Kvantitativ proteomisk analys av covid-19-patienter: Fetuin-A och tetranektin som potentiella modulatorer av medfödda immunsvar

ABSTRAKT

Behandling av allvarliga fall av coronavirus sjukdom 2019 (COVID-19) är extremt viktig för att minimera dödsfall och skador på slutorganen. Här utförde vi en proteomisk analys av plasmaprover från milda, måttliga och svåra covid-19-patienter. Analys avslöjade differentiellt uttryckta proteiner och olika terapeutiska potentiella mål relaterade till medfödda immunsvar som fetuin-A, vitronektin (TN) och paraoxonas-1 (PON1). Dessutom visade proteinförändringar i plasma dysreglering av komplement- och koagulationskaskader hos COVID-19-patienter jämfört med friska kontroller. Sammanfattningsvis föreslog våra proteomikdata fetuin-A och TN som potentiella mål som kan användas för diagnos såväl som signaturer för en bättre förståelse av patogenesen av COVID-19-sjukdomen.

Ändorgan hänvisar till de vävnader eller organ som slutligen fullföljer specifika funktioner i människokroppen, såsom lever, njurar och lungor. Skador på dessa organ kan leda till en mängd stora sjukdomar, såsom kronisk njursjukdom, levercirros och kronisk obstruktiv lungsjukdom. Immunitet avser kroppens immunsvar mot främmande patogena mikroorganismer och vävnader. Kroppens immunitet förblir normal, vilket kan förhindra uppkomsten och ytterligare försämring av sjukdomar. Därför är skador på slutorganen nära besläktade med immunitet, och de interagerar för att påverka människokroppens immunfunktion.

Ändorganskador kan leda till skador på antalet och kvaliteten på immunceller i kroppen. Till exempel kommer patienter med leversjukdom att uppleva leukopeni, onormal leverfunktion och minskad antikroppssyntes, vilket kommer att göra dem mer mottagliga för infektion efter sjukdom; nedsatt njurfunktion leder till uremi. Syndrom, anemi, osteoporos och andra sjukdomar, dessa faktorer kommer också att påverka kroppens immunförsvar. Å andra sidan kan kroppens immunsvar också påverka ändorgan, till exempel kan överdrivet immunsvar leda till immunhepatit eller anafylaktisk lunginflammation. Samspelet mellan skador på slutorganen och immunstörningar gör kroppen mer mottaglig för sjukdomar och förkortar dess livslängd.

Därför är upprätthållande av normal slutorganfunktion och robust immunfunktion nyckeln till att upprätthålla god hälsa. Människor bör förebygga skador på slutorganen genom en bra livsstil, såsom en hälsosam kost, rätt motion och avslappning, och bibehålla en normal immunfunktion genom aktivt förebyggande och behandling av sjukdomar. Det kan ses att vi måste vara uppmärksamma på vår immunitet. Cistanche kan förbättra immuniteten, och effekten är god. Polysackariderna i köttet kan reglera immunsvaret hos det mänskliga immunsystemet, förbättra immuncellernas stressförmåga och stärka immuncellerna. bakteriedödande effekt.

Klicka på hälsofördelarna med cistanche

1. Introduktion

Svårt akut respiratoriskt syndrom, coronavirus 2 (SARS-CoV-2), orsakade coronavirussjukdom 2019 (COVID-19) [1]. COVID-19-sjukdomen kännetecknas av olika kliniska fenotyper som sträcker sig från asymtomatiska, milda och måttliga till svåra eller extremt svåra, kännetecknad av svår lunginflammation och en hög risk för dödsfall i den äldre befolkningen, särskilt hos patienter över 70 år [ 2,3]. Vacciner genererades sent under 2020 och de flesta människor världen över vaccinerades med minst 2 doser. Trots minskningen av antalet infekterade försökspersoner såväl som de allvarliga fall som rapporterats, är problemet så långt ifrån löst och orsaken till att sjukdomen utvecklas till ett allvarligt tillstånd är fortfarande okänd. Dessutom förändras SARS-CoV-2 liksom andra virus över tiden, och nya varianter kan ha en modifiering av de ursprungliga egenskaperna, såsom spridningen och associerad sjukdomsgrad, och bli mindre (omicronvariant) [4] eller mer (delta) variant) [5] svår. Den potentiella uppkomsten av nya varianter är fortfarande möjlig och det är mycket viktigt att förstå mekanismen för vägarna bakom covid-19-sjukdomen.

Det är välkänt att dysfunktion av immunsvar är huvudproblemet mot eliminering av viruset och återhämtning från sjukdomen. Dessutom anses medfödda immunsvar vara nyckelfaktorerna för att modulera sjukdomens utveckling mot asymtomatiska, milda, måttliga, svåra eller extremt svåra kliniska fenotyper [6,7]. Neutrofiler och monocyter/makrofager är de avgörande frontlinjens försvarselement som driver de medfödda immunsvaren under infektion [8,9]. SARS-CoV-2 spikprotein kan aktivera makrofager direkt via ACE2-receptorn som finns i dessa celler [10].

