Skyddande effekt av total glykosid från Cistanche Salsa på experimentell leverskada

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964audrey.hu@wecistanche.com

Wang Yanfang, Zhao Jijun, Hai Pengli, Xue Peifeng, Li Hui, Li Minhui

Abstrakt

I detta experiment etablerades en modell för alkoholisk leverskada hos möss, och biokemiska indikatorer på leverfunktion och leverhistopatologiska förändringar användes som inspektionsindikatorer. Undersökaskyddande effekt av den totala glykosiden av cistanche salsa på experimentell alkoholisk leverskada. Ge totaltglykosid av cistanche salsahög dos (130 mg/kg) och medeldos genom sondmatning (100 mg/kg), låg dos (65 mg/kg) och bidentat (150 mg/kg) som det positiva kontrollläkemedlet. Resultaten visade att serum ALT och ASAT är signifikant ökade; SOD-aktiviteten i levern minskar och MDA-halten ökar; lipidos av leverceller uppträder. Den totala glykosiden i högdosgruppen cistanche salsa är effektiv för att förbättra leverfunktionsindex och minska lipiddegenerering av leverceller. På denna grundval, det preliminära fastställandet avechinakosidochakteosidinnehållet i den totala glykosid i cistanche salsa var 29,1 procent. Experimenten ovan visar att den totala glykosiden av cistanche salsa har en skyddande effekt på alkoholisk leverskada hos möss, och det är också bekräftat att echinakosid och acteosid är de huvudsakliga aktiva ingredienserna i den totala glykosiden av cistanche salsa.

Nyckelord: total glykosid av cistanche salsa; högpresterande vätskekromatografi; akteosid; echinakosid; alkoholisk leverskada

Citanche salsaär en Cistanche-växt av familjen Orobanchaceae (Orobanchaceae), även känd som salina, en flerårig örtartad parasitisk växt, huvudsakligen spridd i öknar, öknar och andra torra områden. De huvudsakliga produktionsområdena finns i Xinjiang och Inre Mongoliet. 1]. På grund av att Herba Cistanche av samma familj och samma släkt har grävts ut i stora mängder, och de parasitära växterna är svåra att reproducera, minskar de medicinska resurserna dag för dag, och det är svårt att möta efterfrågan på marknaden. I vårt land används folk cistanche salsa som ersättning för cistanche deserticola, men dess forskningsrapporter är få. För att ytterligare klargöra dess medicinska värde har den totala glykosiden av cistanche salsa (total glykosider av Cistanche salsa), en klass av substanser som innehåller fenyletanoidglykosider, studerats farmakologiskt.Den totala glykosiden i cistanche salsa har en skyddande effekt på nerverna[2] och kan skydda DNA från oxidativ skada orsakad av hydroxyl (OH·) [3]. Cistanche salsa fenyletanoidglykosider kan avsevärt öka superoxiddismutas (SOD) aktiviteten i mushjärta, lever och hjärnvävnader [4]. Ovanstående forskning tyder på atttotal glykosid av cistanche salsahar en antioxidant effekt.

Förekomsten av alkoholisk leversjukdom (ALD) ökar år för år i mitt land. Alkohol har blivit den näst vanligaste orsaken till leverskador efter viral hepatit [5]. För behandling av alkoholisk leverskada finns det en brist på säkra och effektiva läkemedel. Hur man använder växtresurser för att utveckla anti-alkohol och leverskyddande läkemedel och hälsoprodukter har väckt stor uppmärksamhet inom läkemedels- och livsmedelsindustrin. Efter omfattande litteratur har det visat sig att alkoholisk leverskada är relaterad till oxidativ stresstotal glykosid av cistanche salsa har en effekt på alkoholhaltiga leverskadory. Forskningen om den skyddande effekten är fortfarande tom. Forskningen i detta experiment ger en vetenskaplig grund för utveckling och utnyttjande av den totala glykosiden i cistanche salsa.

