Abstrakt

Depression representerar en mycket utbredd och handikappande psykiatrisk störning globalt. Växande bevis tyder på att överdriven neuroinflammatorisk aktivering inom hippocampus bidrar väsentligt till uppkomsten och progressionen av depressiva symtom. Cistanche fenyletanolglykosider (CPhGs), viktiga bioaktiva beståndsdelar extraherade från traditionella ätbara medicinska örterCistanche deserticolaochCistanche tubulosa, har visat flera neuroprotektiva farmakologiska egenskaper i tidigare studier. Denna nuvarande undersökning syftade till att utforska de terapeutiska effekterna och molekylära mekanismerna som utövas av CPhG på depressionsliknande beteendefenotyper utlösta av kronisk oförutsägbar mild stress (CUMS) hos C57BL/6-möss.

Sextio SPF-grade C57BL/6-möss separerades slumpmässigt i sex experimentella kohorter: kontrollgrupp, CUMS-modellgrupp, högdosgrupp med CPhGs (700 mg/kg), medeldosgrupp med CPhGs (350 mg/kg), lågdosgrupp med CPh5/kg och positiv grupp med CPh5 mg/kg och 17 mg/kg. (15 mg/kg). Efter fyra veckors läkemedelssondebehandling efter CUMS-modellering, implementerades omfattande neurobeteendebedömningar inklusive sackarospreferenstest (SPT), öppet fälttest (OFT), svansupphängningstest (TST) och forcerat simtest (FST). Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kit kvantifierade serummonoamin neurotransmittorkoncentrationer, tillsammans med hippocampus pro-inflammatoriska cytokiner och inflammatoriska mediatorer. Hematoxylin-eosin (HE) färgning och Nissl färgning visualiserade neuronala patologiska skador inuti hippocampus dentate gyrus regioner. Immunhistokemi upptäckte uttrycksintensiteten för gliafibrillärt surt protein (GFAP), joniserad kalciumbindande adaptermolekyl-1 (Iba-1), NLRP3 och Caspase-1-proteiner. Immunfluorescensfärgning utvärderade ytterligare aktiveringsstatus för uppströms TLR4/NF‑κB-signaleringskaskad.

Våra experimentella resultat visade att oral CPhG-administration anmärkningsvärt mildrade depressionsrelaterade beteendeavvikelser. CPhGs ökade sackarospreferensprocenten och minskade orörlighetsvaraktigheten i förtvivlanbaserade beteendeparadigm. Dessutom återställde CPhGs-behandlingen utarmat serum och hippocampus serotonin (5-HT) såväl som dopamin (DA) nivåer. Biokemisk detektion avslöjade signifikant undertryckande av hippocampus pro-inflammatoriska mediatorer och överproduktion av cytokiner. Histopatologiska observationer illustrerade dosberoende lindring av CUMS-provocerad hippocampus neuronal skada. Immunhistokemiska resultat visade att CPhG ökade astrocytdensiteten markerad av GFAP, hämmade patologisk hyperaktivering av Iba-1-positiva mikroglia och nedreglerade NLRP3-inflammasomrelaterat proteinöverflöd. Immunofluorescensanalyser validerade att CPhGs begränsade överdriven TLR4 och fosforylerad NF-κB p65-aktivering i hippocampus vävnad.

Sammantaget bekräftar dessa fynd att CPhG utövar en framträdande antidepressiv effekt mot CUMS-stimulerade depressionsliknande manifestationer hos möss. Dess farmakologiska mekanism förmedlas delvis genom dubbla regulatoriska funktioner: återställande av monoamin-neurotransmittorhomeostas och begränsning av neuroinflammatoriska svar medierade av TLR4/NF-κB/NLRP3-signalaxeln. Denna djurstudie tillhandahåller preklinisk experimentell grund som stödjer ytterligare utnyttjande av CPhG som lovande naturliga kandidatmedel eller funktionella livsmedelsingredienser för depression-adjuvant intervention.

