för mer information:ali.ma@wecistanche.com

Del: II Njur- och extranjurmanifestationer hos vuxna zebrafiskmodeller av cystinos

2.3.5. Ctns−/− Zebrafish närvarande ökad tjocklek på hornhinnan

Cystinospåverkar ögonen vilket resulterar i cystinansamling i flera vävnader, såsom regnbågshinnan, bindhinnan och retinala epitelet, men hornhinnan är den mest påverkade delen på grund av cystinackumulering [19] och uppvisar ökad tjocklek [20]. Med hjälp av H&E-färgning noterade vi att ctns-/-zebrafish visade ökad tjocklek av stromalagret i hornhinnan jämfört med vildtyp (Figur 10A, B, E) zebrafisk. Vi avslöjade dock inte uppenbara abnormiteter i retinala epitelet hos ctns-/-zebrafiskar (Figur 10C, D).

Figur 9. Genomsnittlig simhastighet hos vildtyp och ctns−/−zebrafisk. Medelhastigheten är minskad i ctns−/−zebrafisk jämfört med vildtyp hos båda könen. Den genomsnittliga simhastigheten mäts i pixel/sekund. Varje prick representerar en zebrafisk, totalt n=6 vildtyp och n=6 ctns−/−18-månader gamla zebrafiskar. Tvåvägs ANOVA med Fishers minst signifikanta skillnad (PLSD) test: ** p <>

Bild 10. Ögonhistologi hos vildtyp och ctns-/- zebrafiskar. (A, B) Representativa bilder av hornhinnan hos vildtyp (A) och ctns−/− (B) 18-månadsgamla zebrafiskar. Det stromala lagret av hornhinnan (svarta pilspetsar och svarta linjer). H&E-färgning. Skalstaplarna representerar 50 µm. (C, D) Representativa bilder av näthinnan av vildtyp (A) och ctns-/- (B) zebrafisk. H&E-färgning. Skalstaplarna representerar 50 µm. (E) Relativ kvantifiering av tjockleken på det stromala lagret av hornhinnan. Varje punkt representerar en fikation av tjockleken på hornhinnans stromaskikt. Oparat t-test med Welchs korrigering, tvåsidigt: * p <>

2.3.6. Ytterligare Ctns−/− Zebrafiskfenotyper

Förutom fenotyperna som nämns ovan utförde vi histologisk analys av hjärnan och äggstocken utan att hitta skillnader mellan -/- och vildtypszebrafiskar. Dessutom utvärderade vi kroppslängden och vikten av ctns-/- och vildtypszebrafiskar vid 18 månader sålda och vi hittade en ökad kroppsviktsinctns-/−zebrafisk medan vi hittade en ökad kroppslängd i ctns-/−zebrafiskar av båda könen jämfört med vildtyp (tillägg).

3. Diskussion

Under de senaste decennierna,cystinoshar förvandlats från en dödlig barndomssjukdom till en behandlingsbar metabolisk störning med vilken patienter kan överleva till vuxen ålder och nå hög ålder [21,22]. Längre överlevnad av patienterna avslöjade nya sjukdomsfenotyper och väckte nya frågor angående patogenesen och långtidseffekterna av terapier. I detta avseende blir studier av vuxna djurmodeller av cystinos mer och mer relevant.

I den aktuella studien undersökte vi njurarna och extrarenala manifestationer av cystinos i en vuxen zebrafiskmodell på 18 månader, vilket motsvarar den mänskliga åldern 40–50 år [23,24]. Först validerade vi att den vuxna ctns−/− zebrafiskmodellen presenterar cystinansamling i hela kroppen och olika organ. I dennjure, på histologisk nivå observerade vi tecken på PTEC-skada som återspeglades av närvaron av många hyalinliknande eosinofila droppar, cytoplasmatiska vakuoler och partiell förlust av borstkanter. Dessutom utvecklade ctns−/−zebrafiskhanen glomerulär hypertrofi. Slutligen visade vi att uttryck av klyvt kaspas 3 ökade i njur-PTEC hos ctns-/-zebrafiskar, vilket indikerar att apoptos är involverad i patogenesen av nefropatisk cystinos hos zebrafisk. Eftersomcystinospatienter uppträder också extrarenalt manifestationer, undersökte vi effekten av ctns−/− mutation i andra organ i vår zebrafiskmodell. Intressant nog fann vi att ctns−/−mutation orsakade en försämring av hudens anatomi och påverkar fertilitet, rörelseaktivitet och ögon.