Under hela infektionen frigjorde immunceller flera proteiner, cytokiner och mediatorer för att reglera inflammation och upprätthålla kroppens fysiologiska homeostas. Plasmabaserad proteomik är ett praktiskt tillvägagångssätt för att analysera proteinprofiler och sortera ut förändringar associerade med patofysiologiska tillstånd eller sjukdomsprogression [11]. Olika proteomikstudier utfördes för att identifiera och karakterisera proteomprofiler i olika COVID-19-kohorter med hjälp av vävnader [12,13], celler [14] eller plasma [15,16]. Därför använde vi plasmabaserad proteomik för att identifiera potentiella medfödda immunsystemassocierade proteiner som är relevanta för covid{10}}-sjukdomen och utvecklingen av svårighetsgraden. Vi siktar på att studera mönstret för plasmaproteinuttryck hos friska och covid{11}}infekterade patienter och att utvärdera potentiell interaktion med medfödda immunsvar.

2. Resultat

2.1. Plasma proteomiska profiler

För att bedöma värdsvaren för SARS-CoV-2 utfördes en plasmaproteomikanalys av en kohort av COVID-19-patienter och friska kontroller. I vår studie valdes iTRAQ 4plex-metoden noggrant framför andra proteomikmärkta metoder på grund av den höga reproducerbarheten och proteomtäckningen [17]. Dessutom, för ett bättre djup av total proteomtäckning, kombinerade vi stark katjonbytespeptidfraktionering med iTRAQ. En illustration av studiens arbetsflöde visas i fig. 1. Totalt 176 proteiner identifierades i alla covid-19 och friska kontrollplasmaprover med en falsk upptäcktsfrekvens på<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1.20 för uppreglering och<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

Resultaten avslöjade att antalet proteiner som förändrades mellan grupper av jämförelser varierade såsom visas i Fig. 2a. Jämförande resultat visade att 27 procent av de differentiellt uttryckta proteinmätningarna överlappar i alla tre grupperna (Fig. 2b). Venn-diagrammet visade också att antalet unika proteiner i parvis medkänsla av mild kontra kontroll har ett högre antal jämfört med andra grupper. Detta återspeglar inte nödvändigtvis skillnaderna på proteinidentifieringsnivån utan den kvantitativa nivån med tanke på att de statistiska kriterierna valdes för veckändringen och p-värdet. För att bedöma om de differentiellt uttryckta proteinmätningarna för alla jämförelser kan särskiljas mellan COVID-19-grupper eller inte, användes PCA-analys. Intressant nog visade resultaten att det fanns en tydlig skillnad mellan covid-19-grupper som visas i fig. 3. Dessutom har differentiellt uttryckta proteiner presenterats genom att skapa en vulkanplot för alla parvisa jämförelser av frisk kontroll kontra covid{{ 7}} grupper (Fig. 4). Flera av de differentiellt uttryckta proteinerna i vår datauppsättning har tidigare rapporterats som biomarkörer för COVID-19 [16,18].

Genontologi och väganalys med hjälp av onlineverktyget 'STRING' utfördes på de differentiellt uttryckta proteinmätningarna för friska kontroll- och covid{{0}}-patienter oavsett vilken grupp de är i. För go-anrikningsanalyser, majoriteten av differentiellt uttryckta proteiner visade sig vara involverade i biologisk reglering, extracellulär region och molekylär funktionsregulator för den biologiska processen, cellulärt komplement respektive molekylär funktion (kompletterande material, Fig. S1). Dessutom har vi studerat de differentiellt uttryckta proteinerna och deras inblandning i väganalys med hjälp av KEGG-databasen. De statistiska kriterierna för anrikningsanalysen valdes att vara p < 0,01 och rangordningen av vägtermer baserades på veckberikning som visas i tilläggsmaterialet (Fig. S2). Under hela infektionen initierar skadade och döda celler stora immunsvar och frigör olika cellkomponenter och endotoxiner som aktiverar blodkoagulationskaskaden [19]. Aktivering av sådana vägar leder till endoteldysfunktion och inflammation samt stimulering av leukocytmigrering och vävnadsinfiltration, vilket utlöser aktivering av medfödda lokala immunsvar [20]. I vår studie visade sig komplementsystemet som är den centrala modulatorn av medfödd immunitet och koagulationskaskadvägar vara den viktigaste bland andra vägtermer. Flera proteomikstudier på plasma från covid-19-patienter visade att komplement- och koagulationskaskaderna var en av de mest berikade vägarna [21,22]. Fokus i vår diskussion ligger dock på tre proteiner fetuin-A, TN och PON-1 som potentiella nya mål involverade i medfödda immunsvar på SARS-COV-2-infektion och svårighetsgraden av covid{{ 14}} sjukdom.