Nyckelord: Cistanche fenyletanolglykosider (CPhGs); depression; kronisk oförutsägbar mild stress; neuroinflammation; astrocyter; mikroglia; TLR4/NF‑κB/NLRP3 inflammasomväg

1. Introduktion

Depression är en mångfacetterad affektiv psykiatrisk sjukdom som kännetecknas av centrala kliniska manifestationer som består av ihållande lågt humör, anhedoni, psykomotorisk retardation, sömn-vaknande störningar och somatisk dysfunktion. Svåra depressiva episoder kan leda till självskada och självmordstankar, vilket medför enorma bördor för folkhälsan över hela världen. Epidemiologiska undersökningsdata från Kina rapporterade att nationell depressionsprevalens nådde 2,1 %, och Världshälsoorganisationen har klassificerat allvarlig depressiv sjukdom bland topprankade sjukdomar som bidrar till globala funktionsnedsättningsjusterade levnadsårförluster.

Ändå förblir den fullständiga molekylära etiologin bakom depressionspatogenesen ofullständigt klarlagd, vilket hindrar perfekta kliniska terapeutiska lösningar. Samtida patofysiologiska hypoteser har flyttat fokus mot neuroimmuna överhörningsmekanismer. Ackumulerande preklinisk och klinisk forskning framhäver ihållande neuroinflammation som en viktig patogen drivkraft för depressiva sjukdomar. Under kroniska psykologiska eller fysiologiska stressutmaningar genomgår hippocampus gliacellpopulationer onormal aktivering. Överaktiverade mikroglia och dysfunktionella astrocyter utlöser robust frisättning av flera pro-inflammatoriska mediatorer, vilket skapar pro-inflammatoriska cytokinkaskadförstärkningseffekter. Sådana neuroinflammatoriska förolämpningar inducerar ytterligare neuronal morfologisk försämring, metabolisk störning av neurotransmittorer och försämring av synaptisk plasticitet, vilket i slutändan underlättar depressionsliknande patologisk progression.

Nuvarande vanliga kliniska antidepressiva interventioner förlitar sig huvudsakligen på syntetiska kemiska antidepressiva medel representerade av fluoxetin, en selektiv serotoninåterupptagshämmare (SSRI). Trots partiell symtomlindring för vissa patienter har syntetiska antidepressiva välkända nackdelar: otillfredsställande totala remissionsförhållanden, frekventa kvarvarande depressiva symtom, hög sannolikhet för återfall efter utsättning av medicinering, plus ogynnsamma gastrointestinala, lever- och metabola biverkningar under långvarig administrering. I motsats till detta har traditionella växtbaserade läkemedel multi-target-modulerande egenskaper och relativt milda säkerhetsprofiler, vilket drar till sig ett växande forskningsintresse för adjuvant terapi för humörstörningar.

Cistanche deserticolaochCistanche tubulosa, vanligen kallad "ökenginseng", tillhör familjen Orobanchaceae. Deras köttiga stjälkar fungerar som klassiska homologa medicinska livsmedelsråvaror i traditionell asiatisk örtpraxis. Moderna farmakologiska undersökningar dokumenterar flera neuroprotektiva bioaktiviteter förCistancheextrakt, inklusive anti-neurodegenerationseffekter mot Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom. Fenyletanolglykosider utgör huvudsakliga bioaktiva fraktioner inutiCistancheextrakt, huvudsakligen innehållande echinakosid och verbaskosid. Cistanche-fenyletanolglykosider (CPhG) uppvisar antitumör-, antioxidant-, immunmodulerande och neuroskyddande bioaktiviteter över flera experimentella plattformar.

Tidigare preliminärt laboratoriearbete har visat att CPhG kan höja striatala dopaminkoncentrationer och lindra klimakteriet-associerade depressiva-liknande fenotyper i gnagarmodeller. Huruvida CPhG producerar skyddande influenser på kronisk stressutlöst depression och detaljerade signaltransduktionskaskader som förmedlar sådana bioaktiviteter saknar fortfarande systematisk utforskning. Djurparadigmet för kronisk oförutsägbar mild stress (CUMS) står som en väletablerad preklinisk depressionsmodell. Genom att utsätta laboratoriegnagare för diversifierade slumpmässiga milda stressfaktorer under på varandra följande veckor, rekapitulerar CUMS på ett tillförlitligt sätt centrala depressiva kännetecken som anhedoni, beteendeförtvivlan och hippocampus neuropatologisk skada.

