RNA-Seq-baserad De Novo-transkriptomsamling och genupptäckt av Cistanche Deserticola köttig stam-Ⅰ

Bakgrunder

Cistanche deserticola är en helt icke-fotosyntetisk parasitisk växt med stort medicinskt värde och är huvudsakligen utbredd i öknen i nordvästra Kina. Dess torkade köttiga stjälk är en avgörande tonic iTraditionell kinesisk medicinmed roller att främst förbättra manlig sexuell funktion och stärka immunitet, men få mekanistiska studier har genomförts delvis på grund av bristen på genomiska och transkriptomiska resurser.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA KINESISK TRADITIONELL MEDICIN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Resultat

I den här studien utförde vi djup transkriptomsekvensering i den köttiga stammen av C. deserticola, och cirka 80 miljoner avläsningar genererades med hjälp av Illumina pair-end-sekvensering på HiSeq2000-plattformen. Med hjälp av trinity assembler erhöll vi 95 787 transkriptsekvenser med transkriptlängder från 200 bp till 15 698 bp, med en medellängd på 950 baser och en N50-längd på 1 519 baser. 63 957 transkript identifierades som aktivt uttryckta med FPKM större än eller lika med 0,5, där 30 098 transkript annoterades med genbeskrivningar eller genontologitermer genom sekvenslikhetsanalyser mot flera offentliga databaser (Uniprot, NR och Nt vid NCBI och KEGG) . Dessutom identifierade vi nyckelenzymgener involverade i biosyntesen av lignin och fenyletanoidglykosider (PhGs) som är kända för att vara de primära aktiva ingredienserna. Fyra gener för fenylalanin ammoniak-lyas (PAL), det första nyckelenzymet i lignin- och PhG-biosyntes, identifierades baserat på sekvensjämförelse och fylogenetisk analys. Två biosyntesvägar för PhG föreslogs också för första gången.

Slutsatser

Sammantaget slutförde vi en global analys av C. deserticola köttiga stamtranskriptom med RNA-seq-teknologi. En samling enzymgener relaterade till biosyntesen av lignin och fenyletanoidglykosider identifierades från de sammansatta och kommenterade transkripten, och genfamiljen av PAL förutspåddes också. Sekvensdata från denna studie kommer att ge en värdefull resurs för att bedriva framtida forskning om biosyntes av fenyletanoidglykosider och funktionella genomiska studier i denna viktiga medicinalväxt.

Introduktion

C. deserticola är ett världsomspännande släkte av fleråriga ökenväxter från familjen Orobanchaceae och är en helt icke-fotosyntetisk art och växer vanligtvis underjordisk holoparasitisk växt. Den parasiteras på rötterna av psammofyten Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), som huvudsakligen lever i öknar och halvöknar på grund av sin höga tolerans mot torka och salthalt. C. deserticola visar stark motståndskraft mot tuffa miljöförhållanden och är huvudsakligen distribuerad i nordvästra Kina, särskilt i Inre Mongoliet, Gansu och Xinjiang. Det anses vara en utrotningshotad vild art de senaste åren på grund av ökad konsumtion av människor. C. deserticola som ofta kallas ökenginseng är allmänt känd som öken-kvastrape och den torkade köttiga stjälken har använts flitigt som en traditionellt viktig tonic i Kina och Japan under många år. Det spelades ursprungligen in i Shen Nong Ben Cao Jing (Dictionary of Chinese Materia Medica, 1977) för ungefär 1800 år sedan och betraktades som en av huvudkällorna tillKinesisk medicinört Cistanche.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Extrakten av C. deserticola har ett brett utbud av medicinska funktioner, speciellt för användning för att förbättra sexuell funktion, tonifiera njurarna, skydda levern, öppningsaktivitet, förbättra minnet, immunmodulerande, antioxidativ aktivitet, antiinflammatorisk, antiviral aktivitet, etc. de viktigaste bioaktiva komponenterna i C. deserticola är fenyletanoidglykosider (PheGs, PhGs). Hittills har mer än 20 fenyletanoidglykosider isolerats från den saftiga stammen av C.deserticola. Bland dem,akteosid och echinakosidär två huvudkomponenter med betydande farmakologiska aktiviteter och är dokumenterade som kvalitetsstandarder för C. deserticola i den kinesiska farmakopén (utgåvorna 2005 och 2010). Tre kemiska komponenter i PhG är organisk syra, sackarid och fenyletanoid, men detaljerna om fenyletanoid biosyntetiska vägar är fortfarande dåligt förstådda i C.deserticola.

