentiella fördelarna med tidig aktivering av AKT i IPC-medierad neuronal tolerans, som reglerar MDM2-p53 apoptotiska vägen under ischemisk skada. Dessa fynd lyfter fram en möjlighet att förstå mekanismerna som reglerar neuronala signalvägen AKT-MDM2-p53 för att utveckla nya neuroprotektiva strategier för IT-relaterade störningar.

4. Material och metoder

4.1. Primära kulturer av kortikala neuroner

Neuronala kulturer bereddes från C57Bl/6J eller p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) musembryon (14.5E) cortices. Neuroner såddes vid 1,8 × 105 celler/cm2 i ett neurobasalt medium kompletterat med 2 procent B27 och 2 mM glutamin (Invitrogen, Madrid, Spanien) och inkuberades vid 37 ◦C i en luftfuktad 5 procent CO2-innehållande atmosfär [ 55].

4.2. Modeller för syrebrist och förkonditionering av glukos

Efter 9–1{{10}} dagar in vitro (DIV) exponerades neuroner för syre- och glukosbrist (OGD) genom att inkubera celler vid 37 ◦C under 90 min i en inkubator utrustad med luftsluss och kontinuerligt gasad med 95 procent N2/5 procent CO2. Inkubationsmediet (buffrad Hanks lösning utan glukos: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHCO3, 0,33 mM Na2HP04, 2 mM CaCl2 och 20 mM N HEP4, och 20 mM Ns HEP4, pH 9 % tidigare. /5 procent CO2 i 30 min. Under dessa förhållanden var syrekoncentrationerna i inkubationsmediet 6,7 ± 0,5 µM mätt med en syreelektrod av Clark-typ [56,57].

När indikerat exponerades neuronerna för ischemisk förkonditionering (IPC; kort OGD i 20 minuter följt av 2 timmars reoxygenering) före efterföljande förlängd ischemi (OGD, 90 min) och 4 timmars reoxygenering (IPC plus OGD/R) (Figur S1B) ). Parallellt inkuberades neuroner i normoxia (Nx) vid 37 ◦C i en fuktad atmosfär av 95 procent luft/5 procent CO2 eller ischemisk förkonditionering (IPC). När indikerat, inkuberades neuroner 30 minuter före IPC i buffrad Hanks lösning (pH 7,4), i frånvaro eller närvaro av wortmannin (100 nmol/L), som beskrivits tidigare [19].

4.3. Celltransfektioner

Neuroner (8 DIV) eller HEK-293T-celler transfekterades med en plasmidvektor som uttrycker YFP-märkt Mdm2 från MDM2 human promotor. MDM2p/Mdm2-YFP var en gåva från Uri Alon & Galit Lahav (Addgene plasmid # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. Vid behov användes en tom vektor (pYFP) som kontroll under samma förhållanden. Plasmidtransfektion utfördes med användning av Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA), enligt tillverkarens instruktioner. Celler transfekterades med 1,5 µg/µL av plasmidvektorerna och användes efter 24 timmar.

AKT knockdown i 6 DIV-neuroner uppnåddes genom transfektion med små störande dubbelsträngade ribonukleotider (siRNA). Riktade sekvenser var enligt följande: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisens: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (mus, s62216, motsvarande nukleotiderna 1006–1025, GenBank accessionsnummer NM{5{9}}. Som en negativ kontroll använde vi Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Alla siRNA köptes från Ambion®, Invitrogen® och Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Tyskland). Enligt graden av proteinnedbrytning uppskattades effektiviteten av transfektion av siRNA till 70–80 procent 3 dagar efter transfektion. För tystnadsexperiment transfekterades neuroner med siRNA (10 nM) med Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), enligt tillverkarens instruktioner. Neuroner inkuberades ytterligare i ett neurobasalt medium i 72 timmar före användning.