Följaktligen konstruerade denna forskning en CUMS-inducerad depressiv musmodell för att systematiskt bedöma in vivo antidepressiva-liknande styrka av tre gradientdoser av CPhG. Vi fokuserade särskilt på monoamin-neurotransmittoråtervinning, hippocampus gliacells fenotypisk transformation och den TLR4/NF-κB-styrda NLRP3-inflammasom neuroinflammatoriska vägen. Denna studie avser att tillhandahålla objektiva experimentella bevis för att stödja framtida läkemedelsutveckling och funktionell livsmedelstillämpning av CPhG som är inriktad på förbättring av depressiva symtom.

2. Material och metoder

2.1 Experimentella material, reagenser och instrument

Standardiserat CPhGs råextrakt förvärvades från Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (batch nr. 20231221, Xinjiang, Kina). Totalt innehåll av fenyletanolglykosid Större än eller lika med 85 %, innehållande echinakosid Större än eller lika med 40 % och verbascoside Större än eller lika med 16 %. Fluoxetinhydrokloridkapslar erhölls från Patheon France. Kommersiella ELISA-analyssatser för 5‑HT, DA, iNOS, COX‑2, PGE2, TNF‑ , IL‑1 , IL‑18, IL‑6, IFN‑ kom från kvalificerade biologiska reagensleverantörer. Primära antikroppar som applicerades för immunhistokemi och immunfluorescens inkluderade anti-GFAP, anti-Iba-1, anti-NLRP3, anti-Caspase-1, anti-TLR4 och anti-phospho-NF-κB p65 antikroppar. Histologiska färgningssatser för HE- och Nissl-färgning förbereddes för paraffin-hjärnsektionsbearbetning.

Viktiga laboratorieanalysinstrument täckte elektronisk analytisk balans med hög precision, Milli-Q arbetsstation för ultrarent vattenrening, SpectraMax multi-mode mikroplattläsare, Leica upprättstående fluorescensmikroskop, plus komplett hårdvara för beteendeanalys för gnagare och SMART 3.0 mjukvarusystem för rörelsespårning.

Sextio hanmöss av SPF-grade C57BL/6, sju veckor gamla med en initial kroppsvikt på 18–22 g, köptes från Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Alla experimentella manipulationer av mus erhölls formellt etiskt godkännande av Shalian Ethics Committee of Chinese Medical Ethics Committee (ID:s kinesiska medicintekniska kommitté). SUCMDL20231015003). Möss inhystes i anläggningar för djuruppfödningar som är fria från specifika patogener. Miljöparametrarna hölls vid omgivningstemperatur (21 ± 2) grader, relativ luftfuktighet 60 % ± 10 %, med standard 12-timmars ljus-mörk belysningscykler. Gnagarmat och dricksvatten var tillgängligt ad libitum. En veckas adaptiv acklimatiseringsperiod utfördes innan formella experimentella arbetsflöden påbörjades.

2.2 Djurgruppering, CUMS-modellering och läkemedelsadministration

Efter en veckas adaptiv uppfödning uteslöt preliminär screening av sackarospreferens enskilda möss med inneboende preferenser för lågt socker. Kvalificerade experimentmöss randomiserades till sex studiegrupper (n = 10 djur i varje grupp):

Kontrollgrupp (Con): ingen CUMS-stress, intragastrisk administrering av isovolumetriskt avjoniserat vatten;

CUMS-modellgrupp (Mod): tar emot full CUMS-stimulering, sondmatning med avjoniserat vatten av samma volym;

Högdosgrupp CPhGs (CPhGs-H): CUMS-exponering, CPhGs 700 mg/kg kroppsvikt vid daglig sondmatning;

Medeldosgrupp för CPhGs (CPhGs-M): CUMS-exponering, CPhGs 350 mg/kg genom daglig sondmatning;

Lågdosgrupp för CPhGs (CPhGs-L): CUMS-exponering, CPhGs 175 mg/kg vid daglig sondmatning;

Fluoxetin positiv kontrollgrupp (FLX): CUMS exponering, fluoxetin 15 mg/kg sondmatning en gång per dag.