Lysosomer är platserna för intracellulär matsmältning och anses vara de vitala koordinatorerna för cellmetabolism [25]. Att vara en lysosomal lagringssjukdom är nyckeln tillcystinosär lysosomal cystinackumulering [26,27]. Intressant nog hittade vi en 54-faldig ökning av cystin i hela kroppen av18-månadens cystinosiszebrafisk jämfört med vildtyp, medan, i vår tidigare studie [10], cystinoszebrafisklarver sex dagar efter befruktning visade en 13-faldig ökning. Sammantaget tyder dessa data på att cystin ackumuleras under livet i cystinoszebrafisk. Vätskekromatografi och masspektrometrianalys har bekräftat att bland alla organ,njuresare den föredragna platsen för cystinackumulering. Lysosomal svullnad och hyalinliknande eosinofila droppar inuti lysosomerna har rapporterats i cystinbelastad PTEC [28,29] och i humana biopsier uppträder cystinkristaller som polymorfa formutrymmen inom de interstitiella makrofagerna och PTEC-cytoplasman [27]. I mänsklig vävnad är ackumulering och kristallisering av cystin en kumulativ process som sker under livet. Inline upptäcktes inte cystinkristaller i ctns−/−zebrafiskarna i larvstadiet [10], medan vi i våra pilotexperiment fann att den polymorfa formen av cystinkristaller uppträder vid 3 och 6 månaders ålder och är tydligt synliga vid en ålder av 18-månader, vilket tyder på en progressiv försämring av effekterna av cystinos injure.

Klicka tillCistanche-effekter för njursjukdom

För att bedöma de histologiska förändringarna av glomeruli, mätte vi ytareorna på Bowmans kapsel, den glomerulära tofsen och Bowmans utrymme för ctns-/-zebrafish på PAS-färgade sektioner. Vi fann att ctns−/−zebrafish utvecklade glomerulär hypertrofi, vilket tyder på hyperfiltrering. De lindriga glomerulära skadorna som observerats -/-zebrafiskarna kan tillskrivas zebrafiskarnas regenerativa förmåganjure, att kunna lägga till nya nefroner, samt reparera befintliga nefroner [30].

Utöver den histologiska skadan har cystinackumulering visat sig aktivera proteinkinasKriggering av apoptos i PTEC[12]. Sålunda utvärderade vi det klyvda kaspas-3-uttrycket i PTEC och vi fann att ctns−/−zebrafish presenterade ökat kaspas-3 och nukleär fragmentering. Närvaron av kluvet kaspas-3 hittades huvudsakligen i celler som ackumulerade de cytoplasmatiska vakuolerna, vilket tyder på att apoptos äger rum i den skadade PTEC. En ytterligare mekanism som kan förklara den ökade apoptosen kan vara närvaron av reaktiva syrearter på grund av minskat glutation i samband med cystinackumulering [31]. Ytterligare studier är dock nödvändiga för att utvärdera om denna mekanism förekommer även hos ctns-/-zebrafisk.

Fastännjurarär de första och mest allvarligt drabbade organen,cystinosär en multisystemisk sjukdom där olika organ, såsom hud, könskörtlar, ögon och muskler är inblandade. Från litteraturen är det känt att patienter med cystinos ofta uppvisar för tidigt åldrande av huden, blont hår och ljus hudfärg [13]. Den senare fenotypen beror på inblandningen av cystinosintransporter i regleringen av melaninsyntesen[32]och i upprätthållandet av mörkare pigmentering genom den nyupptäckta cysteintransportören MFSD12 [33]. Spännande nog presenterade vår vuxna ctns-/-zebrafiskmodell ett hypopigmenterat och fläckigt hudmönster och visade en försämrad melaninfördelning som inte observerades i larvstadiet [10].