4.4. Flödescytometrisk detektion av apoptotisk celldöd

Neuroner togs försiktigt loss från plattorna med användning av 1 mM EDTA-tetranatriumsalt i PBS (pH 7,4) och färgades med annexin V/APC och 7-AAD, utfört exakt som tidigare beskrivits [55].

4.5. Caspase-3 aktivitetsanalys

Kaspas-3-aktivitet utvärderades i cellysat [33] och enligt tillverkarens instruktioner med användning av Fluorimetric Assay-kitet CASP3F från SIGMA och avläst vid emission vid en våglängd på 405 nm. Metoden är baserad på frisättningen av den fluorescerande 7-amino4-metylkumarindelen (AMC). AMC-koncentrationen beräknas med hjälp av en AMC-standard.

4.6. Immunoblots och co-immunoprecipitationsanalys

Neuroner lyserades i buffert innehållande 1 procent SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4 och 1 procent Triton X-100 (NP40: 1 procent NP40, EDTA diK plus 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM och 10 procent glycerol) kompletterat med fosfatasinhibitorer (1 mM Na3VO4 och 50 mM NaF) och proteashämmare (100 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 50 µg/ml anti-papain/50 µg/50 µg 50 µg pepain, µg/ml amastatin, 50 µg/ml leupeptin, 50 µg/ml bestatin och 50 µg/ml sojaböntrypsinhämmare), lagras på is i 30 minuter och kokas i 5 minuter. Alikvoter av lyserade extrakt utsattes för SDS-polyakrylamidgel (MiniProtean®, Bio-Rad) och blottades med antikroppar över natten vid 4 ◦C. Antikroppar som användes var anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-klyvd kaspas-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; detekterar även YFP) (Abcam, Cambridge, Storbritannien), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland) och antiGAPDH (Ambion, Cambridge, Storbritannien) över natten vid 4 ◦C. Efter inkubation med pepparrotsperoxidaskonjugerad get-anti-kanin-IgG (Pierce, Thermo Scientific) eller get-anti-mus-IgG (Bio-Rad), inkuberades membranen omedelbart med förstärkt kemiluminescens SuperSignal West Dura (Pierce) i 5 minuter före exponering för Kodak XAR-5-film i 1 till 5 minuter och autoradiogrammen skannades. Bandintensiteter kvantifierades med hjälp av ImageJ 1.48v programvara, som beskrivits tidigare [60].

För samimmunoutfällningsanalysen lyserades neuroner i iskall buffert innehållande 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 procent NP-40) ​​kompletterat med fosfatasinhibitorer som beskrivs ovan. Efter att ha rensat skräp genom centrifugering, inkuberades neuronala lysat (100 mg) med 1 mg av antikroppen i 24 timmar vid 4 ◦C följt av tillsats av 10 ml protein A-agaros (GE Healthcare Life Sciences) i 2 timmar vid 4 ◦C. Immunfällningar tvättades noggrant med lysbuffert och löstes upp med SDS-PAGE och immunoblottedes med indikerade antikroppar [61]. De relativa proteinförekomsterna visas i figur S1. Fullständiga blottar och gelskanningar ingår i figur S3.

4.7. Immuncytokemi och bildanalys

Neuroner odlades på täckglas och fixerades med 4 procent (vikt/volym, i PBS) paraformaldehyd i 30 minuter och immunfärgades med kanin anti-fosfoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), mus anti-MDM2 (2A10, ab-16895), mus anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], mus anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA) och anti-GFP (1:1000; ab290; även validerad för att detektera YFP). Immunmärkning detekterades med hjälp av sekundära antikroppar anti-kanin IgG-Cy3 eller anti-mus IgG-Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, Storbritannien).

