Rollen för den renala androgenreceptorn i könsskillnader i ammoniakmetabolism

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Autumn N. Harris et al

Abstrakt

Det finns könsskillnader i njurammoniakmetabolism och struktur, av vilka många medieras avtestosteron. Målet med den föreliggande studien var att bestämma rollen för det renala uttrycket avtestosteronkanonisk receptor, androgenreceptor (AR), i dessa sexuella dimorfismer. Vi studerade möss mednjure-specifik AR-deletion [KS-AR-knockout (KO)] genererad med Cre/loxP-tekniker; kontrollmöss var Cre-negativa kullkamrater (vildtyp). Hos hanmöss men inte honmöss ökade KS-AR-KO ammoniakutsöndringen, vilket eliminerade könsskillnader. Även om den strukturella storleken på njurarna vanligtvis är parallell med ammoniakutsöndringen, minskade KS-AR-KOnjurestorlek, kortikal proximal tubulivolymdensitet och kortikal proximal tubulicellhöjd hos män – ingen av dem förändrades hos kvinnor och volymtätheten för uppsamlingskanalen var oförändrad hos båda könen. Analys av nyckelprotein involverat i ammoniakhantering visade hos hanmöss att KS-AR-KO ökade både fosfoenolpyruvatkarboxykinas (PEPCK) och Na þ -K þ -2Cl cotransporter (NKCC2) uttryck och minskade Na þ/H þ utbytare isoform 3 (NHE3) och elektrogen Na þ -bikarbonat cotransporter 1 (NBCe1)-A uttryck. Hos honmöss ändrade KS-AR-KO inte dessa parametrar. Dessa effekter inträffade trots att KS-AR-KO inte förändrade plasmantestosteron, matintag eller serum Na þ, K þ eller HCO3 signifikant hos båda könen. Sammanfattningsvis, AR-beroende signalvägar hos män, men inte kvinnor,njurarreglerar PEPCK- och NKCC2-uttryck och leder till de sexuella skillnaderna i ammoniakutsöndring. Motsatta effekter på NHE3 och NBCe1-Ett uttryck begränsar sannolikt storleken på förändringar i ammoniakutsöndringen. Eftersom AR inte är närvarande i den tjocka stigande extremiteten är effekten av KS-AR-KO på NKCC2-uttryck indirekt. Slutligen förmedlar AR det störrenjurestorlek och proximal tubulivolymdensitet hos hanar jämfört med honmöss.

NYTT & ANMÄRKANDESexuella dimorfismer i ammoniakmetabolismen involverar androgenreceptorberoende signalvägar hos män, men inte hos kvinnor,njurarsom leder till förändrad proximal tubuli (PT), fosfoenolpyruvatkarboxykinas och tjockt stigande lem Na þ -K þ -2Cl cotransporter expression. Adaptiva svar i Na þ/H þ-växlare 3 och elektrogen Na þ -bi-karbonat-samtransportör 1-Ett uttryck begränsar storleken på effekten på ammoniakutsöndring. Slutligen är den större njurstorleken och PT-volymdensiteten hos hanmöss resultatet av PT-androgensignalering genom AR.

nyckelord: syra-bas; ammoniak; androgenreceptor; könsskillnader;testosteron

cistanche ökar testosteronet

INTRODUKTION

The presence of sex differences in many aspects of mammalian biology has been well established with sexual dimorphisms in structure and/or function have been identified in nearly every organ, including the kidney (1–3). Sex affects many aspects of kidney function and disease. Sex differences in blood pressure are widely recognized and thought to be related to sex-specific variations in nitric oxide, the renin-angiotensin-aldosterone system, and inflammation (4, 5). There are also differences in the expression of many renal epithelial cells Naþ transporters (6, 7). Understanding these differences can identify new disease mechanisms and/or new and improved therapeutic opportunities. The kidney regulates acid-base homeostasis, which is critical for normal health (8, 9). Renal ammonia Fn1 1 metabolism has a major role in acid-base homeostasis; ammonia excretion is the predominant component of basal net acid excretion, and changes in ammonia metabolism account for >80 procent av svaret på exogena stimuli (10–16). Dysreglering av syra-bashomeostas påverkar i stort sett alla större organsystem direkt, påskyndar utvecklingen av kronisk njursjukdom och korrelerar med ökad dödlighet (17–19).