För övrigt,cystinosorsakar infertilitet hos män, medan kvinnor är kända för att vara fertila [14]. Nya data tyder på att infertilitet kan bero på progressiv testikeldegeneration, vilket leder till förändrad spermakvalitet, eller på en obstruktion i en odefinierad del av det manliga utsöndringssystemet. De blockerade strukturerna kan påverka spermans kvalitet, särskilt i de områden där kanalerna har en mycket liten diameter, till exempel retetestis[16]. Inzebrafisk, spermierna till genisk process liknar mycket däggdjur; en av de största skillnaderna är dock att spermatogenes sker i cystor [34]. I vår studie fann vi ökade spermier i den spermatogena cystan hos ctns-/-zebrafiskar, men vi hittade inga tecken på testikeldegeneration. Därför kan den beskrivna fenotypen tyda på en obstruktion på testikelnivåer som leder till mindre frisättning av spermier i miljön, men ytterligare studier är nödvändiga för att bekräfta denna hypotes. På funktionsnivå tycks det minskade äggantalet och minskade befruktade äggen reflektera en försämring av fertiliteten hos ctns−/−zebrafisk.

En annan klinisk manifestation avcystinos, som vanligtvis drabbar patienter från och med livets andra decennium, är myopati, kännetecknad av muskelförtvining och svaghet [1]. Intressant nog fann vi att ctns-/-vuxna zebrafiskar uppvisar minskad rörelseaktivitet jämfört med kontroll, vilket tyder på nedsatt muskelfunktion. Notera att denna fenotyp inte var närvarande i larver [10], vilket tyder på att den påverkar ctns-/-zebrafiskar under det senare skedet av sjukdomen. Trots detta upptäcktes inga synliga histologiska skillnader i musklerna. Den minskade rörelseaktiviteten kan bero på mitokondriell dysfunktion som inte kunde detekteras av rutinmässiga histologiska studier [35-37]. Därför behöver en omfattande karakterisering av mitokondrier i cystinoszebrafiskar ytterligare utvärdering.

Utöver de ovan nämnda fenotyperna har flera studier visat att patienter med cystinos också uppvisar ögonsymtom som fotofobi och blefarospasm [1], där hornhinnan är en av de mest drabbade delarna av ögat vilket resulterar i ackumulering av cystinkristaller och ökad tjocklek [20]. Lite är dock känt om orsakerna till den ökade tjockleken av hornhinnan. Till exempel föreslogs det att den beskrivna fenotypen beror på en subklinisk dysfunktion av epitel- och/eller endotelceller som leder till stromalödem[20]. I vår studie fann vi att ctns−/−vuxna zebrafiskar ökade är tjockleken på hornhinnans stromala skikt, vilket indikerar att vår modell visar tecken på hornhinnedysfunktion icystinos.

Cistanche förnjurefungera

En av de viktigaste luckorna att fylla för en heltäckande förståelse avcystinosär avsaknaden av en djurmodell som fullständigt rekapitulerar den mänskliga sjukdomen. Flera musmodeller har utvecklats, som visar cystinackumulering men misslyckas med att reproducera helanjur-fenotyp [8,26]. Specifikt visade C57BL/6-musen cystinansamling i flera organ, som ökar med åldern [8]. Dessutom visar musmodellen C57BL/6 proximala tubulära lesioner från 6 månaders ålder. På liknande sätt, i vår modell, förvärras proximala tubulära lesioner med tiden. Men på glomerulär nivå presenterade musmodellen C57BL/6 en normal fenotyp, medan vår modell för vuxna zebrafisk visar glomerulär hypertrofi. Dessutom misslyckas C57BL/6-musmodellen med att efterlikna den försämrade fertiliteten som observerats hos människor, medan ctns−/−zebrafiskmodellen presenterar spermatogena cystor berikade med spermier och minskad äggproduktion. På okulär nivå uppvisar både mus[38] och sebrafiskmodeller sokulära abnormiteter. Tvärtom, på hudnivå visar denna musmodell inte en försämrad melatoninproduktion [8], vilket uppträder i den vuxna zebrafiskmodellen som ett hypopigmenterat hudmönster. Slutligen, på beteendenivån, uppvisar vår ctns−/− zebrafiskmodell en minskad rörelseaktivitet, vilket kan bero på en försämrad mitokondriell funktion eller den kan orsakas av en sekundär effekt av den ökade vikten icystinoszebrafisk. Sammantaget verkar det som om vår ctns−/− zebrafiskmodell bättre rekapitulerar den mänskliga sjukdomen. Nyligen har Shimizu et al. etablerade en ny medfödd Ctnsugl-mutation i en råttstam som presenteradesnjur-lesioner och cystinkristaller i lysosomer avnjurecortex [7]. En mer detaljerad karaktärisering av modellen saknas dock fortfarande. Därför finns det ett akut behov av att utveckla och karakterisera nya funktionella modeller som rekapitulerar mänskliga sjukdomar.