2.2. Plasmanivåer av TNF är associerade med covid-19 sjukdomssymptom

Cytokinstorm inducerad av Sars-CoV2 är ett tecken på allvarliga fall av covid-19-sjukdomen [23]. Det rapporterades att överfrisättningen av TNF är associerad med svårighetsgraden och den dåliga prognosen för patienter med covid-19-sjukdom [24,25]. I vår studie visade mätning av plasmanivåer av TNF en förväntad ökning av covid-19-grupper jämfört med friska kontroller, bekräftat med en ytterligare ökning av allvarliga prover jämfört med måttliga eller milda prover.\

3. Diskussion

Flera oriktade proteomikstudier har använts för att undersöka förändringen i covid-19 serum-/plasmaprover. Antalet identifierade proteiner från dessa studier varierar på grund av de olika metoder som användes. Etikettfri kvantifieringsmetod med hjälp av en dataoberoende insamlingsmetod visade högre plasmaproteomtäckning [26]. För den märkningsbaserade proteomiska metoden har Orbitrap LC-MS/MS-baserad TMT-kvantifieringsmetod visat högre plasma-/serumproteomtäckning med antalet identifierade proteiner som når 900 [27]. I vår studie var det totala antalet identifierade proteiner 176, vilket är mycket nära två publicerade studier som använde samma massanalysator (TripleTOF) där de identifierade 179 och 189 proteiner [28,29]. Cirkulerade proteiner i plasman hos COVID-19-patienter utgör ett fönster för att upptäcka sjukdomens framsteg och svårighetsgrad, såväl som signaturen för inflammation och medfödda och adaptiva immunsvar.

Produktion och överfrisättning av proinflammatoriska cytokiner anses vara nyckelpunkten för att flytta den kliniska fenotypen från måttlig till svår status hos covid-19-patienter. Under infektionsförloppet moduleras medfödda immunsvar av skadeassocierade molekylära mönster (DAMPs) eller patogenassocierade molekylära mönster (PAMPs) [30]. Akutfasproteiner (APP) såsom fetuin-A frisätts systematiskt i plasma för att stödja den antiinflammatoriska processen under inflammation. I vår studie observerar vi en tydlig nedreglering av plasmatisk fetuin-A i måttliga och svåra fall jämfört med friska kontroller (Fig. 4). Det visades att fetuin-A kan hämma tidiga (TNF, IL-1, IL-6 och INF) och sena (HMGB1) mediatorer som frisätts av medfödda immunceller såsom makrofager [31]. Analys av TNF i vår COVID-19-kohort indikerar en trend av ökning av plasmakoncentrationen jämfört med friska donatorer som är mer potentierade i allvarliga fall (kompletterande material, Fig. S3). Under inflammation frigjorde aktiverade monocyter/makrofager pro-inflammatoriska cytokiner som försvagas av en allestädes närvarande biogen amin som kallas spermin [32]. Emellertid är spermins antiinflammatoriska effekter beroende av fetuin-A. Sålunda kunde spermin inte hämma funktionen hos monocyt/makrofag fetuin-A-bristceller [33]. Dessutom kan en minskning av fetuin-A-nivån vara relaterad till vaskulära abnormiteter och trombos som upptäcks i extremt allvarliga fall på grund av en ökning av vaskulär förkalkning och endoteldysfunktion [34,35] och oxidativ stress [36] associerad med fetuin-A-nivåer .

Efter virusinfektion är cellapoptos en av värdarnas försvarsmekanismer. Men överackumulering av apoptotiska celler på grund av defekter i apoptotisk cellclearance är associerad med hyperinflammation och autoimmunitet [37]. Minskning av plasmanivån av fetuin-A kan åtminstone delvis vara inblandad i denna process eftersom den ökar fagocytoskapaciteten att rengöra apoptotiska celler av makrofager [38] och vesikler av VSMC [39].

Nyligen rapporterades det att fetuin-A spelar en avgörande roll inte bara som en förkalkningshämmare utan som en multi-skyddande komponent genom att minska fibros och inflammation och modulera makrofagpolarisering [40].

Rudloff et al. visade att fetuin-A är en HIF-målgen som har en skyddande roll vid hypoxiinducerad njurdysfunktion [40]. Fetuin-A dämpar makrofagkalciumöverbelastning på grund av hypoxi. Vi har nyligen visat att SARS-CoV-2 coronavirus-spikproteinet aktiverar -1-liknande makrofager och ökar intracellulära kalciumnivåer [41]; sålunda kan fetuin-A spela rollen som kalciumfångare för att reglera cellhomeostas och modulera adekvat polarisering för rimliga medfödda immunsvar, och därigenom undvika överinflammation.