Våra studier har visat att det finns viktiga könseffekter på både ammoniakmetabolism och njurstruktur. Den manliga njuren utsöndrar mindre ammoniak än den kvinnliga njuren och gör det trots att den manliga njuren är större och har större kortikal volym än den kvinnliga njuren (20). Denna skillnad i ammoniakutsöndring korrelerar med variationer i flera njuraspekter, inklusive flera enzymer involverade i ammoniakgenerering och -återvinning, i proximal tubulistorlek, i den tjocka stigande delen av öglan av Henle (TAL) Naþ -Kþ ​​- 2Cl - cotransportör (NKCC2) uttryck, och vid insamling av kanal interkalerad cellstorlek och Rhesus (Rh) glykoprotein expression (20). Slutligen finns det könsskillnader i svaret på syraladdning (21). Många av dessa könsskillnader vänds genom orkiektomi genom en mekanism som upphävs av fysiologiskatestosteronersättare, vilket tyder på att de involverartestosteron-beroende signalvägar (22).

Den kanoniska vägen genom vilkentestosteronförmedlar biologiska effekter involverar bindning till androgenreceptorn (AR) (23, 24). AR-protein och mRNA-uttryck har observerats i både manliga och kvinnliga njurar i decennier (25–28). Vi visade nyligen att AR-protein uttrycks specifikt i den proximala tubuli och att uttryck inte var detekterbart i varken TAL eller uppsamlingskanalen (22), där det finns kända könsskillnader i proteiner involverade i ammoniakhantering. Våra studier visade vidare att proximal tubulus AR-uttryck var närvarande i både manliga och kvinnliga njurar, med uttryck som var ungefär dubbelt så mycket i den manliga njuren än i den kvinnliga njuren (22). Dessa observationer tyder på att AR kan förmedla vissa, men inte alla, effekterna av sex på njurstrukturen och på ammoniakgenerering och -transport. De väcker också frågan om AR:s roll i den kvinnliga njuren.

Sålunda var syftet med den föreliggande studien att bestämma rollen för renal AR för att mediera dessa identifierade sexuella dimorfismer i renal ammoniakmetabolism och njurstruktur. Eftersom AR-aktivering har många biologiska effekter, som indirekt kan förändra syra-bas-homeostas och därmed ammoniakhantering, är det komplicerat att tolka studier som använder farmakologisk AR-hämning och/eller global AR-deletion. Därför använde den föreliggande studien möss med njurspecifik AR-deletion [KS-AR-knockout (KO)] genererade med hjälp av Cre-loxP-tekniker. Vi jämförde Cre-positiva möss med sina Cre-negativa kullkamrater för att bestämma effekten av KS-AR-KO. Både han- och honmöss utvärderades för att möjliggöra förståelse av AR:s roll hos båda könen.

cistanche tubulosa rötter

METODER

Djur

Vi använde möss med loxP-ställen som flankerar exon 2 av AR-genen (ARflfl/flfl), som tidigare har beskrivits (29–31). Vi inducerade AR-deletion från hela njuren genom att föda upp möss som uttryckte Cre-rekombinas under kontroll av Pax-8-promotorn (Pax8Cre; 32). KS-AR-KO möss var ARflfl/flfl, Pax8-Cre þ; kontrollmöss var ARflfl/flfl, Pax{10}Cre. Alla möss var på C57/Bl6-bakgrundsstammen. Vi genotypade alla möss med DNA extraherat från svansklämmaprover. Möss som användes i dessa experiment var vuxna han- och honmöss i -4 månaders ålder. Möss hölls på en vanlig gnagardiet (18 procent protein, Harlan Teklad, Madison, WI) med fri tillgång till vatten. University of Florida och North Florida/South Georgia Veterans Health System Institutional Animal Care and Use Committees godkände alla djurprotokoll. Djuruppfödning utfördes i University of Florida College of Medicine Cancer and Genetics Transgenic Animal Core Facility av utbildad personal.

Metaboliska burexperiment

Möss placerades i metaboliska burar under 3 dagar och matades med en normal diet i pulverform (18 procent protein, Harlan Teklad) blandad 1:1 med vatten. Daglig matkonsumtion mättes och dagliga 24-h urinprover samlades in. Urinprover uppsamlades i rör innehållande vattenjämviktad mineralolja för att förhindra avdunstning och förlust av gasmolekyler. Daglig urinvolym och pH registrerades. Urinprover lagrades i - 20 grad tills de analyserades vidare.

Blodanalys

Blod erhölls genom kanylering av bukaorta hos möss bedövade med isofluran, drogs in i en hepariniserad spruta och analyserades omedelbart för Naþ, K þ och bikarbonatkoncentrationer med hjälp av en Siemens Microanalytic Blood Gas Analyzer (RAPIDLab 348 Analyzer, Siemens, München, Tyskland ). Serumtestosteron mättes i University of Virginia School of Medicine Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core (IBL America mus testosteron ELISA, Minneapolis, MN)

Urinanalys

Urinammoniak mättes med användning av en modifiering av ett kommersiellt tillgängligt kit (A7553, Pointe Scientific, Canton, MI), som tidigare beskrivits (20, 33). Urin-pH mättes med användning av en mikro-pH-elektrod (ROSS semi-micro pH, Orion 8103BN, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Titrerbar syrautsöndring bestämdes med användning av tidigare beskrivna standardtekniker (20, 33).