För CUMS-modellkonstruktion användes tio olika typer av milda påfrestningar: fysisk fasthållning (60 min), horisontell skakrörelse (60 min), svansupphängning (60 min), bur lutad 45 graders vinkel (24 timmar), fuktig bäddmiljö (24 timmar), isolering av tom bur (24 timmar), belysning över natten vid varmt vatten (12 grader) 5 min, kallvattensim vid 4 grader i 5 min, och svansklämma-stimulering som varar i 2 min. Två distinkta stressfaktorer applicerades slumpmässigt varje dag; identisk stressfaktor skulle inte uppträda i följd under två angränsande dagar. CUMS-modelleringsproceduren pågick i fyra veckor.

Efter fyra veckors stressmodellering tillfördes motsvarande testsubstanser eller lösningsmedelsvehikel intragastriskt en gång dagligen under ytterligare fyra sammanhängande veckor. Vid den åttonde experimentveckan implementerades alla neurobeteendedetekteringsprojekt sekventiellt.

2.3 Neurobeteendetestbatteri

2.3.1 Sackarospreferenstest (SPT)

Sackarospreferenstest utvärderar anhedoniliknande kärndepressiv fenotyp hos gnagare. Före den formella mätningen inhystes varje mus individuellt. En tredagars anpassningsfas för sackarosdryck utfördes. Dag ett: två flaskor med 1 % sackaroslösning placerade i varje bur under 24 timmar. Dag två: en flaska med sackaroslösning tillsammans med en flaska med renat vatten. Dag-tre: byt läge för socker-vatten- och rentvattenbehållare för att eliminera påverkan på lokalisering. Efter anpassningscykeln fastade mössen från mat och vatten i 24 timmar. Därefter tillhandahölls en förvägd vattenflaska med 1 % sackaros och en flaska med renat vatten. Flaskpositioner byttes efter 12 timmar. Efter totalt 24 timmars testtid registrerades den återstående vätskevikten för båda flaskorna exakt. Sackaros-preferensgrad (%)=(förbrukning av sackaroslösning)/(förbrukning av sackaroslösning + förbrukning av renat vatten) × 100 %.

2.3.2 Öppet fälttest (OFT)

Öppen fältapparat bildade en 50 cm × 50 cm × 50 cm öppen kubisk låda. Central kvadratisk region definierades som en 25 cm × 25 cm central zon centrerad inuti arenan. Varje mus placerades försiktigt på den centrala ytan av den öppna fältlådan. Fem minuters gratis anpassningstid var tillåten. Beteenderegistrering och dataanalys koncentrerades till efterföljande fem minuters observationsperiod. Primära utläsningsindikatorer innehöll totalt rörelseavstånd, tid tillbringad i den centrala zonen och frekvensen av inträden i den centrala zonen. Dessa parametrar återspeglar spontan rörelseaktivitet och utforskande vilja under okända miljöförhållanden.

2.3.3 Svansupphängningstest (TST)

Mussvansdelen var säkert fixerad så att djuret kunde hänga upp och ner ovanför markytan. Total inspelningstid var sex minuter. Varaktigheten av den orörliga tiden under det senare segmentet på fyra minuter dokumenterades. Ökad orörlighetstid representerar förbättrad beteendemässig-förtvivlan depressiv-liknande status.

2.3.4 Forced-Sim Test (FST)

Transparent cylindrisk simtunna (diameter 15 cm, höjd 50 cm) fylldes med vatten som hölls vid (25 ± 2) grader; vattendjupet nådde 20 cm. Varje mus placerades försiktigt i en simbehållare under ett totalt inspelningsintervall på sex minuter. Flytande orörlighetstid på de sista fyra minuterna kvantifierades statistiskt. Längre orörlighetsperiod indikerar intensifierad förtvivlan-relaterad beteendeprestation.