Kärnor färgades med 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Täckglas tvättades, monterades i SlowFade lätt antiblekningsreagens (Invitrogen) på glasskivor och undersöktes med ett mikroskop (Nikon Inverted microscope Eclipse Ti-E, (NY, USA) utrustat med 40× objektiv, en förcentrerad fiberbelysning Nikon Intensilight C-HGFI, och en svart-vit laddningskopplad digitalkamera Hamamatsu ORCAER eller ett skanningslaserkonfokalmikroskop ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokyo, Japan) med tre lasrar 405, 491 och 561 nm, utrustad med 40×, 63× och 100× PL Apo oljedoppningsobjektiv för högupplöst bildbehandling och digitalkamera Evolve Photometrics.

Alla mikroskopinställningar ställdes in för att samla fluorescerande bilder under mättnad och hölls konstanta för alla bilder tagna i experimentet. Bilder analyserades med programvaran ImageJ 1.48v (National Institutes of Health). Andelen p(Ser473)AKT plus och p53 plus neuroner och kvantifieringen av maximal proteinfluorescensintensitet för p(Ser473)AKT och p53 visas i figur S2A. I MDM2-GFP-transfekterade neuroner beräknades den nukleocytoplasmatiska fördelningen av MDM2-GFP som förhållandet mellan den nukleära medelfluorescensen och den cytoplasmatiska medelfluorescensen av endogen MDM2, mätt i 24 neuroner (sex neuroner per tillstånd i fyra olika neuronala kulturer) (Figur S2B) [62].

För att kvantifiera den maximala nukleära fluorescensintensiteten för endogen MDM2-färgning och pSer473AKT, mättes 40 neuroner (10 neuroner per tillstånd i fyra olika kulturer) (Figur S2C), som beskrivits tidigare [44]. I de representativa tvärsnittsintensitetsprofilerna som visas i figur 5B kvantifierades procentandelen p(Ser473)AKT och MDM2 som anges under varje villkor som nukleär medelfluorescens. I alla fall identifierades kärnor genom DAPI-färgning. Den maximala nukleära MDM2-fluorescensintensiteten i neuroner behandlade med wortmannin eller siAkt visas i figur S2D.

4.8. Statistisk analys

Experimentella resultat utvärderades genom envägsvariansanalys, följt av Bonferroni post hoc-test, som användes för att jämföra värden mellan flera grupper. Resultaten uttrycks som medelvärden ± SEM. Students t-test användes för jämförelser mellan två grupper av värden. I alla fall ansågs p < 0.05 vara signifikant (* p < 0,05 mot Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Hur skyddar Cistanche neuroner?

Det finns vissa bevis som tyder på att Cistanche kan skydda neuroner genom att minska apoptos (programmerad celldöd) och främja neuronal överlevnad. Apoptos är en naturlig process som sker i kroppen för att ta bort skadade eller oönskade celler, men det kan vara skadligt när det sker överdrivet eller olämpligt. Cistanche har visat sig hämma apoptos i laboratoriestudier, och denna effekt kan hjälpa till att skydda nervceller från skador.

Dessutom innehåller Cistanche flera bioaktiva föreningar som har visat sig ha neuroprotektiva effekter. Till exempel innehåller den echinakosid, som har visat sig skydda nervceller från oxidativ stress och inflammation. Den innehåller också akteosid, som har visat sig ha antiinflammatoriska och antioxiderande egenskaper.