Multipelorgandysfunktionssyndrom (MODS) eller infektionsrelaterade MODS anses vara en av de främsta dödsorsakerna i allvarliga fall av covid-19 [42]. Hyperinflammation och immunförstöring under infektion leder till ändorganskada på grund av misslyckande av medfödd immunsvar och hypercytokinemi. Över systemisk infektion känns bakteriella endotoxiner och virala RNA igen av det medfödda immunsystemet som utlöser uttryck och frisättning av tidiga cytokiner (TNF och INF). Dessutom stimulerar frontlinjens medfödda immunsvar produktionen av sena mediatorer såsom högmobilitetsgrupp 1 (HMGB1) [43]. Intra eller extracellulärt HMGB1 uttryckt i de flesta celler är ett alarmin som frisätts vid stimulering eller efter cellens död [44]. Hyperfrisättning av HMGB1 utlöser cytokinproduktion som IL-6 [45]. Ökad IL-6-koncentration var associerad med allvarliga utfall vid multisysteminflammatoriskt syndrom hos barn (MIS-C) relaterat till SARS-CoV-2-infektion [46]. IL-6 utsöndras huvudsakligen av monocyter/makrofager, speciellt när de polariseras till en M1-liknande fenotyp. Det visades också att HMGB1 kan polarisera makrofager via Toll-like receptor (TLR) 4 [47].

Tetranektin (CLEC3B) är ett av de HMGB1-bindande proteinerna och dess interaktion kan modulera den biologiska funktionen och inflammatoriska processen under infektion. Högrenat TN-protein hämmade dosberoende LPS-inducerad HMGB1-frisättning i makrofager [48]. Oreglering av det medfödda immunförsvaret som leder till överaktivering av immunsystemet är en vanlig framtid för COVID-19 allvarliga fall och sepsis. Det visades nyligen att blodkoncentrationen av vitronektin minskar dramatiskt hos patienter med extremt svår sepsis [48]. Nyligen har Yuming Li et al. [49] rapporterade nedregleringen av vitronektin i allvarliga fall av covid{10}}-patienter med den etikettfria kvantitativa proteomikmetoden. Vi bekräftade den signifikanta plasmatiska minskningen av detta protein i vår studie (Fig. 4) med olika grupper och baserat på den etikettkvantitativa metoden. Vitronektin kan därför betraktas som en potentiell markör för medfödd immunförändring i samband med svårighetsgraden av covid{14}}-symtom.

Tetranektin är involverat i fibrinolyssystemet som leder till kontroll av onormal koagulation; sålunda är nedreglering av TN associerad med hjärt-kärlsjukdomar såsom kranskärlssjukdom (CAD) [50]. Anmärkningsvärt är att många allvarliga fall av SARS-COV-2-infekterade patienter uppvisar vaskulär dysfunktion, möjligen på grund av TN-brist. Nedgången av TN-serumnivån åtföljs av en minskning av paraoxonas 1 (PON1) vid olika hjärt-kärlsjukdomar. I vår studie kan nedreglering av PON1 (Fig. 4) vara en markör för sjukdomsprogression till allvarliga symtom eftersom det rapporterades att närvaron av inflammation och oxidativ stress är associerad med en minskning av serum PON1 vid hjärt-kärlsjukdomar [51] . Dessutom kan en låg nivå av PON1 förvärra den medfödda proinflammatoriska reaktionen på virusinfektion eftersom det visades att PON1 undertrycker makrofagöverreaktion och upprätthåller inflammation vid åderförkalkning [52]. Dysreglering av TN utövar inflytande på AMPK nedströms effektorer såsom HIF1 som reglerar fenotyp och funktion hos medfödda immunceller och modulerar makrofagpolarisering mot M1-liknande fenotyp såväl som DC-mognad [53,54].

Tillsammans kan nedreglering av vitronektin, fetuin-A och PON1 som observerats i måttliga och svåra fall vara associerad med dysreglering av medfödda immunsvar genom monocyt-/makrofagerdysfunktion, vilket leder till hyperfrisättning av cytokiner och progression av covid{{4} } sjukdom till svår status.

Dessutom avslöjade vår proteomiska analys en uppreglering av APOE (kompletterande material, Fig. S4) i svåra fall jämfört med friska kontroller. APOE-plasmanivåer är kända för att modulera lipoproteinfunktion och kardiometabola sjukdomar. Dessutom är APOE involverad i den inflammatoriska processen genom att byta makrofagpolarisering och påverka de pro-/antiinflammatoriska fenotyperna [55]. I överensstämmelse med detta rapporterades det att en ökning av APOE-nivåer kan vara associerad med covid-19 svårighetsgrad [56].