1 Material och utrustning

1. 1 Medicin och reagens

Cistanche salsatillhandahölls av Key Laboratory of Mongolian Medicinal Material Identification and Standardization, Baotou Medical College; Bifendate droppande piller (Zhejiang Wanbang Pharmaceutical Co., Ltd., batchnummer A02121139); Alanine Aminotransferase (ALT) Kit, Aspartame Acid aminotransferase (AST) kit, malondialdehyde (MDA) test kit, superoxid dismutase (SOD) kit, Coomassie brilliant blue protein bestämningskit (Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering, batchnummer 20110422); 56 graders sprit (Beijing Red Star Co., Ltd.); andra reagens är inhemskt rena.

1. 2 Djur

72 hanmöss av Kunming-arter som väger 17-22 g (Inner Mongolia University Laboratory Animal Center, Animal Qualification Certificate No.:6 (Mongolia 2002-0001)).

1. 3 Instrument

Ultraviolett-synlig spektrofotometer [Unico (Shanghai) Instrument Co., Ltd., modell UV-2000]; Mikroplattläsare (Beckman Coulter, USA, modell AD340); Höghastighetscentrifug (Hangzhou Aipu Instrument Equipment Co., Ltd., modell TG18-WS); Högpresterande vätskekromatograf (Thermo Fisher Scientific, Model Ultimate 3000); Analytisk balans (METTLER TOLEDO Instruments Co., Ltd. modell AR153O); Ultraljudsoscillator (Shanghai Branson, modell SB3200); Frys torkmedel (Beijing Boyikang Experimental Instrument Co., Ltd., modell FD-1-50).

2 Metoder och resultat

2. 1 Studie på total glykosid av cistanche salsa-aktivitet

2. 1. 1 Total glykosid av cistanche salsa-extraktion

2. 1. 1. 1 Extraktion av råextrakt

Väg upp 100 g cistanche salsa grovt pulver, tillsätt 600 ml 70 procent etanol och blötlägg i 3 timmar, extrahera ultraljud i 30 minuter, filtrera och upprepa stegen ovan två gånger på filteråterstoden, kombinera filtratet och koncentrera för att återvinna etanol tills den har ingen alkoholsmak, samla upp extraktet och frystorka det för att få cistanche salsa råextrakt 19,46 g.

2. 1. 1. 2 Reningsprocess

Placera 10 g av det råa extraktet av cistanche salsa i en bägare, tillsätt 20 ml vatten för att lösas upp i ultraljud, tillsätt 80 ml absolut etanol, skaka väl och placera det i 12 timmar och filtrera sedan, filtratet koncentrerades för att återhämta sig etanol tills ingen alkoholsmak, och frystorkas för att erhålla 8,408 g av den totala glykosiden av cistanche salsa-extrakt.

2. 1. 2 Gruppering och administrering av djur

72 möss matades adaptivt i 2 dagar före experimentet och delades slumpmässigt in i 6 grupper, var och en med 12 möss, nämligen en blank kontrollgrupp, en alkoholisk leverskada modellgrupp och en positiv kontrollgrupp (150 mg /kg bidentat), total glykosid i högdosgruppen cistanche salsa (130 mg/kg), den totala glykosidhalten i cistanchesalsas medeldosgrupp (100 mg/kg) och total glykosid i cistanche salsa låg- dosgrupp (65 mg/kg). Djuren i varje grupp gavs intragastrisk administrering (ig) två gånger om dagen, och ig-volymen var 0,2 ml/20 g kroppsvikt. Blankkontrollgruppen och modellgruppen gavs lika volymer saltlösning. Två timmar efter varje administrering, förutom den blanka kontrollgruppen, gavs de andra grupperna 56 graders vätska vid 0,4 ml/20 g kroppsvikt ig under 10 dagar i följd för att orsaka en akut alkoholisk leverskadamodell. Den 9:e dagen av modellbyggandet var fasta inte tillåten. På den tionde dagen gavs 56 graders vitt vin i 3 timmar. Ögongloberna togs blod och serumet separerades. Efter bloduppsamling avlivades mössen. Väg, ta höger leverlob och placera den i en 10-procentig formaldehydfixeringslösning och placera resten av levern i ett kylskåp vid -20 grader .