2.4 Provtagning och vävnadsberedning

Vid den experimentella slutpunkten vecka 8 genomgick mössen en intraperitoneal injektion av 3 % pentobarbitalnatrium (10 ml/kg) för djup anestesi. Blodprover skördades genom blödningsteknik för borttagning av ögongloben. Efteråt utfördes eutanasi med cervikal dislokation. Hjärtperfusion med kall normal saltlösning rensade bort cirkulerande blod inuti hjärnvävnaden. Kompletta prover från hela hjärnan dissekerades snabbt ut. En halv hjärnvävnad nedsänktes i 4 % paraformaldehydlösning under 72 timmars vävnadsfixering för efterföljande histologi. Hippocampus hjärnregioner isolerades snabbt från återstående hjärnprover på förkyld isplattform och bevarades i en lagringsmiljö för flytande kväve. För biokemisk mätning blandades 10 mg vävnadsprov från hippocampus med förkyld normal saltlösning efter mass-volymförhållande 1:9, under mekanisk homogenisering i isbad. Vävnadshomogenat centrifugerades under 4000 r/min under 15 minuter, och supernatantfraktioner samlades upp för ELISA-biomarkörkvantifiering.

2.5 Biokemiskt indexmätning

Enligt tillverkarens bruksanvisningar för kommersiella ELISA-kit, mättes supernatantprover av serum- och hippocampushomogenat för att få koncentrationsvärden av monoaminneurotransmittorer inklusive 5-HT och DA. Hippocampus homogenat supernatant analyserades ytterligare för inflammatoriska mediatorindikatorer iNOS, COX-2, PGE2, tillsammans med pro-inflammatoriska cytokiner TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 och IFN-. Absorbansavläsningar av optisk densitet infångades via mikroplattans spektrofotometer. Provproteinkoncentrationen kalibrerades med BCA-proteinkvantifieringskit före cytokindetektion.

2.6 Hippocampus histopatologisk färgning

Fixerade hjärnvävnadsprover bäddades in i paraffinvax och skivades i histologiska sektioner med en tjocklek på 4 μm. För HE-färgning: paraffinsektioner gick igenom xylenavvaxning, gradientetanolhydrering, hematoxylinkärnfärgning, eosincytoplasmatisk motfärgning, saltsyra-alkoholdifferentiering, gradientetanoldehydrering, xylentransparensbehandling och neutral tandköttsmontering. Mikroskopisk observation fokuserade på cellulär morfologi, nukleär status och cytoplasmatisk strukturell integritet inom hippocampus dentate gyrus-regionen.

Nissl-färgning visualiserar neuronala Nissl-kroppar som återspeglar neuronal biosyntetisk aktivitet och cellvitalitet. Avvaxade paraffinskivor inkuberades i Nissl-färgningsarbetslösning. Efter tvättningssteg med destillerat vatten fick sektionerna uttorkning, insynsprocedur och försegling. Histomorfologiska variationer av hippocampus neuroner observerades under optiskt mikroskop.

2.7 Immunhistokemianalys

Paraffininbäddade hippocampusvävnadssektioner avvaxades och hydrerades. Antigenåtervinning, endogen peroxidasblockering och icke-specifika proteinbindande blockeringssteg implementerades sekventiellt. Vävnadsskivor inkuberades över natten vid 4 graders temperatur med utspädda primära antikroppar: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), anti-Caspase-1 (1:400). Efter sekundär-antikroppsinkubation utfördes en DAB-kromogen reaktion. Nucleus counter-infärgning, uttorkning och monteringsprocedurer slutfördes. Ljusmikroskopfångade digitala synfältsbilder. Bild-J bildbehandlingsprogram beräknade genomsnittliga optiska densitetsvärden för att semikvantitativt utvärdera målproteinets uttrycksintensitet.

2.8 Immunfluorescensfärgning

Förberedda paraffinhippocampussnitt upplevde avvaxning, antigenåtervinning och blockerande operation. Primära antikroppar anti‑TLR4 (1:400) och anti‑phospho‑NF‑κB p65 (1:200) applicerades och inkuberades över natten vid fyra grader Celsius. Fluorescensmärkta sekundära antikroppar tillsattes för en timmes inkubation under ljusavskärmande status. DAPI nukleär motfärgning inkluderades i monteringsmediet. Laserfluorescensmikroskop fotograferade fluorescenssignaler. Image-J-mjukvara beräknad genomsnittlig fluorescensintensitet som representerar TLR4- och p-NF-κB p65-proteinaktiveringsstorleken.