Under infektionsförloppet är interaktion mellan makrofag och komplementsystem viktig för medfödda immunsvar såväl som modulering av komplementfunktioner och övergång från medfödda till adaptiva immunförhållanden [57]. Komplementkomponentinteraktivitet med olika receptorer på makrofager driver den inflammatoriska processen och cytokinproduktionen. Det rapporterades i olika proteomikstudier att dysregleringen av komplementkaskad [58,59]i COVID-19-patienter och att aktivering av komplementsystemet intensifierar T-cellscytotoxicitet i allvarliga fall [60]. Vi rapporterade en signifikant ökning av komplement 1q, 5, 6, 7 (kompletterande material, Fig. S5) hos patienter med måttlig och svår covid{12}}. Under processen med apoptotisk cellclearning kontrollerar C1q monocyt/makrofagerpolariseringen och hämmar inflammasomaktivitet [61]. Anrikningsanalys visade en signifikant koppling mellan komplementkomponenterna C1q, C5, C6, C7 och koagulationskaskader, där vi också finner involveringen av kallikrein-kininsystemet genom kininogen-1 som modulerar medfödda immunreaktioner genom bradykininvägen.

Den aktuella studien har en begränsning när det gäller urvalsstorlek. Våra resultat har dock visat en god överensstämmelse med tidigare proteomics covid-19-studier där vi identifierade biomarkörer som visar liknande uttryck. Detta visar att proteomikmetoden som följs i denna studie är giltig, men kanske inte optimal.

4. Slutsats

Under SARS-COV-2-infektion är en störning i immunsvar det största problemet som driver upptrappningen av covid-19-sjukdomen till allvarliga fall. Mekanistiska vägar som leder till medfödd immundysfunktion är nyckelstenarna för att lösa de komplikationer som är förknippade med okontrollerad SARS-CoV-2-infektion. Så vitt vi vet är detta den första studien som använder iTRAQ-metoden på covid-19 plasma-/serumprover. Serumnivåer av TN, fetuin-A och PON1 är potentiella markörer som åtminstone delvis är inblandade i det medfödda immunsystemet, specifikt i hyperaktivering av makrofager, och kan följaktligen betraktas som potentiella mål för covid-19-behandling.

5. Material och metoder

5.1. Studiedesign och population

Våra studiekohorter inkluderar 25 försökspersoner: frisk kontroll (n=5) och 20 SARS-COV-2-infekterade patienter grupperade efter sjukdomens svårighetsgrad (fig. 1) i mild (n=5) , Måttlig (n=5), Svår (n=5) ​​och Död (n=5). Den döda gruppen uteslöts från början av studien på grund av samsjukligheter hos försökspersoner som kan påverka specificiteten hos covid{10}}-effekter. Alla patienter rekryterades vid King Abdallah Specialist Children's Hospital (KASCH) och King Abdulaziz Medical City (KAMC). Informerat samtycke undertecknades av alla deltagare medan de fyllde i ett frågeformulär om kliniska symtom och demografiska data.

Bloduppsamling: 3–5 ml venöst blod samlades in från varje patient. EDTA-rör användes för att samla in blodprover; sedan separerades plasma genom centrifugering före lagring vid 80 ◦C för vidare analys.

5.2. iTRAQ proteomics plasmaprovberedning

Fem biologiska prover från varje grupp slogs samman i ett prov. Alla plasmaprover utsattes sedan för Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin-patroner för att avlägsna de 14 mest rikliga proteinerna från plasma enligt tillverkningsprotokollet (Agilent, USA). Efteråt märktes proteinspjälkningar med 4-plex iTRAQ-reagens (Sciex, Kanada) enligt tillverkningsprotokollet med mindre modifieringar. Kort sagt denaturerades, reducerades och alkylerades 100 ug proteiner med användning av 8 M urea/100 mM trietylammoniumbikarbonat (TEAB), 50 mM Tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) respektive metylmetanetiosulfonat (MMTS). Proteinprover digererades sedan till peptider med användning av trypsin med ett förhållande av 1:40 (trypsin till protein). Därefter märktes peptidprover med 114, 115, 116 och 117 för frisk kontroll, svår, måttlig respektive mild. Alla fyra märkta proverna blandades sedan och slogs samman i ett prov.

