Quercetin med lykopen modulerar enzymatiska antioxidantgeners väg i isoproterenol Kardiotoxicitet hos råttor Del 1

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

ABSTRAKT

Quercetin (QN) är en naturligt förekommande fenolförening som till stor del finns i grönsaker och frukter. Lykopen (LY) är ännu en naturlig fytoförening, som finns rikligt i rödfärgade frukter och grönsaker. Båda har rapporterats ha positiva aktiviteter på människor. I denna studie dokumenterar vi in ​​vivo experimentell modell förisoproterenol(ISO) hjärtskadatoxicitet hos Sprague-Dawley (SD)-råttor och behandling med en kombinerad optimerad koncentration av quercetin och lykopen (QL). SD-hanråttor i olika grupper behandlades med QL (80 mg/kg QN och 3 mg/kg LY tillsammans po) i 10 dagar med ISO-administrering (100 mg/kg ip) på dagarna 7 och 8. Efter experimentperioden, CK -MB, TROP, AST, ALT, LDH, GST, GPx, CAT, SOD, Vit. E, Vit. C, GSH, GSSG och MDA uppskattades. SD-råttor administrerade med ISO visade en uppenbar ökning av serummarkörens enzymnivåer och vävnadsoxidativ stressmarkörer (MDA och GSSG). Dessutom noterades markanta minskningar av kroppsvikten och ökningar av enzymatiska och icke-enzymiska antioxidantnivåer. Histologiska egenskaper hos hjärtat indikerade också en störning i hjärtmyofibrillerstrukturen hos ISO-berusade råttor. Kvantitativ PCR-analys avslöjade också involveringen av antioxidant- och relaterade gener som gener som Nrf2, HO-1, NQO1, GSTμ, SOD1, SOD2, CAT och BCl-2-gener. QLförbehandlingförhindrade alla dessa negativa effekter av ISO-kardiotoxicitet och minskade myokardskadan avsevärt. En minskning av oxidativ stress observerades, möjligen genom förändringar i uttrycksnivåerna förenzymatiskaantioxidantgener (GSTμ, SOD1, SOD2 och CAT). I allmänhet utövar QL en stark skyddande effekt genom moduleringarna i enzymantioxidantaktivitet och associerad molekylär vägreglerande effekt vid hjärt-kärlsjukdom.

Klicka här för att veta mer

1. Introduktion

Kardiovaskulär sjukdom (CVD) är en grupp sjukdomar som involverar blodkärl i hjärtat, hjärnan, armarna och benen. Personer med hjärt-kärlsjukdom presenteras med olika former av komplikationer som åderförkalkning, hjärtsvikt och stroke. Normalt orsakas både hjärtsvikt och stroke av en blockering av fettavlagringar på de inre väggarna i blodkärlen som försörjer blod till hjärtat eller hjärnan. Sådan blockering är förknippad med många beteendeaktiviteter såsom en ohälsosam kost, brist på motion, överdriven alkohol- och tobaksanvändning samt historien om diabetes och högt blodtryck (Turer, ATand Hill, JA2010). Ofta är många alarmerande varningar om hjärt-kärlsjukdom framträdande, som inkluderar domningar eller smärta i ansiktet och bröstområdet, förkortad andetag, illamående, kallsvettning och förlust av koordination. Manifestation av obehandlade CVD-komplikationer kan leda till dödliga utfall imyokardialinfarkt (Ml).

Myokardischemi (MI) avser en förvärring av hjärtvävnadsskada på grund av minskad syretillförsel och/eller minskad blodtillförsel till hjärtvävnad (Kocak et al., 2016).

Världshälsoorganisationen (WHO) rapporterade att MI förväntas vara den främsta orsaken till dödlighet, med dödligheten som ökar till 20 miljoner fall. För närvarande lever 130 miljoner människor med hjärt-kärlsjukdom med fler fall hos män (68 procent) än hos kvinnor (32 procent). Ungefär tre fjärdedelar av dödsfallen i hjärt-kärlsjukdom kommer från låg- och medelinkomstländer som Indonesien, Pakistan, Filippinerna och Bangladesh (Fajobi et al, 2020). De flesta människor från låg- och medelinkomstländer har begränsad tillgång till hälsovårdsbehandlingar för att svara mot deras behov. Som ett resultat diagnostiseras personer med riskfaktorer i ett senare skede och dör yngre på grund av hjärt-kärlsjukdomar. Medelåldern för dödsfall orsakad av hjärt-kärlsjukdom i låg- och medelinkomstländer är cirka 40 år medan den är cirka 80 år i utvecklade länder. En snabb ökning av incidensen och prevalensen av hjärt-kärlsjukdomar i utvecklade länder belyser dock de specifika egenskaperna hos västerlandets fas, vilket tar itu med en alarmerande oro vid hanteringen av hjärt-kärlsjukdom trots snabba framsteg inom hälso- och sjukvården (Ricardo et al., 2019).