2. 1. 3 Statistisk bearbetning

Använd SPSS 11.5 statistisk programvara för att bearbeta data, variansanalys, P<0.05 is="" statistically="">

2. 1. 4 Effekten av den totala glykosiden av cistanche salsa på kroppsvikt, levervikt och leverindex vid akut alkoholisk leverskada hos möss

Som visas i tabell 1 var levervikten och leverindexet för möss i modellgruppen signifikant högre än de i den tomma kontrollgruppen (P<0.05), indicating="" liver="" damage.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" liver="" weight="" and="" liver="" index="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" and="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" reduced="" (p=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low-dose="" groups="" (="" p="">0.05).

2. 1. 5 Effekten av total glykosid av cistanche salsa på serum ASAT och ALAT

Det uppsamlade blodet centrifugerades vid 3,5 x 103 r/min under 10 minuter för att framställa serum. Med användning av Lais metod användes UV-Vis spektrofotometer 505 nm avläsningar för att bestämma aktiviteten av ALT och ASAT i serum. Som visas i tabell 2 var serum-ALAT och AST i modellgruppen signifikant högre än de i den tomma kontrollgruppen (P<0.05), indicating="" that="" the="" model="" group="" was="" successfully="" modeled.="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" model="" group=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" were="" significantly="" lower=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" middle="" and="" low="" dose="" group="" and="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 6 Effekten av den totala glykosiden av cistanche salsa på MDA-innehållet och SOD-aktiviteten i levern

Ta 0,3 g levervävnad för att förbereda 10 procent och 1 procent homogenat. Centrifugera 1 procent leverhomogenat med 3,5 × 103 r/min i 10 minuter och ta supernatanten. Lösningen, proteinet i leverhomogenat, bestämdes med Coomassie Brilliant Blue-metoden. Ta 1 procent leverhomogenat supernatant, kör enligt SOD-testrutan och läs av vid 450 nm på mikroplattläsaren. Ta 10 procent leverhomogenat supernatant, kör enligt MDA-bestämningssatsen och mät absorbansen (A532) med en spektrofotometer vid 532 nm.

Som visas i tabell 3 var MDA-innehållet i levern hos modellgruppen signifikant högre än i den tomma kontrollgruppen (P<0.05), and="" the="" sod="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" in="" the="" liver="" of="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" of="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low="" dose="" groups="" had="" no="" difference="" in="" mda="" and="" sod="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 7 Effekten av total glykosid av cistanche salsa på patologiska förändringar av levervävnad hos möss

Patologisk undersökning: levervävnad fixerad med 10 procent formaldehyd, konventionell paraffininbäddad sektion (skivtjocklek 5 μm), HE-färgning och observation av leverhistopatologiska förändringar under ljusmikroskop.

Levern i den tomma kontrollgruppen är mörkröd till färgen och mjuk i konsistensen. Strukturen av levervävnaden är normal och strukturen av leverlobuli är intakt. Den är polygonal med tydliga gränser, och kärnan är rund och tydligt placerad i mitten av cellen. Levervolymen hos mössen i modellgruppen och den totala glykosidhalten i cistanche salsa-medel- och lågdosgrupper ökade och färgen blev gul. De patologiska förändringarna under mikroskopet var främst fettdegeneration av hepatocyter, med diffusa lipidvakuoler och hepatocyter i cellerna. Stor, cytoplasman är fylld med små lipiddroppar och vakuoler, och kärnan är fortfarande i centrum. I den positiva kontrollgruppen och den totala glykosiden i högdosgruppen cistanche salsa reducerades lipidos av leverceller hos möss i viss utsträckning, och antalet lipiddroppar minskade i viss utsträckning.