Sammanfattningsvis visade vi att vår vuxen ctns−/− zebrafishmodell reproducerar flera mänskliga fenotyper av cystinsandlåda kan vara användbar för att studera sjukdomens patogenes hos vuxna och för att testa långtidseffekter av nya läkemedel för att korrigera njur- och extra-njur-manifestationer.

4. Material och metoder

4.1. Underhåll och uppfödning av zebrafish

Zebrafish hanterades och underhålls i enlighet med KU Leuvens djurskyddsbestämmelser (Etisk godkännande nr.142/2019). För denna studie inkluderade vi ctns-/-zebrafisk vid 18 månaders ålder och vildtypskontrollzebrafisk i båda könen. Detaljerna för att generera ctns-/-zebrafiskarna beskrevs i vår tidigare studie [10].

4.2. Cystinmätning

Cystinnivåer mättes i zebrafisk(vildtyphanefisk,n=3ochctns−/−hanfisk, n=3) och mängden uttrycktes som nmol/mg proteiner. Först avlivades zebrafiskar med nedsänkning i trikainmetansulfonat MS-222 (300 mg/L), därefter sonikerades vävnadsprover i närvaro av 200 µL 5 mM N-etylmaleimid (NEM, St. Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich E3876) i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS), för maximalt 200 mg vävnad för varje lysat. Därefter tillsattes 100 µL 12 procent sulfosalicylsyra (SSA) till varje homogenat och proverna centrifugerades vid 12,000 g i 10 minuter, 4◦C. Supernatanter innehållande cystin förvarades vid -80◦C fram till analystillfället, medan pellets löstes över natten vid 4◦C i 300 µL 0,1 M NaOH och hölls vid -80◦C tills proteinet mäts med Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit. Därefter normaliserades mängden (nmol) cystin till mängden (mg) protein från varje prov. Därefter spetsades 50 µL av den överstående vätskan som innehöll cystin med 50 µL av den interna standardlösningen (Cystine d6) och vortexades i 5 s; sedan extraherades blandningen med 200 µL acetonitril, vortexbehandlades i 30 s och centrifugerades sedan vid 16, 000 g under 9 min. Vätskekromatografi och masspektrometrianalys utfördes av en UHPLCAgilent1290InfinityII6470(Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) utrustad med en ESI-JET-STREAM-källa som arbetar i läget för positiv jon (ESI plus ). Mjukvaran som användes för att styra denna utrustning och analysera data var MassHunter (Arbetsstation Agilent Technologies, Barcelona, ​​Spanien). Separationskolonnen som användes var InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100×2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Hematoxylin och Eosin och Periodic Acid-Shiff-färgning

Zebrafisk (vildtypshonfisk, n=3; vildtyphanefisk, n=3; ctns−/−honafisk, n=3; ctns−/−hanefisk, n=3) avlivades med nedsänkning i trikainmetansulfonat MS-222 (300 mg/L), efteråt fixerades hela zebrafisken i 4 procent buffrad paraformaldehyd (4 procent PFA) vid 4 ◦C under 1 vecka . Efter att ha tvättats med PBS två gånger överfördes zebrafiskarna till EDTA-lösning (100 mM, pH=8) för avkalkning i ytterligare 1 vecka, följt av inbäddning i paraffin. Paraffininbäddad zebrafiskvävnad skars (4- µmtjocklek) på en Leicamikrotom (LeicaBiosystems, Wetzlar, Tyskland). Sektioner färgades med H&E och PAS enligt standardprotokollen.