5.3. Peptidfraktionering och avsaltning

Det poolade iTRAQ-provet fraktionerades offline baserat på katjonbyte med användning av Pierce Strong Cation Exchange (SCX) spinkolonn (Thermo Scientific, USA) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet konditionerades spin-kolonnen först med användning av {{0}},1 procent myrsyra följt av laddning av de märkta peptiderna i kolonnen. Två tvättsteg utfördes med användning av 0,1 procent myrsyra. Peptider eluerades sedan i 22 fraktioner genom att ändra förhållandet mellan 10 procent acetonitril och ammoniumformiatkoncentration från 15 mM till 900 mM. Därefter utfördes avsaltnings- och saneringssteget med polymert omvändfassorbent med Oasis HLB Cartridge (Waters, USA). Kort sagt, patronen konditionerades och jämviktades med acetonitril respektive 0,1 procent myrsyra. Märkta peptider laddades sedan och två steg av tvätt med 0,1 procent myrsyra applicerades. Elueringen av peptider utfördes med användning av 70 procent acetonitril.

5.4. NanoLC-MS/MS

Varje fraktion (totalt 22) laddades på en Ekspert nanoLC 425 (Eksigent, Dublin, CA, USA), kopplad till en TripleTOF 5600 (Sciex, Concord, Kanada) i tre exemplar. Separationen av peptider på NanoLC utfördes som beskrivits tidigare [41]. MS1 och MS/MS för iTRAQ-analys ställdes in enligt följande: TOF-massintervall 250–1500 med ackumuleringstid 0,25 s. IDA-kriterier var för joner större än 400 m/z med ett laddningstillstånd på 2–5. Överflödströskeln överstiger 200 cps. Den justerade CE när iTRAQ-reagensparametern kontrollerades. Jonkällparametrarna ställdes in enligt följande: jonkälla gas 1 (GS1), 25; Curtain Gas (CUR), 25; IonSpray Voltage Floating (ISVF), 2250; Interface Heater Temperature (HIT), 60.

5.5. iTRAQ kvantitativ proteomikanalys

De råa MS iTRAQ-data bearbetades med ProteinPilot Software (v 4.5, Sciex) för identifiering och kvantifiering. Parametrarna sattes in enligt följande: provtyp, iTRAQ 4plex, Cys, Alkylation, MMTS, Digestion, Trypsin, Special factors, Urea-denaturering, Species, Homo sapiens, Database, UniProt Proteome Humans-databas (nedladdad 29 oktober 2019); globala FDR kontrollerades.

Vikningsförändring och p-värde beräknades baserat på medelvärdet av peptidintensitet respektive Students t-test. iTRAQ MS-data deponerades i ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) med identifieraren PXD037400.

5.6. Bioinformatik analys

PCA-analys utfördes med hjälp av "principal"-funktionen i R statistisk programvara. VolcaNoseR [62] användes för att generera vulkanplotterna. STRING onlineverktyg [63] användes för genanrikning och analys av vägar med statistiska kriterier satta till p < 0.05. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) databas användes för väganalys.

5.7. Enzym-linked immunosorbent assays (ELISA) mätning

Prover preparerades som tidigare beskrivits [64] med användning av tumörnekrosfaktor (TNF-) och ELISA-analyskit (SEKH-0047, Solarbio life sciences). Kortfattat sattes 100 ul av prover eller standarder till varje brunn och inkuberades sedan vid 37 ◦C under 1 timme och 30 minuter. Efter tvättning fyra gånger med tvättbuffert tillsattes en biotinkonjugerad detektionsantikropp (100 ul) före inkubation under 1 timme vid 37 ◦C. Ett andra tvättsteg (fyra gånger) utfördes och Streptavidin-HRP (100 ul) tillsattes före inkubering under 30 min. Efter tvättning tillsattes en substratlösning (TMB) (100 ul) och inkuberades i 15 minuter i mörker innan stopplösning tillsattes, och mätning av absorbans detekterades vid 450 nm.

Finansiering

Den här artikeln stöddes av ett anslag från King Abdullah International Research Center nr. RC20/153/R och RC20/205/R och BioBank KAIMRC NGHA.

Etiskt godkännande och samtycke till att delta

Denna studie godkändes av Institutional Review Board (IRB) vid King Abdullah International Medical Research Center (KAIMRC) etikkommitté med IRB RC20/153/R och RC20/205/R. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla deltagare i studien.

Författarnas bidrag

BA: Tänkte och designade experimenten och analyserade och tolkade data. FAM, H⋅S, KA och HA: Utförde experimenten. FA, HSA och MR: Analyserade och tolkade data. FA, MJ, AH och MB: Bidrog med reagenser, material, analysverktyg eller data och skrev uppsatsen. TB: Tänkte och designade experimenten och analyserade och tolkade data.

Datatillgänglighetsförklaring

Data associerade med denna studie har deponerats på iTRAQ MS-data deponerades i ProteomeXchange Consortium med identifieraren PXD037400.

Intresseförklaringens utlåtande

Författarna förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller personliga relationer som kunde ha tyckts påverka det arbete som redovisas i denna artikel.