Antikroppar

Tabell 1 visar de antikroppar som används i denna studie, deras leverantörer och deras katalog-/identifikationsnummer.

cistanche tubulosa extrakt ökar testosteronet och ökar den sexuella förmågan

Proteinberedning

Djuren sövdes med inhalerande isofluran och njurarna sköljdes genom in vivo hjärtperfusion med PBS (pH 7,4) innehållande 6,000 U/L Na-heparin och 120 mg/L lidokain. Den högra njuren avlägsnades snabbt och cortex, yttre medulla och inre medulla isolerades på ett kallt stadium under ett dissekerande mikroskop. Prover snabbfrystes i flytande kväve och förvarades frysta vid - 80 grad fram till användning. Vävnader homogeniserades i T-PER-vävnadsproteinextraktionsreagenset (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) med användning av mikrorörstötar (USA Scientific, Ocala, FL), och protein extraherades enligt tillverkarens rekommendationer. En alikvot användes för total proteinkvantifiering med användning av en bicinchoninsyra (BCA) analys, och återstoden förvarades fryst vid 80 grader fram till användning.

Immunoblot-procedurer Tio mikrogram njurprotein underkastades elektrofores på en 10 procent PAGE ReadyGel (Bio-Rad, Hercules, CA). Geler överfördes elektroforetiskt till nitrocellulosamembran, blockerades med 5 g/dL fettfri torrmjölk utspädd i Blotto-buffert (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA och 0,05 procent Tween 20, pH 7,6) och inkuberades vid 4 C över natten med den primära antikroppen i fettfri torrmjölk. Laddnings- och överföringsekvivalens bedömdes med Ponceau S-färgning och genom att utvärdera uttrycket av hushållsproteinet b-aktin. Efter att ha tvättats exponerades membran för sekundär antikropp (get anti-kanin IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) konjugerad till pepparrotsperoxidas i en utspädning av 1:5,000. Platser för antikropp-antigenreaktion visualiserades med hjälp av förbättrad kemiluminescens (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) och ett Kodak Image Station 440CF digitalt bildsystem. I utvalda experiment strippades blottar. Bandtätheten normaliserades så att medeldensiteten i en region (cortex eller yttre medulla) i manlig vildtypsvävnad (WT) var 100. Båda könen (hane och hona) och båda genotyperna (WT och KO) laddades på samma gel för dessa experiment. Frånvaron av mättnad bekräftades genom att undersöka pixelintensitetsfördelning i alla immunoblots.

Immunoblot-procedurer

Tio mikrogram njurprotein underkastades elektrofores på en 10 procent PAGE ReadyGel (BioRad, Hercules, CA). Geler överfördes elektroforetiskt till nitrocellulosamembran, blockerades med 5 g/dL fettfri torrmjölk utspädd i Blotto-buffert (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA och 0,05 procent Tween 20, pH 7,6) och inkuberades vid 4C över natten med den primära antikroppen i fettfri torrmjölk. Laddnings- och överföringsekvivalens bedömdes med Ponceau S-färgning och genom att utvärdera uttrycket av hushållsproteinet b-aktin. Efter att ha tvättats exponerades membran för sekundär antikropp (get anti-kanin IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) konjugerad till pepparrotsperoxidas i en utspädning av 1:5,000. Platser för antikropp-antigenreaktion visualiserades med hjälp av förbättrad kemiluminescens (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) och ett Kodak Image Station 440CF digitalt bildsystem. I utvalda experiment strippades blottar. Bandtätheten normaliserades så att medeldensiteten i en region (cortex eller yttre medulla) i manlig vildtypsvävnad (WT) var 100. Båda könen (hane och hona) och båda genotyperna (WT och KO) laddades på samma gel för dessa experiment. Frånvaron av mättnad bekräftades genom att undersöka pixelintensitetsfördelning i alla immunoblots.