Forhistologiska studier av zebrafiskögon (vildtypshonfisk, n=3ochctns-/-honfisk, n=3), ögonkärnades och fixerades i 4 procent PFA vid rumstemperatur i 4 timmar. Följande inbäddning i medium för optimal skärtemperatur (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japan), 10-µm kryosnitt gjordes (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokyo, Japan). Sektioner färgades med H&E enligt standardprotokollen. Bilder togs med ett Leica ljusfältsmikroskop (Leica DM6, Wetzlar, Tyskland).

4.4. Immunhistokemi (färgning av kluven kaspas-3)

Sektioner med nyskuren zebrafiskvävnad avparafiniserades och rehydrerades. Sektioner utsattes för värmeinducerad antigenåtervinning med användning av 10 mM citratbuffert (pH=6). Efter blockering med 5 procent normalt getserum (NGS) i dPBS, inkuberades sektionerna med anti-klyvd kaspas-3 från kanin (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, 1:200 spädning) följt av en anti-kanin -Envision, HRP-märkt sekundär antikropp (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Som en negativ kontroll användes ett normalt kaninserum. Diaminobensidin (DAB, DAKO, Glostrup, Danmark) användes som kromogen. Därefter motfärgades sektioner med H&E, dehydrerades och monterades.

Behandling av njursjukdom: Cistanche

4.5. Toluidinblå färgning och TEM

Zebrafisknjur-vävnader (vildtypszebrafiskhanar, n=3 och ctns−/−zebrafishhanar, n=3) skördades och fixerades i EM-fixeringsbufferten (1,5 procent glutaraldehyd/1 procent paraformaldehyd) i 24 timmar . Därefter efterfixerades njurvävnaderna med 2,5 procent glutaraldehyd/1,2 procent akrolein i fixeringsbuffert (0,1 mol/L kakodylater, 0,1 mol/L sackaros, pH 7,4) och 1 procent osmiumtetroxid, och inbäddad i harts. Halvtunna sektioner (0.5- µm tjocklek) färgades med toluidinblått. De ultratunna sektionerna färgades med uranylacetat. Bilderna samlades in med en JEM-1200 EX transmissionselektronmikroskopi (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) med olika förstoringar.

4.6. Digital bildanalys

Färgade objektglas digitaliserades med en Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Nederländerna)

4.6.1. Glomerulär hypertrofianalys

För att analysera glomerulär hypertrofi hos zebrafisk mättes ytareorna (µm2) av Bowmans kapsel, Bowmans utrymme och glomerulär tofs på PAS-färgade objektglas. Alla tillgängliga glomeruli per sektion inkluderades och mättes med hjälp av ImageJ-mjukvara. Genomsnittet av mätningarna från varje zebrafisk användes för statistisk analys.

4.6.2. Klyvd kaspas-3 uttrycksanalys

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 procent positiv färgning). Medelvärdet av poängen från varje zebrafisk användes för statistisk analys.

4.6.3. Tjocklek av hornhinnestromaanalys

Tjockleken på hornhinnans stroma hos zebrafisk (10× förstoring) mättes på samma avstånd från mitten av ögat med hjälp av programvaran ImageJ på zebrafisk. För varje bild togs n=7 mätningar på olika ställen i ögonsektionen (mitten, mitten, periferin) längs hornhinnan med intervaller på 100 µM. Genomsnittet av mätningarna användes för statistisk analys.

4.7. Fertilitetsstudie

Fertiliteten utvärderades genom att para hona och hane av zebrafisk (vildtypshane, n=4 och vildtyp hona, n=6 och ctns−/−hanefisk, n=4 och ctns−/−honfisk, n=6) i en lekbricka. Nästa morgon, en timme efter ljuset, samlades embryon in och det totala antalet producerade ägg registrerades. Befruktade ägg screenades och räknades från de ofruktbara äggen med hjälp av ljusmikroskopi. Uppfödningen utfördes n=7 gånger en gång i veckan i rad. Två experiment som resulterade i inga äggproduktioner samtidigt i både vildtyp och ctns-/-zebrafisk exkluderades.