2.9 Statistisk analys

Ursprungliga experimentella data bearbetades med SPSS 26.0 statistikprogramvara och GraphPad Prism 9.0 grafprogram. Alla kvantitativa utfallsdata uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Statistiska jämförelser mellan grupper utfördes med lämpliga statistiska tester. P-värde mindre än 0,05 bedömdes som statistiskt signifikant skillnad; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Experimentella resultat

3.1 CPhGs förbättrade anhedonisymtom och återställda monoaminneurotransmittornivåer

Innan CUMS-modellering initierades visade baslinjens sackarospreferenshastigheter ingen uppenbar statistisk varians över alla experimentella djurkohorter. Efter fyra veckors CUMS-stress plus fyra veckors interventionscykler uppvisade CUMS-modellgruppen en tydligt minskad sackarospreferenskvot jämfört med icke-stressade kontrolldjur (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

Jämfört med Mod-modellkohorten, genererade hög-, medel- och lågdoserade CPhGs-behandlingsgrupper såväl som fluoxetinpositiva grupper en framträdande ökning av sackarospreferensprocent, serum 5-HT, serum DA, hippocampus 5-HT och hippocampus DA-innehåll (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 CPhGs Enhanced Exploratory Activity in Open-field Test

I öppen fält beteendeutvärdering, visade CUMS-modellmöss en anmärkningsvärd minskning av det totala rörelseavståndet, den centrala zonens vistelsetid och den centrala regionens inträdesfrekvens jämfört med kontrollmöss (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 CPhGs förkortade orörlighetstiden i förtvivlanbaserade beteendeparadigm

Svansupphängningstest och tvångssimtest upptäcker beteendeförtvivlan, vilket representerar depressionsliknande beteendeavläsningar. Mod-gruppen visade drastiskt förlängd orörlighetstid både i TST och FST (P< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 CPhG reducerade överuttryckta hippocampala pro-inflammatoriska cytokiner

Hippocampus pro-inflammatoriska cytokinkoncentrationer (TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑) i CUMS-modelldjur var drastiskt förhöjda jämfört med kontrollmotsvarigheter (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3,5 CPhGs nedreglerade hippocampus inflammatoriska-mediator biomarkörer

Hippocampus inflammatoriska mediatorer iNOS, COX-2 och PGE2 i CUMS-modellmöss ökade signifikant (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 CPhG dämpad CUMS-utlöst hippocampus neuronal patologisk skada

HE-färgningsresultat: hippocampala dentate-gyrus-neuroner från Mod-gruppen uppvisade allvarliga patologiska lesioner: oordnat cellulärt arrangemang, nucleus pyknos, cytoplasmatisk vakuolär degeneration, uppvisande framträdande neuronal skada. CPhGs-L-gruppen visade endast trivial förbättringseffekt. Medel- och högdos CPhG vänder uppenbarligen sådana patologiska förändringar; Högdos CPhGs-H-gruppen visade överlägsen neuronal-skyddande effekt jämfört med fluoxetingruppen i partiella synfält.

Nissl-färgningsresultat: Hippocampusneuroner från Mod-grupp uppvisade oorganiserat arrangemang, påtaglig minskning av Nissl-kroppskvantiteten, vilket återspeglade nedsatt neuronal syntetisk funktion och låg cellulär vitalitet. CPhGs administrering dosberoende återställde Nissl-kroppens överflöd. Neuronal morfologi och Nissl-korpuskeldensitet inom CPhGs-H-gruppen närmade sig normal kontrollgruppsnivå. Histopatologiska fynd bekräftade CPhGs skyddade hippocampus neuronintegritet mot kronisk stressmedierad förstörelse.

3.7 CPhGs reglerad Hippocampus glialcellsaktiveringsstatus

GFAP är en specifik biomarkör för astrocytpopulationen. Jämfört med Con-gruppen sjönk intensiteten av positiva signaler från Mod-gruppen hippocampus GFAP signifikant (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Iba-1 proteinmarkör representerar mikroglia. CUMS-modellgruppen uppvisade en dramatiskt ökad Iba-1-positivt uttryckssignal (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 CPhGs hämmade Hippocampus NLRP3-inflammasomrelaterat-proteinuttryck