Cistanche kan förbättra immuniteten

Utvecklingen av incidensen, som associerade funktionshinder och den skrämmande hälsokvaliteten med den ökande dödligheten i både utvecklingsländer och utvecklade länder, väckte ett stort intresse för forskning om terapeutisk behandling med en lämplig substans för att reglera hjärt-kärlsjukdom i termer av läkemedelseffektivitet och säkerhet. Även om vissa läkemedel förhindrar hjärt-kärlsjukdom, är dessa läkemedel antingen inte särskilt effektiva för att bekämpa sjukdomar eller förknippas med allvarliga biverkningar. Studier har föreslagit att inflammation spelar en viktig roll i CVD-patogenes (Pantazi et al, 2016). En ökad inflammatorisk respons resulterar i en serie onormala metaboliska och biokemiska fluktuationer i hjärt- och hjärnceller. Den långvariga syrebristen leder till mjölksyraackumulering och minskning av det intracellulära pH-värdet. Dessa sura förhållanden leder till stimulering av reaktiva syrearter (ROS). Ackumulering av ROS aktiverar därefter inflammatorisk respons som ytterligare höjer kontraktil dysfunktion, hypertrofi, fibros och celldöd. Dessa avvikelser kan samtidigt reagera på allvarligt brunkol under hela processen med CVD (Tsutsui et al, 2011).

En kombination av antioxidanter och antiinflammatoriska effekter kan avvärja dessa skadliga händelser och lindra hjärt-kärlsjukdomar och dess associerade komplikationer. Med denna teori föreslogs att användningen av vissa bioaktiva föreningar från naturliga produkter kan försvara en individ från CVD. Quercetin (QN) och lykopen (LY) är naturliga antioxidanter som främst finns i frukt och grönsaker, har i kombination unika biologiska egenskaper såsom antiinflammatoriska, anti-hypertensiva, antioxidanter och anti-cancer (Twinkle et al, 2019) ). Även om både QN och LY har en anmärkningsvärd preklinisk standard inom farmakologiområdet, har strategier som syftar till att hämma det inflammatoriska svaret i en kombination av QN och LY(QL) ännu inte utforskats mot hjärt-kärlsjukdom. Dessutom kan förbättringen av CVD genom terapeutisk administrering av QL vara ett lovande tillvägagångssätt mot CVD. Med denna information, i föreliggande studie, utfördes ett in vivo-experiment för att utvärdera den kardioprotektiva effekten av QL mot isoproterenol (ISO) inducerad kardiotoxicitet hos råttor.

2. Material och metoder

2.1.Kemikalier och reagenser

QN och LY av analytisk kvalitet köptes för denna undersökning och framställdes i 80 procent etanol. Följande kemikalier anskaffades från Sigma-Aldrich: ISO löstes i fosfatbuffertsaltlösning (PBS),2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC)färgningslösning, natriumdodecylsulfat (SDS),

(CDB), meta-1-klor,2,4-dinitrobensen 2-fosforsyra (MPA), fluormetansulfonat (M2VP), hematoxylin och eosin (H&E)-färgningslösning. Alla andra kemikalier som användes i experimentet var av analytisk kvalitet.

3. Experimentellt protokoll 3.7. Djurmodell

Totalt 32 Sprague-Dawley-råttor (7-9 veckor; 170-190 g) fria från någon sjukdom burades i en kontrollerad laboratoriemiljö och fick fritt dricka vatten och gnagarpellets. Acklimatisering till experimentella förhållanden utfördes under sju dagar i djurhuset innan experimenten påbörjades. Alla ytterligare protokoll utfördes för att minimera lidande. Det experimentella protokollet utformades enligt de internationella riktlinjerna och godkändes av Institutional Animal Ethics Committee (IAEO).

4. Experimentell design och läkemedelsadministration

SD-råttor grupperades i fyra grupper med åtta djur vardera (n{{0}}). Den effektiva dosen av QL fastställdes baserat på aktiviteterna av serumkreatinkinas-MB(CK-MB) i den preliminära studien för dosoptimering (data visas ej) och den var 80 mg/kg QN tillsammans med 3mg/kg LY. Råttor i grupp I (kontroll) fick 0,1 procent NaCl under hela experimentet (10 dagar). Råttor i grupp II fick oral administrering av QL under tio dagar. På den sjätte och sjunde dagen administrerades råttorna i grupp II och IV intraperitonealt med isoproterenol (100 mg/kg kroppsvikt). Även grupp IV-råttor administrerades QL samtidigt som i grupp Il. Följande var den tilldelade gruppinformationen:

Grupp 1: Kontroll (0,1 procent NaCl)

Grupp Il: QL(Quercetin [QN] 80 mg/kg och lyco-pene LY] 3 mg/kg p.0.)