4.8. Lokomotorisk aktivitet

Zebrafisk (vildtypshonfisk, n=6; vildtyphanefisk, n=6; ctns−/−honafisk, n=6; ctns−/−hanefisk, n=6) placerades i de vanliga bostäderna och efter en anpassningstid på 5 min, filmades de i 5 min. Videoinspelning utfördes med en GoPro® HERO 7 placerad ovanpå tanken, vilket ger en toppvy av fisken som simmar. Upplösning och bildhastighet sattes till 1080 p (1920×1080) respektive 30 fps. Videor analyserades med hjälp av Tracker.a spårar banorna för individuella zebrafiskar under hela experimentet. Banorna analyserades därefter med anpassad pythonkod för att härleda den genomsnittliga rörelsehastigheten (pixel/sek) i varje grupp [39].

Cistanche-njure

4.9. Kroppsvikt och längdmått

Zebrafiskar avlivades med nedsänkning i 300 mg/Loftricainemetansulfonat MS-222. Efter verifiering av frånvaron av respons på yttre stimuli placerades den avlivade zebrafiskarna på en pappersservett och torkades. Längden på den avlivade zebrafiskarna utvärderades med hjälp av ett skjutmått, som mättes från munspetsen till stjärtspetsen. Vikten av den avlivade zebrafiskarna utvärderades med en analytisk våg.

4.10. Statistisk analys

Statistisk analys utfördes med SPSS (IBM, New York, NY, USA) och GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Dataav två grupper analyserades med hjälp av oparat t-test med Welchs korrigering, tvåsidigt. Data från två kategoriska oberoende variabler analyserades med tvåvägs ANOVA med Fishers minst signifikanta skillnad (PLSD) test. Skillnader med p < 0.05="" ansågs="" vara="" statistiskt="">

4.11. Fertilitetsstudie

För jämförelsen av äggproduktionshastigheterna mellan vildtyp och ctns-/-zebrafisk, utfördes en Poisson-regressionsanalys med hjälp av generaliserade skattningsekvationer med robusta standardfel för att ta hänsyn till korrelationen av hastigheter med experiment. För jämförelsen av oddserbjudandet använde ägg mellan vildtyp och ctns-/-zebrafiskAlogistisk regressionsanalys med hjälp av generaliserade skattningsekvationer med robusta standardfel för att ta hänsyn till korrelationen mellan oddsen inom experiment.

Tilläggsmaterial: Följande är tillgängligt online på https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1.

Författarbidrag: Conceptualization, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodik, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; mjukvara SPB, JH, LDG, HT, TN; validering, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB och EL; formell analys, SPB, JH, LDG, HT, TN; utredning, LvdH, HJB, EL; resurser, HJB och EL; datakurering, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; skrift—original utkast förberedelse SPB, JH; skrivande—granskning och redigering, LvdH, HJB, EL; visualisering, LvdH, HJB, EL; övervakning, PdW, LvdH, HJB, EL; projektadministration, LvdH, HJB, EL; finansieringsförvärv, HJB, EL Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering: Författarna skulle vilja erkänna den interna fonden från KULeuven C1 GranttoE.L. (C14/17/113), China Scholarship Council Grant till JH (CSC n◦ 201508500109) och FWO:s postdoktorala stipendium till LDG (12I3820N).

Utlåtande av institutionell granskningsnämnd: Studien genomfördes i enlighet med riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen och godkänd av KU Leuvens etiska kommitté n.142/2019. Tack: Vi vill tacka: Didier Cagnini för utvärderingen av hjärnans histologi i både ctns-/−och vildtypszebrafish, Kathleeen Lambaerts, FrédéricHendrickx och KimvanKelst för deras ständiga stöd och assistans i KU Leuvens vattenanläggning för Peter Neeskens tekniska stöd. från TEM och Ron Wolterbeek för statistisk analys.

Intressekonflikter: Författarna förklarar inte intressekonflikter. Finansiärerna hade inte varit med om studiens design; vid insamling, analyser eller tolkning av data; i författandet av manuskriptet, eller i beslutet att publicera resultatet.