Trots den kommersiella och medicinska betydelsen av C.deserticola är genomiska och transkriptomiska data för denna art mycket begränsade. Det finns inga EST:er tillgängliga i NCBI-databasen och den fullständiga genominformationen för denna art förblir otillgänglig förutom kloroplastgenomsekvensen. De begränsade transkriptomiska data hindrar studiet av PhG biosyntetiska mekanismer. RNA-seq-teknologi kan generera sekvenser av de uttryckta delarna av det riktade genomet och identifiera gener [18] med hjälp av NGS-teknologiplattformar (som Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq och Roche 454). Det blir allt mer populärt i transcriptome de novo-sammansättning, eftersom det är ett kostnadseffektivt och kraftfullt tillvägagångssätt med hög upplösning och brett dynamiskt omfång, särskilt eftersom det har en fördel att utforska låga transkriptioner. På grund av de olika fördelarna är RNA-seq speciellt attraktivt för icke-modellorganismer med begränsade genetiska resurser. Det finns dock ingen detaljerad forskning om C. deserticola-transkriptom av RNA-seq.

I denna studie sekvenserade vi globalt stamtranskriptomet för C. deserticola med hjälp av Illumina Hiseq2000-plattformen och fick 7,9 G rådata. Genom montering och anteckning bröt vi generna som är involverade i biosyntesen av PhG och generna som är ansvariga för hela ligninbiosyntesen. Vår RNA-seq-analys genererade det första konsensustranskriptomet för C. deserticola och gav nya insikter i en omfattande förståelse av det medicinska värdet av C. deserticola. Dessutom kan metoden som beskrivs här i stor utsträckning tillämpas på profiltranskriptomer för att underlätta upptäckten av gener involverade i specifika medicinska komponentbiosyntesvägar i en annan medicinalväxt med mycket begränsade genomiska resurser.

Material och metoder

Insamling av växtmaterial

Den färska saftiga stammen för C. deserticola i utgrävningsstadiet samlades in från en växtbas i BayanHot City of Alxa League i Inre Mongoliet i nordvästra Kina. Insamlingstillståndet erhölls från ägaren (HongKui CongRong Group) av anläggningsbasen. Verifikationsprovet deponerades i Core Genomic Facility vid Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences. Efter rengöring skars de saftiga stamvävnaderna i små bitar och frystes omedelbart i flytande kväve och lagrades sedan vid -80 grad tills vidare bearbetning.

RNA-extraktion, cDNA-bibliotekskonstruktion och Illumina-sekvensering

Totalt RNA extraherades från den suckulenta stammen med användning av TRIzol Reagent (Invitrogen Inc., Kalifornien, USA) enligt tillverkarens instruktioner. De resulterande proverna behandlades med DNas I för att avlägsna eventuellt genomiskt DNA. Extraherade RNA kvantifierades med en Agilent 2100 bioanalysator (Agilent Technologies) och kontrollerades för integritet med hjälp av denaturerande agarosgelelektrofores med etidiumbromidfärgning. RNA-prover med A260/A280-förhållanden mellan 1,9 och 2,1, RNA 28S:18S-förhållanden högre än 1,0 och RNA-integritetstal (RIN) -8.5 användes i efterföljande analyser.

RNA-seq-biblioteken genererades med användning av Illumina Truseq RNA Sample Preparation Kit. Poly(A)+-RNA isolerades från totalt RNA med användning av Dynal ligo(dT)25-kulor enligt tillverkarens instruktioner. Efter rening tillsattes en fragmenteringsbuffert för att bryta mRNA till korta fragment. Första-strängs cDNA syntetiserades med användning av dessa korta fragment som mallar, tillsammans med SuperScript III omvänt transkriptas och N6 slumpmässig hexamer-primer. Andra-strängs cDNA syntetiserades sedan med användning av buffert, dNTPs, RNaseH och DNA-polymeras I. Det resulterande dubbelsträngade cDNA:t utsattes för ändreparation med användning av T4 DNA-polymeras, DNA-polymeras I Klenow-fragment och T4-polynukleotidkinas och ligerades till adaptrar som använder T4 DNA-ligas. Adaptorligerade fragment renades med användning av ett QiaQuick PCR-extraktionskit och eluerades med EB-buffert. Efter analys med användning av agarosgelelektrofores valdes lämpliga fragment ut som mallar för PCR-amplifiering. Sekvensering av det resulterande cDNA-biblioteket utfördes med ett Illumina HiSeq 2000-system.