2. 2 Huvudkomponentanalys av total glykosid i cistanche salsa

2. 2. 1 Kromatografiska förhållanden

De kromatografiska förhållandena var kromatografisk kolonn ZORBAX ODS (250×4,6 mm, 5μm); mobil fas: metanol 0,2 procent myrsyralösning (27,5∶72,5), gradienteluering; kolonntemperatur 30 grader; flödeshastighet 1 ml/min; detektionsvåglängd 334 nm. Under ovanstående kromatografiska betingelser, separeringen avechinakosidochakteosidär bra.

2. 2. 2 Beredning av referenslösning

Väg upp 1,3 mg och 1,2 mg noggrantechinakosidochakteosidreferensämne för att framställa {{0}}.13 mg/ml echinakosid referenssubstanslösning och 0.12 mg/ml akteosid referenslösning.

2. 2. 3 Beredning av testlösning

Väg noggrant 0.1082 g av den totala glykosiden av cistanche salsa-extrakt och späd till 50 ml med lösningen i mobilfas.

2. 2. 4 Linjärt samband

Rita referenslösningen {{0}} exakt. 06, 0. 12. 0. 18. {{10}}. 24. 0. 30, 0. 48. 0. 54. 0. 72. 1. Vid 20 mg/ml, injicera 5 μL i vätskekromatografin i följd, och beräkna regressionsekvationen med injektionsvolymen (ug) för de två referensämnena som abskissan och motsvarande topparea som ordinatan. echinacoside: Y=11.868 X-0.0785, R=0.9997; akteosid: Y=18.026X-0.1913, R=0.9997. Som ett resultat har echinakosid-referenssubstansen ett bra linjärt samband i intervallet 0,0635 till 0,4445 ug; akteosidreferenssubstansen ligger i intervallet 0,059 till 1,18 ug. Det inre linjära sambandet är bra.

2. 2. 5 Precisionstest

Dra exakt 10 μL av samma testlösning och upprepa injektionen 5 gånger under ovanstående kromatografiska förhållanden. Spela in kromatogrammet och bestäm topparean. Resultatet är RSD för echinacoside 0,89 procent,RSD avakteosid är 1,87 procent, vilket indikerar att instrumentets precision är bra.

2. 2. 6 Stabilitetstest

Samma testlösning, respektive, vid 0, 2, 4, 8, 16, 32, 40, 48 h, dra noggrant 10 L, injicera det i vätskekromatografen, spela in kromatogrammet och mät dess topparea . Resultatet är RSD-en av echinacoside 1. 58 procent, RSD-en avakteosidär 0. 49 procent, vilket indikerar att testlösningen är inom 48 timmar

Stabiliteten är bra.

2. 2. 7 Repeterbarhetstest

Väg noggrant cirka 0,2 mg av samma sats prover, totalt 5 delar, och förbered 5 delar av lösningen. Enligt metoden för innehållsbestämning pipetterar du noggrant 10 μL i vätskekromatografen, registrerar kromatogrammet och bestämmer topparean. Resultatet är echinacoside. RSD på 1,91 procent och RSD för Verbascum-glykosider var 2,08 procent, vilket indikerar att bestämningsmetoden har god repeterbarhet.

2. 2. 8 Test av återhämtningsgrad

Väg 0,2 g av en noggranttotal glykosid av cistanche salsa, lägg till en viss mängdechinakosid och akteosidreferensämnen, bered testlösningen enligt metoden under 2.2.3 ovan och utför bestämningen enligt haltbestämningsmetoden under de angivna kromatografiska förhållandena. Resultatet Den genomsnittliga återvinningsgraden för echinakosid är 98,49 procent, RSD 1,06 procent, den genomsnittliga återvinningsgraden för akteosid är 97,35 procent och RSD är 1,45 procent.

2. 2. 9 Bestämning av prover

Dra exakt upp 10 μL vardera av referenslösningen och testlösningen, injicera provet, bestäm de kromatografiska förhållandena ovan och beräkna provinnehållet med den externa standardmetoden. Resultaten visas i tabell 4. Det genomsnittliga innehållet av echinakosid är 24,5 procent och det genomsnittliga innehållet avakteosidär 4,6 procent.