Erkännanden

Författarna uttrycker sin uppskattning till Researchers Supporting Project nummer (RSP-2023/17) vid King Saud University, Riyadh, Saudiarabien.

Referenser

[1] M. Almutlaq, et al., Classical and counter-regulatory renin-angiotensin system: potential key roles in COVID-19 pathophysiology, CJC Open 3 (8) (2021) 1060–1074.

[2] M. Ciccarelli, et al., Untargeted lipidomics avslöjar specifika lipidprofiler hos COVID-19 patienter med olika svårighetsgrad från regionen Kampanien (Italien), J. Pharm. Biomed. Anal. 217 (2022), 114827.

[3] Q. Zhang, et al., Human genetiska och immunologiska bestämningsfaktorer för kritisk COVID-19 pneumoni, Nature 603 (7902) (2022) 587–598.

[4] TF Aiello, et al., Infektion med Omicron-varianten av SARS-CoV-2 är associerad med mindre allvarlig sjukdom hos inlagda patienter med covid-19, J. Infect. 85 (5) (2022) e152–e154.

[5] CJH von Wintersdorff, et al., Infektioner med SARS-CoV-2 Delta-varianten uppvisar fyrfaldigt ökad virusbelastning i de övre luftvägarna jämfört med alfa eller icke-varianter av oro, Sci. Rep. 12 (1) (2022), 13922.

[6] JL Schultze, AC Aschenbrenner, COVID-19 och det mänskliga medfödda immunsystemet, Cell 184 (7) (2021) 1671–1692.

[7] AD Lopez-Munoz, et al., Cellyte SARS-CoV-2 nukleokapsidprotein modulerar medfödd och adaptiv immunitet, Sci. Adv. 8 (31) (2022) eabp9770.

[8] MS Cardoso, et al., Fysiska interaktioner med bakterier och protozoiska parasiter etablerar scavenger-receptorn SSC4D som en brett spektrum mönsterigenkänningsreceptor, Front. Immunol. 12 (2021), 760770.

[9] X. Wei, et al., EDIL3-brist förbättrar ogynnsam hjärtombyggnad genom neutrofila extracellulära fällor (NET)-medierad makrofagpolarisering, Cardiovasc. Res. 118 (9) (2022) 2179–2195.

[10] X. Cao, et al., Spike Protein of SARS-CoV-2 Aktiverar makrofager och bidrar till induktion av akuta lunginflammationer hos möss, 2020 bioRxiv.

[11] TE Angel, et al., Masspektrometri-baserad proteomik: befintliga möjligheter och framtida riktningar, Chem. Soc. Upps. 41 (10) (2012) 3912–3928.

[12] T. Wang, et al., Proteomic and metabolomic characterization of SARS-CoV-2-infected cynomolgus macaque på ett tidigt stadium, Front. Immunol. 13 (2022), 954121.

[13] X. Nie, et al., Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 obduktioner, Cell 184 (3) (2021) 775–791 e14.

[14] DE Gordon, et al., En SARS-CoV-2-proteininteraktionskarta avslöjar mål för återanvändning av läkemedel, Nature 583 (7816) (2020) 459–468.

[15] julian.knight@well.ox.ac.uk, CO-M.-oBACEa och CO-M.-oBA Consortium, A blood atlas of COVID-19 definierar kännetecken för sjukdomens svårighetsgrad och specificitet, Cell 185 (5) (2022) 916–938 e58.

[16] Y. Mohammed, et al., Longitudinell plasmaproteomikanalys avslöjar nya kandidatbiomarkörer vid akut covid-19, J. Proteome Res. 21 (4) (2022) 975–992.

[17] TM Casey, et al., Analys av reproducerbarhet av proteomtäckning och kvantifiering med användning av isobariska masstaggar (iTRAQ och TMT), J. Proteome Res. 16 (2) (2017) 384–392.

[18] T. Shu, et al., Plasmaproteomics identifierar biomarkörer och patogenes av COVID-19, Immunity 53 (5) (2020) 1108–1122 e5.

[19] GY Chen, G. Nunez, Steril inflammation: känna av och reagera på skada, Nat. Rev. Immunol. 10 (12) (2010) 826–837.

[20] CT Esmon, J. Xu, F. Lupu, Medfödd immunitet och koagulation, J. Thromb. Hemostas 9 (Suppl 1) (2011) 182–188.

[21] J. Park, et al., djupgående blodproteomprofileringsanalys avslöjade distinkta funktionella egenskaper hos plasmaproteiner mellan svåra och icke-svåra COVID-19-patienter, Sci. Rep. 10 (1) (2020), 22418.

[22] CB Messner, et al., Ultra-high-throughput clinical proteomics avslöjar klassificerare av COVID-19-infektion, Cell Syst 11 (1) (2020) 11–24 e4.