Referenser

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinosis: En recension. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; et al. Heptaheliskt protein PQLC2 är en lysosomal katjonisk aminosyraexportör som ligger till grund för verkan av cysteamin icystinosterapi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Förbättring av prognosen för nefropatisk cystinos. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; gäst, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; et al. Cysteaminbehandling fördröjer utvecklingen av nefropatisk cystinos hos sena ungdomar och vuxna. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Cysteaminterapi: En behandling för cystinos, inte ett botemedel. Kidney Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Princiero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E. MolecularBasisofCystinosis: Geographic Distribution,Functional ConsequencesofMutationsintheCTNSGene, and Potential for Repair. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. En deletion i Ctns-genen orsakar renal tubulär dysfunktion och cystinackumulering hos LEA/Tohm-råttor. Mamma. Genom 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. Renal fenotyp avcystinosmusmodellen är beroende av genetisk bakgrund. Nephrol. Ringa. Transplantation 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtchenko, EN GenetiskNjurSjukdomar: Zebrafiskmodellernas framväxande roll. Cells 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Cystinos(ctns)zebrafishmutant visar pronefriglomerulär och tubulär dysfunktion. Sci. Rep. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco, MA; Najafian, B.; Alpers, CE; Fogo, ABAJKDAtlas of RenalPathology:Cystinos. Am. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Ökad apoptos i cystinotiska fibroblaster ochnjur-proximala tubuli epitelceller resulterar från cysteinylering av proteinkinas C delta. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; et al. Förbättrat intrinsiskt hudåldrande vid nefropatisk cystinos bedömd med högupplöst optisk koherenstomografi. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Fertilitetsstatus hos manliga cystinospatienter som behandlas med cysteamin. Fertil. Steril. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN Första framgångsrika befruktningen inducerad av en manlig cystinospatient. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Testikelfunktion hos män med infantil nefropatisk cystinos. Brum. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Graviditet hos kvinnor med cystinos. Clin. Kidney J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Idiopatisk intrakraniell hypertoni vid cystinos. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Christopher, K.; Chauhan, A. Potentiell roll för stromalt kollagen i cystinkristallisering hos cystinospatienter. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Korneal tjocklek vid nefropatisk cystinos. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665-668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Cystinos: Utvecklingen av en behandlingsbar sjukdom. Pediatr. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Effekter av långvarig cysteaminbehandling hos patienter medcystinos. Pediatr. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) som modell för studiet av åldrande och träning: Fysisk förmåga och träningsförmåga minskar med åldern. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Livslängder och åldrande fenotyper i två stammar av zebrafisk (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Lysosombiogenes och lysosomala membranproteiner: Trafficking möter funktion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; et al. Intralysosomal cystinackumulering hos möss som saknar cystinos, proteinet som är defekt vid cystinos. Mol. Cell. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Dedifferentiering och avvikelser i det endolysosomala utrymmet karakteriserar det tidiga skedet av nefropatisk cystinos. Brum. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Vissa hjälpmedel för histologisk igenkänning av hyalin droppnefropati i nittio dagar långa toxicitetsstudier. Toxicol. Patol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarcan, A.; Timmons, C.; Baum, M. Intracellulär distribution av cystin i cystinladdade proximala tubuli. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Använda zebrafisk för att studera podocytgenes under njurutveckling och regenerering. Genesis. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Lysosomal cystinackumulering främjar mitokondriell depolarisering och induktion av redoxkänsliga gener i proximala tubulära celler i mänsklig njure. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Chat, P.; et al. Cystinosin är ett melanosomalt protein som reglerar melaninsyntesen. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12förmedlar importen av cystein till melanosomer och lysosomer. Naturen 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Histologisk och stereologisk utvärdering av zebrafisk (Danio rerio) spermatogenes med tonvikt på spermatogonial generationer. Biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Onormal mitokondriell autofagi i nefropatiskcystinos. Autophagy 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Effekten av atypisk mitokondriell cyklisk-AMP-nivå vid nefropatisk cystinos. Cell. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. Mitokondriell dynamik av proximala tubulära epitelceller i nefropatisk cystinos. Int. J.Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; et al. Okulära anomalier i en cystinosdjurmodell härmar sjukdomspatogenes. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Spårar alla individer i små eller stora kollektiv av omärkta djur. Nat. Metoder 2019, 16, 179–182. [CrossRef]