3 Diskussion

Alkoholisk leverskada avser leverskador och en rad patologiska förändringar orsakade av långvarigt stort drickande. Långvarigt överdrivet alkoholintag kan orsaka levercellsskador och sedan utveckla leverfibros och till och med levercirros [6]. Jämfört med modellgruppen minskade den totala glykosiden i högdosgruppen cistanche salsa i detta experiment signifikant aktiviteten av ALT och AST i musserum, minskade signifikant innehållet av MDA i levern och ökade signifikant aktiviteten av SOD. , vilket minskade lipidos av leverceller i viss utsträckning. , Minska antalet lipiddroppar. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan mellan- och lågdosgruppen och modellgruppen. Resultaten av detta experiment överensstämmer med forskningsresultaten från sidrotektiv effekt av de totala glykosiderna av Cistanche på alkoholisk leverskada hos möss [7].

Den totala glykosiden i cistanche salsa skyddar levercellsskadagenom att minska permeabiliteten hos cellmembranet och öka innehållet av ALT och AST som frigörs i blodet; det kan öka aktiviteten av SOD och eliminera ett stort antal fria radikaler som produceras av alkohol i kroppens ämnesomsättning. ; Det kan minska bildningen av MDA och förhindra att det skadar membranstrukturen i vävnadsceller [8-10]. Den totala glykosiden av cistanche salsa har en skyddande effekt på alkoholisk leverskada, och det finns ett kvantitativt effektsamband. När man kontrollerar litteraturen finns det ingen kvantitativ analys av de aktiva ingredienserna i total glykosid av cistanche salsa. I denna uppsats, innehållet iakteosidochechinakosid, huvudkomponenterna i den totala glykosiden av cistanche salsa, analyserades kvantitativt för första gången med HPLC, som stod för 29,1 procent av de totala glykosiderna. Tillhandahålla en vetenskaplig grund för utveckling och användning av total glykosid i cistanche salsa. Moderna farmakologiska studier har funnit att echinakosid har en skyddande effekt på PC12-celler skadade av väteperoxid och oxidativ stressskada hos vaskulära demensråttor [11,12]. Bådeechinakosid och akteosid har hämmande effekter på hepatocyternas cytotoxicitetinducerad av D GalN och TNF- [13]. Vidare spekuleras det atttotal glykosid av cistanche salsa skyddar möss från alkoholisk leverskadakan förstärkas avechinakosid och akteosidför att förbättra cellulär antioxidant enzymaktivitet, förbättra antioxidantkapaciteten hos leverceller, och därigenom upprätthålla integriteten hos levercellernas plasmamembran, så att levercellerna kan fungera normalt Defensiva och kompenserande funktioner. Vi kommer att ytterligare isolera föreningarna i framtida studier och använda molekylärbiologiska tekniker för att studera regleringen av monomera föreningar på levercellapoptos och deras samband med regleringen av relaterade målgener.

referenser

1 Zhang HW. Studier av kemiska beståndsdelar och

fingeravtryck av Cistanche salsa (CA Mey.) G. Beck. Ho hot: Inner Mongolia Medical College, MSc. 2008.

2 Tian XF, Pu XP. Fenyletanoidglykosider från Cistanches salsa hämmar apoptos inducerad av metylfenylpyridiniumjon i neuroner. J Ethnopharmacol, 2005, 97: 59-63.

3 Wang XW, Jiang XY, Wu LY. Rengörande effekter av glykosider av Cistanche på fria radikaler och dess skydd mot OH·-inducerad DNA-skada in vitro China Pharm J, 2001, 36: 29-32.

4 Wu HH. Beredning och antioxidantaktivitet av fenyletanoidglykosider från Cistanche salsa. Nanjing: Nanjing Agricultural University, MSc. 2008.