[23] C. Huang, et al., Kliniska egenskaper hos patienter infekterade med 2019 års nya coronavirus i Wuhan, Kina, Lancet 395 (10223) (2020) 497–506.

[24] DM Del Valle, et al., En inflammatorisk cytokinsignatur förutsäger COVID-19 svårighetsgrad och överlevnad, Nat. Med. 26 (10) (2020) 1636–1643.

[25] FX Danlos, et al., Höga nivåer av TNF-alfa hos patienter med COVID-19 refraktär mot tocilizumab, Eur. J. Cancer 149 (2021) 102–104.

[26] H. Li, et al., Plasma proteomic and metabolomic characterization of COVID-19-överlevande 6 månader efter utskrivning, Cell Death Dis. 13 (3) (2022) 235.

[27] B. Shen, et al., Proteomic and metabolomic characterization of COVID-19 patientsera, Cell 182 (1) (2020) 59–72 e15.

[28] J. Sarif, et al., Plasmagradient av löslig urokinas-typ plasminogenaktivatorreceptor är kopplad till patogent plasmaproteom och immuntranskriptom och stratifierar utfall vid svår COVID-19, Front. Immunol. 12 (2021), 738093.

[29] M. Villar, et al., Karakterisering genom kvantitativ serumproteomik av immunrelaterade prognostiska biomarkörer för COVID-19-symptomatologi, Front. Immunol. 12 (2021), 730710.

[30] H. Wang, AE Sama, Anti-inflammatorisk roll fetuin-A i skada och infektion, Curr. Mol. Med. 12 (5) (2012) 625–633.

[31] W. Li, et al., Ett leverprotein, fetuin-A, har en skyddande roll vid dödlig systemisk inflammation, PLoS One 6 (2) (2011), e16945.

[32] M. Zhang, H. Wang, KJ Tracey, Reglering av makrofagaktivering och inflammation av spermin: ett nytt kapitel i en gammal historia, Crit. Care Med. 28 (4 Suppl) (2000) N60–N66.

[33] H. Wang, et al., Fetuin skyddar fostret från TNF, Lancet 350 (9081) (1997) 861–862.

[34] M. Ketteler, et al., Association of low fetuin-A (AHSG)-koncentrationer i serum med kardiovaskulär mortalitet hos patienter på dialys: en tvärsnittsstudie, Lancet 361 (9360) (2003) 827–833.

[35] K. Caglar, et al., Serum fetuin-a-koncentration och endoteldysfunktion vid kronisk njursjukdom, Nephron Clin. Öva. 108 (3) (2008) c233–c240.

[36] NF El-Malkey, et al., Fetuin-A utövar en skyddande effekt mot experimentellt inducerad intestinal ischemi/reperfusion genom att undertrycka autofagisk celldöd, Exp. Biol. Med. (Maywood) 246 (11) (2021) 1307–1317.

[37] IK Poon, et al., Apoptotisk cellrensning: grundläggande biologi och terapeutisk potential, Nat. Rev. Immunol. 14 (3) (2014) 166–180.

[38] HP Jersmann, I. Dransfield, SP Hart, Fetuin/alpha2-HS-glykoprotein förstärker fagocytos av apoptotiska celler och makropinocytos av humana makrofager, Clin. Sci. (Lond.) 105 (3) (2003) 273–278.

[39] JL Reynolds, et al., Multifunctional roles for serum protein fetuin-a in inhibering of human vascular glatt muskelcellsförkalkning, J. Am. Soc. Nephrol. 16 (10) (2005) 2920–2930.

[40] S. Rudloff, et al., Fetuin-A är ett HIF-mål som skyddar vävnadsintegriteten under hypoxisk stress, Nat. Commun. 12 (1) (2021) 549.

[41] T. Barhoumi, et al., SARS-CoV-2 spike proteininducerad apoptos, inflammatorisk och oxidativ stressrespons i THP-1-liknande makrofager: potentiell roll för angiotensin-omvandlande enzym inhibitor (perindopril), Front. Immunol. 12 (2021), 728896.

[42] C. de Roquetaillade, et al., Timing and causes of death in severe COVID-19 patients, Crit. Vård 25 (1) (2021) 224.

[43] CS Zhu, et al., Endogen reglering och farmakologisk modulering av sepsis-inducerad HMGB1-frisättning och verkan: en uppdaterad recension, Cells 10 (9) (2021).

[44] H. Yang, H. Wang, U. Andersson, Targeting inflammation driven by HMGB1, Front. Immunol. 11 (2020) 484.

[45] N. Kamiya, HK Kim, Förhöjning av proinflammatoriskt cytokin HMGB1 i ledvätskan hos patienter med Legg-calve-perthes sjukdom och korrelation med IL-6, JBMR Plus 5 (2) (2021), e10429.

For more information:1950477648nn@gmail.com