Transcripts de novo montering och kvantifiering av genuttryck

Råavläsningar genererade från sekvensering renades genom att ta bort adaptersekvenserna (ATCTCGTATGCCGTC) med en intern metod. Vi genomförde sedan en sträng filtreringsprocess av låg kvalitet. För det första skulle baser med ett phred-kvalitetspoäng lägre än 20 trimmas från 3'-änden av sekvensen, tills de kommer in i en bas med högre kvalitet (större än eller lika med 20). Om läslängden var kortare än 50 bp skulle den kasseras. För det andra kommer läsningar att filtreras ytterligare av kriteriet att 70 % av baserna i en läsning har högkvalitativa poäng (större än eller lika med 20). För det tredje användes endast parade ändar för ytterligare montering. De novo-transkriptsammansättningen utfördes med Trinity-versionen_20130216 [30] som bestod av tre på varandra följande programvarumoduler: Inchworm, Chrysalis och Butterfly. Monteringsparametrarna ställdes in enligt nedan:-seqType fq-JM 300G -min_contig_längd 200-CPU 20-tummask_cpu {{21} }bflyCPU 20.

För att kvantifiera överflöd av transkript, justerades de sekvenserade parändläsningarna om till de sammansatta transkripten med hjälp av ett skript i Trinity. Kartlagda läsningar användes för kvantifiering med RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) programvara. Gen- eller isoformmängd representerades av fragmentet per kilobas av transkript per miljon fragment kartlagt värde (FPKM), de transkript med FPKM-värde lika med eller större än 0.05 definierades som uttryckta.

Funktionell annotering av uttryckta avskrifter

Det finns inga genanteckningsuppsättningar av C. deserticola förutom kloroplastgenomet [1]. Vi kommenterade de uttryckta transkripten genom att jämföra dem med Genbank Nt, Genbank Nr och TAIR10_ pep_20101214_uppdaterade datauppsättningar separat med hjälp av BLAST-programmet (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

Gene Ontology och KEGG pathway-annotering Genom sekvenslikhetsanpassning till Uniprot-databasen (Gene Ontology (GO)-annoteringen av alla sammansatta transkript erhölls genom att använda en associationsfil som laddades ner från (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/ databaser/GO/goa/UNIPROT/gen_goa_uniprot.gz). CC-, BP- och MF-kategorierna separat.

KEGG-väginformation tilldelades för alla förutspådda proteinsekvenser med hjälp av onlineverktyget KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. Sekvenser i fasta-format skickades till KAAS-förfrågan, och de resulterande filerna med all information om vägar relaterad till C. deserticola stamtranskriptom laddades ner. 13 växtorganismers gendatauppsättningar i KEGG användes för annotering med BBH-metoden (bi-directional best hit).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EXTRAKT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RT-qPCR-analys

Efter digestion med DNas I omvandlades ungefär 5 ug av totalt RNA till första-strängs cDNA via omvänd transkriptionsreaktion med oligo(dT)15-primrar och GoScript Reverse Transcription System (Promega). cDNA-produkterna späddes sedan 10- gånger med nukleasfritt avjoniserat vatten före användning som mall i realtids-PCR. Specifika cDNA:n amplifierades av GoTaq 2-Step RT-qPCR-systemet (Promega) i en volym av 20 ul. PCR-amplifiering utfördes vid anlöpningstemperaturen på 60 grader med 7500 Real-Time PCR Detection System (Applied Biosystems) enligt tillverkarens instruktioner. Relativa transkriptförekomster beräknades med den jämförande cykeltröskelmetoden med genen "comp10579_c0" som en intern standard, med hjälp av programvaran 7500 Manager.

Primerpar för RT-PCR utformades baserat på onlineprogramvara (http://primer3.ut.ee/) och listas i S1 Dataset.