Grupp I: Isoproterenol (ISO; 100 mg/kg ip) Grupp IV: ISO plus QL (som i grupp Ⅲl och grupp II) Råttornas kroppsvikter registrerades dagligen fram till slutet av experimentet. På den tionde dagen avlivades alla djur genom halshuggning under anestesi med pentobarbitalnatrium (40 mg/kg). Blodprover och hjärtvävnader förbereddes snabbt för olika analyser.

5. Bedömning av organindex (hjärtvikt till kroppsvikt) hos experimentråttor Hjärtvävnadsprover tvättades med iskall kaliumklorid (KCl) och läts av med filterpapper för fullständig torrhet och vägdes. Organindex (hjärtvikt till kroppsvikt) beräknades med dessa värden.

6. Bedömning av biokemiska markörer i serum hos experimentråttor

Efter halshuggning samlades blodprover för beredning av serumprover genom centrifugering. Aktiviteter av serumhjärtmarkörenzym (CK-MB), hjärttroponin T (TROP) och laktatdehydrogenas (LDH) bestämdes med metoderna enligt Okinaka et al. [1957]. Aktiviteter av serumaspartattransaminas (AST) och alaninaminotransferas (ALT) utfördes med metoden av Reitman och Frankel [1961]. Alla analyser utfördes med användning av analyskit och enligt anvisningarna i tillverkarens protokoll. Absorbansvärden registrerades med användning av en mikroplattläsare. Totalt protein i proverna bestämdes med metoden enligt Lowry et al. [1951].

7. Bedömning av oxidativ stressmarkörer med hjälp av serum och hjärtvävnadshomogenat hos experimentråttor MDA:

Malondialdehyd-halten (MDA) analyserades för tiobarbitursyrareaktiva substanser (TBARS)-produkter i serum- och hjärtvävnadshomogenat. Beredning av hjärtvävnadshomogenat gjordes genom att homogenisera varje hjärtprov och sedan centrifugera vid låg hastighet under 3 0 minuter. För TBARS tillsattes återvunna supernatanter och serum med 0,1 ml 8,1 procent SDS, 1 ml 20 procent ättiksyra och 1 ml 8 procent TBA. Reaktionsblandningen upphettades under en timme. Efter inkubation kyldes rören och centrifugerades ytterligare under 15 minuter. Supernatanten användes för absorbansmätning vid en våglängd av 532 nm. TBARS-nivåer uttrycktes som nmol MDA per liter i serum och nmol MDA per gram i hjärtvävnad.

GSSG:

GSSG-nivån bestämdes enligt metoden beskriven av Li et al. [2012] med en modifikation. För bestämning av GSSG blandades testprovet med MPA och M2VP för ytterligare oxidation. Provblandningens absorbansvärden bestämdes vid 370 nm och uttrycktes som nmol/g vävnad.

8. Bedömning av myoglobinkoncentrationen (MYO) hos experimentråttor

För bestämning av MYO-koncentration fixerades hjärtprov först i paraformaldehyd och därefter i glutaraldehydlösning i 15 minuter. Därefter inkuberades proverna under 1 timme i Tris/80 mM KCl-buffert, O-toluidin, 90 procent etanol och 70 procent tertiär-butyl-hydroperoxid vid 50 grader. Därefter mättes absorbansen vid 436 nm och uttrycktes i ug/L.

9. Bedömning av enzymatiska antioxidanter och icke-enzymiska antioxidanter hos experimentråttor

Supernatanter av vävnadshomogenat användes för bestämning av aktiviteten hos antioxidantenzymer.

Superoxiddismutas (SOD):

SOD-värdet mättes enligt metoden av Marklund och Marklund [1974]. Principiellt bestämdes SOD-koncentrationen på dess förmåga att förhindra den superoxidförmedlade reduktionen. En enhet SOD antogs som enzymaktivitet för att hämma 50 procent av pyrogalloloxidationen. Testprovet blandades med beredd lösning och buffert. Blandningen blandades väl före inkubering vid 37 grader i 20 minuter. Absorbansen registrerades vid 450 nm och SOD-aktiviteten uttrycktes som U/mg protein.