Immunhistokemi-detektering manifesterade NLRP3- och Caspase-1-proteinuttryck inuti Hippocampus i Mod-grupp var markant uppreglerade (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 CPhGs undertryckt överaktivering av TLR4/NF‑κB signalväg

Immunfluorescensdetektion visade att CUMS-modellmöss uppvisade signifikant förstärkt fluorescensintensitet av TLR4-receptorn och fosforylerad NF-κB p65-subenhet (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Diskussion

Allvarlig depressiv sjukdom är en allvarlig neuropsykiatrisk sjukdom. Under de senaste åren har neuroinflammatorisk teori om depression väckt stor forskningsuppmärksamhet. Kronisk upprepad psykologisk stress kan utlösa medfödd immunsystemaktivering i centrala nervsystemet. Hippocampus, en hjärnregion som är mycket sårbar för stressförolämpningar, är nära korrelerad med humörmodulering, belöningsbearbetning och minnesfunktion. Under ihållande stressstimulering kollapsar hippocampus gliacellshomeostas. Hyperaktiverade mikroglia och skadade astrocyter utsöndrar stora mängder pro-inflammatoriska cytokiner, vilket ger upphov till neuronal strukturell skada, metabolisk störning av monoamin-neurotransmittorer, vilket så småningom främjar depressionsliknande beteendemässigt uppkomst.

Traditionella örtläkemedelsbaserade aktiva naturliga produkter har farmakologiska fördelar med flera mål, och blir lovande kandidatresurser för upptäckt av antidepressiva läkemedel. CPhG är bioaktiva signaturkomponenter isolerade frånCistanchemedicinsk ört. Denna forskning konstruerade en CUMS-inducerad musmodell för kronisk stressdepression, som heltäckande verifierade in vivo antidepressiva-liknande effekt av gradientdoserade CPhGs. Beteendeexperimentella resultat visade att CPhGs-behandling signifikant förbättrade anhedonisymptom, förbättrade utforskande aktivitet och minskade förtvivlanrelaterad orörlighetstid hos möss med depressionsmodell, vilket visade tydlig dos-effektkorrelation.

Monoamin-neurotransmittorhypotes är klassisk teori om depressionspatogenes. Serotonin och dopamin åtar sig kritiska reglerande roller som täcker emotionell stabilisering, belönings-feedback-uppfattning och motivationsrelaterad beteendemodulering. CUMS-stress ledde till uppenbar minskning av 5-HT- och DA-koncentrationer i serum och hippocampusvävnad hos våra modelldjur. CPhGs intervention återställde effektivt dessa två monoaminneurotransmittornivåer. Detta utfall överensstämmer med tidigare publicerade forskningsrapporter angCistancheextrakt som modulerar hjärnan monoamin neurotransmittorer.

Ytterligare biokemiska biomarkörtester avslöjade att CUMS inducerade robust förhöjning av multipla pro-inflammatoriska cytokiner (TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑) plus inflammatoriska mediatorer (iNOS, COX‑2, PGE2) vävnad. CPhG-intervention vände signifikant sådan inflammatorisk överuttrycksstatus. Histopatologisk HE- och Nissl-färgning visade intuitivt att CPhG mildrade stressorsakad hippocampus-neuronskada och skyddade neuronala morfologiska integritet.

Glialcellspopulationer fungerar som centrala deltagare som förmedlar neuroinflammatoriska svar. Astrocyter upprätthåller återvinning av signalsubstanser, blod-hjärnbarriärens strukturella stabilitet och neuronal näringstillförsel. Mikroglia fungerar som inneboende medfödda immuneffektorceller inuti hjärnans parenkym. Kronisk stress provocerar förlust av astrocyter eller funktionell inkompetens, tillsammans med mikroglia patologisk hyperaktivering. Våra immunhistokemidata indikerade att CPhGs-behandling ökade GFAP-positiv astrocytdensitet, samtidigt som den sänkte mängden Iba-1-märkt överaktiverad mikroglia i hippocampus. Denna gliacell-fenotypreglerande egenskap kan delvis ligga bakom CPhGs neuroskyddande och antidepressionsfarmakologiska styrka.