Resultat

RNA-sekvensering och de novo transkriptomsammansättning av C. deserticola köttig stam

Stam av C. deserticola har använts i stor utsträckning som en traditionellt viktig tonic i Kina och Japan i många år. För att få en global översikt av genuttryck i den köttiga stammen C. deserticola samlade vi in ​​C. deserticola stamprover av samma växtbas 2013 respektive 2014. Totalt RNA extraherades och polyA+ RNA renades för att konstruera RNA-sekvensbibliotek med parade ändar. 79 433 734 och 86 019 176 pair-end-läsningar motsvarande nästan 8 miljarder och 8,6 miljarder baser av sekvensen erhölls med Illumina HiSeq 2000-sekvensering

plattform i 2013-år och 2014-årsprov (tabell 1). Efter att ha tagit bort adaptersekvenser och filtrerat avläsningar av låg kvalitet (se detaljer i Metoder), användes 64 831 040 högkvalitativa parändläsningar i 2013-årsprovet för de novo-transkriptomsammansättning. Med hjälp av Trinity-sekvenssammanställaren [30], genererades 51 719 gener och 95 787 transkriptsekvenser med transkriptlängder från 200 bp till 15 698 bp. Den genomsnittliga längden på sammansatta avskrifter är 950 baser och N50-längden är 1 519 baser. Antalet transkript i olika längder visade att 57,32% av de sammansatta transkripten var cirka 500 bp eller längre (Fig 1A). Högkvalitativa pair-end-läsningar i 2014-årsprovet mappades till det sammansatta transkriptomet. Dessutom fann vi att transkriptnumret för varje sammansatt gen varierade och 69% av generna med en uttryckt isoform medan 31% av generna uttryckte två eller flera transkript (Fig 1B).

Uttryckskvantifiering och funktionell annotering av sammansatta transkript

Gen- eller transkriptöverflöd kvantifierades med användning av RSEM-paketet, där de sekvenserade läsningarna justerades om till de sammansatta generna eller transkriptionssekvenserna med hjälp av Bowtie, och de kartlade läsningarna användes för kvantifiering. FPKM-värde för varje gen eller transkript beräknades och slutligen identifierade vi 63 957 och 52 857 aktivt uttryckta transkript (FPKM-värde större än eller lika med 0.5) i C. deserticola köttiga stamprover i 2{{17} }13 respektive 2014. 44 776 transkriptioner (70,01 % i 2013-årsprovet, 84,71 % i 2014-årsprovet) uttrycktes vanligen i de två replikaten, och korrelationen (Pearson-korrelationskoefficient: 0,91979) av deras uttrycksdata var visas i S1 Fig. Sekvenseringsrådata hade laddats upp till NCBI SRA-databasen (accessionsnummer: SRX857402 och SRX858938). Vi använde uttryckta gener som identifierats i 2013-årsprovet för ytterligare analys. Funktionell anteckningsinformation för alla uttryckta transkript erhölls med två metoder. För det första justerades alla uttryckta transkript till kända nukleotid- (GenBank nt) och peptidsekvensdatabaser (GenBank nr och Arabidopsis-peptid) separat med BLAST-algoritmen. Av 63 957 uttryckta avskrifter,

29 220 (45,7 %) kommenterades och visade homologi med sekvenser i någon av de tre ämnesdatabaserna med E-värde cutoff 1e-20. Samtidigt förutspåddes kandidatkodningsregionerna för alla uttryckta transkriptsekvenser med hjälp av TransDecoder-mjukvara, och de längsta ORF:erna för varje transkript användes för Pfam-domänsökningen. Som ett resultat kommenterades 21 358 (33,4%) avskrifter baserat på Pfam-databasen. Totalt sett matchades 30 098 (47,1%) transkript signifikant till kända gener i de offentliga databaserna genom att kombinera de två metoderna ovan. Den kompletta listan med uttryckta transkript med funktionsanteckning visades i kompletterande data (S2 Dataset).

Vi undersökte de 20 mest uttryckta transkripten (tabell 2) motsvarande 18,99 % av alla sekvensläsningar, och fann att de flesta av dem är gener som svarar på abiotika

stress stimulans. Dehydrin (DHNs), en klass av hydrofila och termostabila stressproteiner med ett stort antal laddade aminosyror som tillhör familjen Group II Late Embryogenesis Abundant (LEA), är den mest uttryckta genen. Tre olika Dehyrin-transkript (comp28713_c0_seq1/2/4) upptäcktes som starkt uttryckta i köttiga stjälkar som kan vara involverade i att skydda celler från skador orsakade av torkstress. Andra stressrelaterade gener som värmechockprotein, patogenrelaterat protein och metallothionein visade sig också uttryckas starkt, vilket kan vara relaterat till dess svåra överlevnadsmiljö. Dessutom, vissa konstitutiva gener inklusive 26S ribosomal RNA-gen (komp22329_c2_seq1), auxin-undertryckt/viloassocierat protein (comp20999_c0_seq1), ADP-ribosyleringsfaktor (komp20499_ c0_seq1) transkriberades också mycket.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA IMMUNITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%