Katalas (CAT):

Katalas (CAT) aktivitet bestämdes med metoden enligt Aebi [1983]. Testprovet inkuberades med substratet (H, O och NaCl) vid 37 grader under en minut. Den enzymatiska reaktionen stoppades vid bildning av ett gult komplex i lösningen och absorbansen mättes vid 405 nm. En enhet CAT definierades som den enzymaktivitet som är nödvändig för att sönderdela 1 uM H2O2 per min. CAT enzymaktivitet uttrycktes som μM H2O2 sönderdelad

per min per mg protein.

Glutationperoxidas (GPx):

Glutationperoxidas (GPx)-aktivitet fullbordades enligt metoden som beskrivs av Flohe och Gunzler [1984]. Supernatanten blandades med PBS, GSH, natriumazid och HO för att göra 1 ml av reaktionsblandningen. Efter inkubation i 15 minuter vid 37 grader stoppades reaktionen genom att tillsätta 5 procent TCA. Rören centrifugerades vid 1000 g under 8 minuter och den resulterande supernatanten erhölls. Absorbansen mättes vid 420 nm och GPx-aktiviteten uttrycktes som μM GSH oxiderat per minut per mg protein.

Glutation-S-transferas (GST):

Total GST-aktivitet mättes enligt metoden av Habig et al. [1974]. Testprovet blandades med 1-klor-2,4-dinitrobensen (CDNB) och behandlades med 10 nM TCDD under 24 timmar. Konjugering av CDNB mättes vid 340 nm och aktiviteten uttrycktes i nM CDNB konjugerad per minut per mg protein.

Reducerat glutation (GSH):

Nivåer av GSH analyserades med metoden enligt Aebi [1983]. Testprovet späddes med fosfat-EDTA-buffert och inkuberades vid rumstemperatur under 5 minuter. Efter konstant blandning och inkubation i 15 minuter vid rumstemperatur mättes lösningen vid 350 nm och uttrycktes som mg/dl i serum och μmol/g i vävnader.

Vitamin E och vitamin C:

Nivåer av vitamin E och vitamin C bestämdes med metoden av Quaife et al.[1949] med användning av den kolorimetriska principen. En analys baserad på minskningen av koncentrationen av tokoferoler på grund av omvandlingen av ferri till ferrojoner (röd-komplex). Testprovet tillsattes etanol och blandades kraftigt. Därefter blandades blandningen med xylen och skyddades från ljus. Efter centrifugering under 30 minuter tillsattes järn(III)kloridlösning. Efter fullständig blandning registrerades absorbansen vid 562 nm och uttrycktes som mmol per liter för båda vitaminerna.

10. Bedömning av histopatologisk skada hos experimentråttor

Hjärtvävnadssektionen nedsänktes i 10 procent buffrat formalin under två dagar och dehydrerades sedan seriellt i en serie graderad etanol. Efter ytterligare dehydrering med formalin förskansades vävnader i paraffin. Med hjälp av mikrotom skars en vävnadssektion med 5 μm tjocklek och färgades med H&E för analys med ett ljusmikroskop. Vävnadssektioner avbildades med 40X förstoring för att bedöma de histopatologiska förändringarna.

11. Kvantitativ PCR i experimentella råttor Nrf2/HO-1-genen och dess associerade genuttrycksnivåer såsom Nrf2, HO-1, BCl-2, GSTμ, SOD1, SOD2, CAT och NQO1 undersöktes med användning av RT-PCR. Totalt RNA från vävnadshomogenat extraherades med användning av TRIZOL-reagens följt av DNas-I-behandling för att avlägsna spår av DNA enligt tillverkarens manual. Renheten hos det extraherade RNA:t bestämdes med en spektrofotometer vid 260 nm och lagrades vid -70 grad tills vidare användning. Ett ug totalt RNA användes för att syntetisera cDNA med användning av ett kommersiellt cDNA-synteskit. Uttryck av alla gener utfördes med en Maxima SYBR grön qPCR master mix. Data screenades och normalisering gjordes mot GAPDH-genen. Vikningsförändringen beräknades med 2-△ACT-metoden för varje gen. Primers som används listades nedan:

12. Statistisk analys

Data presenterades som medelvärde±SD för varje grupp och beräknades med SPSS 17.0 mjukvarupaket. Signifikansnivån beräknades genom Students t-test med lämplig posthoc analys. AP Mindre än eller lika med 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.

Denna artikel är extraherad från LIBYAN JOURNAL OF MEDICINE2021, VOL. 16, 1943924https://doi.org/10.1080/19932820.2021.1943924