NLRP3-inflammasom representerar en viktig molekylär plattform som förmedlar neuroinflammatorisk kaskad. Dess aktivering driver mognad och utsöndring av nedströms IL-1 och IL-18 pro-inflammatoriska cytokiner. TLR4/NF‑κB-signalaxeln fungerar som en viktig uppströms primingsignal för NLRP3-inflammasomaktivering. TLR4-receptorstimulering främjar NF-KB-subenhetsfosforylering och nukleär translokation, transaktiverar ytterligare NLRP3, pro-IL-1-gentranskription. I vår nuvarande studie utlöste CUMS-stress samtidig förbättring av TLR4, fosforylerad NF-κB p65, NLRP3 och Caspase-1 proteinuttryck. CPhGs-intervention hämmade tydligt aktiveringen av hela denna signalkaskad. Vi drar därför slutsatsen att CPhGs lindrar neuroinflammatorisk skada delvis genom att begränsa TLR4/NF-κB-medierad NLRP3-inflammasomaktivering.

Sammantaget stöder våra experimentella bevis från djurmodeller den mekanistiska modellen: CPhG genererar antidepressiva effekter i CUMS-inducerade depressiva möss genom två primära dimensioner: (1) återställande av homeostas av humörrelaterade monoaminneurotransmittorer (5-HT, DA); (2) modulering av hippocampus gliacellshomeostas och undertryckande av TLR4/NF-κB-driven NLRP3 inflammasomberoende neuroinflammatorisk patologisk kaskad.

Flera begränsningar i denna utredning förtjänar att beaktas. Detta arbete implementerade enbart in-vivo-experiment på djurnivå. Vi har inte utfört mekanistisk validering på cellnivå eller kliniska prövningar på människa. Därför bör translationell slutledning till behandling av mänsklig depression förbli försiktig. Dessutom har denna forskning inte dissekerat bidrag från enskilda monomerföreningar (echinacoside, verbascoside) i blandade CPhGs-extrakt. Framtida forskning kan koncentreras på mekanistisk verifiering av cellkultur, jämförelse av individuella komponenters aktivitet, såväl som preliminära pilotobservationer från människa och individ.

5. Slutsats

Cistanche-fenyletanolglykosider (CPhG) producerar signifikanta antidepressiva-liknande farmakologiska effekter mot kroniska oförutsägbara milda stress-provocerade depressionsliknande beteendefenotyper hos C57BL/6-möss. Dess terapeutiskt relaterade mekanismer är förknippade med återhämtning av serum och hippocampus serotonin- och dopamin-neurotransmittornivåer, bevarande av hippocampus neuronala strukturintegritet, modulering av astrocyt-mikroglia funktionell jämvikt, såväl som undertryckande av TLR4/NF-κB-inflammatorisk inflammatorisk neuronflammatorisk inflammatorisk/NLRP3-media kaskad. Denna prekliniska djurstudie tillhandahåller experimentell referens för vidareutveckling av CPhGs som naturliga terapeutiska adjuvanssubstanser eller funktionella livsmedelsingredienser med inriktning på förbättring av depressiva symtom.

Referenser

Ren L, Shao YT, Qin SH. Studie om målidentifiering och effekt av saponin A på depressiv sjukdom. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44-51.

Fan L, Peng Y, Wang JW, et al. Totala glykosider från stammar av Cistanche tubulosa lindrar depressionsliknande beteenden: dubbelriktad interaktion mellan fytokemikalier och tarmmikrobiota. Phytomedicine, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN, et al. Integrerad analys av fytokemisk sammansättning, farmakokinetik och nätverksfarmakologi för att undersöka skillnader mellan stammar av Cistanche deserticola och C. tubulosa baserat på antidepressiv aktivitet. Food & Function, 2022,13:8542-8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Depression som en mikroglial sjukdom. Trends in Neurosciences, 2015, 38:637-658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Microglia i depression: nuvarande perspektiv. Science China-Life Sciences, 2021, 64:911-925.

Wu B, Gan AN, Wang RX, et al. Alpinia oxyphylla Miq. flyktig olja lindrar depressiva beteenden och hämmar neuroinflammation hos CUMS-exponerade möss genom att hämma den TLR4-medierade MyD88/NF-κB signalvägen. Journal of Chemical Neuroanatomy, 2023,130:102270.