Referenser

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; et al. Effekt av behandlingsfördröjning, ålder och strokesvårighet på effekterna av intravenös trombolys med alteplas för akut ischemisk stroke: En metaanalys av individuella patientdata från randomiserade studier. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Tidigare övergående ischemiska attacker kan ha en neuroprotektiv effekt hos patienter med ischemisk stroke. Båge. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodriguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EC; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; et al. Den neuronala ischemiska toleransen betingas av Tp53 Arg72Pro-polymorfismen. Transl. Stroke Res. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Stroke research at a crossroad: Asking the brain for directions. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; et al. Peroxisomproliferatoraktiverad receptorgamma deltar i förvärvet av ischemisk tolerans i hjärnan inducerad av ischemisk förkonditionering via glial glutamattransportör 1 in vivo och in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodriguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Refocusing the Brain: New Approaches in Neuroprotection against Ischemic Injury. Neurochem. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Tobar, E.; Shaw, ET; et al. Effekt av ischemisk förkonditionering på genomiskt svar på cerebral ischemi: likhet med neuroprotektiva strategier i viloläge och hypoxitoleranta tillstånd. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Cerebral förkonditionering och ischemisk tolerans. Nat. Rev. Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Leak, R.; Gan, Y.; Li, P.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. Förkonditionering ger neuroskydd i modeller av CNS-sjukdom: paradigmer och klinisk betydelse. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM Biomarkörer för ischemisk förkonditionering: Hitta svararna. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Modulation of Cerebral Store-operated Calcium Entry-Regulatory Factor (SARAF) och perifer Orai1 efter fokal cerebral ischemi och förkonditionering hos möss. Neurovetenskap 2020, 441, 8–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Nya cellulära mekanismer för neuroskydd vid ischemisk förkonditionering: En vy från insidan av organeller. Främre. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Förkonditioneringsinducerad ischemisk tolerans: Ett fönster till endogen utrustning för cerebroskydd. Exp. Transl. Stroke Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Apoptotiska mekanismer efter cerebral ischemi. Stroke 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide-3-Kinase/Akts överlevnadssignalvägar är inblandade i neuronal överlevnad efter stroke. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Uzdensky, AB Apoptosreglering i penumbra efter ischemisk stroke: Uttryck av pro- och antiapoptotiska proteiner. Apoptosis 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt är ett molekylärt mål för signaltransduktionsterapi vid ischemisk skada i hjärnan. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Rollen av Akt (proteinkinas B) och proteinkinas C i ischemi-reperfusionsskada. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP Hämning av PTEN av peroxinitrit aktiverar fosfoinositid-3-kinas/Akt neuroprotektiv signalväg. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [CrossRef]

20. Manning, BD; Toker, A. AKT/PKB Signalering: Navigera i nätverket. Cell 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Specifika roller av Akt iso-former i Apoptos och Axon Growth Regulation i neuroner. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Akt-isoformerna finns på distinkta subcellulära platser. Am. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, C580–C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Tidig ischemisk förkonditionering kräver Akt- och PKA-medierad aktivering av eNOS via serine1176-fosforylering. Cardiovasc. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Comb, M.; Liu, C.-L.; Martone, ME; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Överlevnads- och dödsbefrämjande händelser efter övergående cerebral ischemi: Fosforylering av Akt, frisättning av cytokrom C och aktivering av kaspasliknande proteaser. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126-1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorulla, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Förkonditionering vid neuroprotektion: Från hypoxi till ischemi. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB En fosfatidylinositol 3-kinas/Akt-väg främjar translokation av Mdm2 från cytoplasman till kärnan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH Fosforylering av HDM2 av Akt. Onkogen 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu inducerar p53 ubiquitination via Akt-medierad MDM2-fosforylering. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 973–982. [CrossRef]

29. Grossman, SR; Perez, M.; Kung, AL; Joseph, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Livingston, DM p300/MDM2-komplex deltar i MDM2-förmedlad p53-nedbrytning. Mol. Cell 1998, 2, 405–415. [CrossRef]

30. Toth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Differentiell reglering av kardiomyocytöverlevnad och hypertrofi genom MDM2, en E3 Ubiquitin Ligase. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

31. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Ischemisk förkonditionering skyddar genom att aktivera prosurvival kinaser vid reperfusion. Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM p53 nedreglering: En ny molekylär mekanism involverad i ischemisk förkonditionering. FEBS Lett. 2003, 555, 302–306. [CrossRef]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Menual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. MDM2-p53-vägen är involverad i förkonditioneringsinducerad neuronal tolerans mot ischemi. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G i MDM2-arrangören bestämmer funktionellt resultat efter stroke. Stroke 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Feng, J.; Park, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA Identifiering av ett PKB/Akt hydrofobiskt motiv Ser-473-kinas som DNA-beroende proteinkinas. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189–41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Excitotoxicitet och stroke: Identifiera nya mål för neuroskydd. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Constantino, LC; bindemedel, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Role of Phosphatidylinositol-3 Kinase Pathway in NMDA Preconditioning: Different Mechanisms for Seizure and Hippocampal Neuronal Degeneration Induced by Quinolinic Acid. Neurotox. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt Isoformer Differentiellt skyddar mot strokeinducerad neuronskada genom att reglera mTOR-aktiviteter. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE Förkonditionerande doser av NMDA främjar neuroskydd genom att förbättra neuronal excitabilitet. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, DW Ischemisk tolerans i murin kortikal cellkultur: kritisk roll för NMDA-receptorer. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. Differentiella roller för NMDA-receptorsubtyper i ischemisk neuronal celldöd och ischemisk tolerans. Stroke 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomez-Sanchez, JC; Esteban, MD; Rodriguez-Hernandez, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; Gonzalez Sarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Den mänskliga Tp53 Arg72Pro polymorfismen förklarar olika funktionella prognoser vid stroke. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic Factor (MANF) skyddar mot neuronal apoptos via aktivering av Akt/MDM2/p53 signalväg i en råttmodell av intracerebral blödning. Främre. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuclear WRAP53 främjar neuronal överlevnad och funktionell återhämtning efter stroke. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

45. Burmistrova, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jimenez-Blasco, D.; Eremeeva, T.; Shishov, D.; Romanov, S.; Zakurdaeva, K.; Almeida, A.; Fedichev, PO; et al. Inriktning på PFKFB3 lindrar cerebral ischemi-reperfusionsskada hos möss. Sci. Rep. 2019, 9, 1–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -gallate inducerar apoptos och G2-cellcykelstopp genom Akt/MDM2/p53-vägen i cisplatinresistent äggstockscancer A2780/CP70-celler. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X; Ja, X. Det LXR-623-inducerade långa icke-kodande RNA:t LINC01125 undertrycker proliferationen av bröstcancerceller via PTEN/AKT/p53-signalvägen. Celldöd Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin dämpar rörelse- och kognitiva underskott samt hippocampus neuronal skada genom signalvägen PI3K/Akt1/GSK-3 i en in vivo-modell av cerebral ischemi. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Ändringar av Akt1 (PKB ) och p70S6K i transient fokal ischemi. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1, och NCX3: Två nya effektorer av fördröjd förkonditionering vid hjärnischemi. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. Reglering av MDM2-stabilitet efter DNA-skada. J. Cell. Physiol. 2015, 230, 2318–2327. [CrossRef]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Identifiering och karakterisering av multipla mdm-2-proteiner och mdm-2-p53-proteinkomplex. Oncogene 1993, 8, 2353-2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Förbättrad fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K)/Akt-signalering har pleiotropa mål i hippocampala neuroner som utsätts för järninducerad oxidativ stress. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. Mitokondriell-nukleär p53-handel kontrollerar neuronal känslighet vid stroke. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 koordinerar neurogenes och kortikal storlek under utveckling. Nat. Commun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC NMDA-receptorernas roll i utvecklingen av hjärnresistens genom för- och efterkonditionering. Åldrande Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Syre- och glukosbrist inducerar mitokondriell dysfunktion och oxidativ stress i neuroner men inte i astrocyter i primärkultur. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [CrossRef]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop i individuella celler. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP driver brösttumörinitiering, progression och metastasering hos möss och är ett potentiellt terapeutiskt mål. J. Clin. Undersök. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gomez-Sanchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforylerar Cdh1 och modulerar cyklin B1-stabilitet i excitotoxicitet. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Reglering av Bcl-xL-ATP-syntasinteraktion med mitokondriell cyklin B1-cyklinberoende kinas-1 bestämmer neuronal överlevnad. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Rock2-vägen kontrollerar dendritisk integritet och minne. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]