Vävnadsberedning för immunhistokemi

Möss bedövades med inhalerande isofluran. Njurarna konserverades genom in vivo hjärtperfusion med PBS (pH 7,4) innehållande 6,000 U/L Na-heparin och 120 mg/L lidokain följt av perjodat-lysin-2 procent paraformaldehyd, skär på tvären i flera 2- till 3-mm tjocka skivor och sänk sedan ner i 24–30 timmar vid 4 grader i samma fixativ. Njurprover från varje djur bäddades in i polyestervax tillverkat med polyetylenglykol 400 distearate (Polysciences, Warrington, PA) med 10 procent 1-hexadekanol och 2-mm tjocka sektioner skars och monterades på gelatinbelagda rutschbanor.

cistanche tubulosa fördel: öka sexuell förmåga

Immunhistokemi

Immunlokalisering för Rh-familjen B-glykoprotein (Rhbg), Rh-familjen C-glykoprotein (Rhcg), Naþ /Hþ-bytarisoform 3 (NHE3), glutaminsyntetas (GS), NKCC2 och AR åstadkoms med användning av tidigare beskrivna immunoperoxidasprocedurer (20, 22, 34–37). Kortfattat avvaxades sektioner i etanol, rehydrerades, värmdes i Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) till 88 C under 30 minuter och sedan till 96 grader i 30 minuter, kyldes under 30 minuter och sköljdes i PBS. Endogen peroxidasaktivitet blockerades genom att inkubera sektioner i 3 procent H2O2 i destillerat vatten under 45 minuter. Sektioner blockerades i 15 minuter med serumfritt proteinblock (Dako Cytomation) och inkuberades sedan över natten vid 4 C med den primära antikroppen. Sektioner tvättades i PBS, inkuberades i 30 minuter med polymerbunden, peroxidaskonjugerad häst-anti-kanin-IgG (ImmPRESS, Vector Laboratories, Burlingame, CA), tvättades igen med PBS och exponerades sedan för diaminobensidin i 5 minuter. Sektioner tvättades med destillerat vatten, dehydratiserades med xylen, monterades och observerades med ljusmikroskopi. Jämförelser av märkning gjordes mellan sektioner från samma immunhistokemi-experiment. Sektioner undersöktes på ett Zeiss Axio Imager A2-mikroskop utrustat med DIC-optik och fotograferades med hjälp av Axiocam 305 färgdigitalkamera och Zen 2.3-mjukvara (Zeiss).

Immunlokalisering för fosfoenolpyruvatkarboxykinas (PEPCK) åstadkoms med användning av modifierade immunoperoxidasprocedurer som tidigare beskrivits (20, 22, 38–40). Kortfattat avvaxades sektioner i etanol, rehydrerades, värmdes i Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) till 96 C i 6 0 min, kyldes i 30 min och sköljdes i PBS. Endogen peroxidasaktivitet blockerades genom inkubering av sektionerna i 3 procent H2O2 i metanol under 45 minuter. Sektioner behandlades med 0,5 procent Triton X-100 i PBS under 15 min. Sektioner genomgick sedan flera tvättar i PBS innehållande 1 procent BSA, 0,05 procent saponin och 0,2 procent gelatin, följt av blockering i 15 minuter med serumfritt proteinblock (DAKO Cytomation) och inkuberades sedan över natten vid 4 C med primär antikropp. Sektioner tvättades i PBS innehållande 0,1 procent BSA, 0,05 procent saponin och 0,2 procent gelatin följt av PBS och inkuberades i 60 minuter med polymerkopplad, peroxidaskonjugerad get-anti-kanin IgG (MACH2, Biocare Medical, Concord, CA), tvättades igen i PBS och exponerades sedan för diamino-bensidin under 5 min.

Negativ kontroll

Varje immunhistokemiexperiment inkluderade ett avsnitt som exponerades för immunmärkningsprocedurerna utan primära antikroppar för att säkerställa att märkningen endast berodde på primär antikroppsbindning.

Morfometrisk analys

Volymtätheten för den proximala tubuli i cortex och den yttre randen av den yttre märgen samt uppsamlingskanalen i cortex och den inre randen av den yttre medullan bestämdes med hjälp av standardtekniker för punkträkning som tidigare beskrivits (20–22, 41) ).

Kvantitativ immunhistokemi

Kvantitativ immunhistokemi utfördes som vi tidigare har beskrivit och validerat (20, 22, 33, 37, 42). Proximala tubulisegment studerades i sektioner märkta under identiska förhållanden i samma immunmärkningsexperiment av en observatör som var blind för behandlingsgruppen. De specifika proximala tubulisegmenten som mättes var den initiala proximala hoprullade tubuli (PCT), definierad som PCT-segment kontinuerliga med Bowmans kapsel, den proximala raka tubuli (PST) i märgstrålen och PST i den yttre randen av den yttre medullan. Vi använde högupplösta digitala mikrofotografier tagna av slumpmässigt utvalda fält av njurbarken och den yttre randen av den yttre märgen med hjälp av ett Zeiss Axio Imager A2-mikroskop utrustat med en Axiocam 305 färgdigitalkamera och Zen 2.3-programvara (Zeiss) utan att använda tekniker för bildförbättring. . Med hjälp av programvaran ImageJ (v, 1.34j, National Institutes of Health, Bethesda, MD) mätte vi pixelintensitet över en rak linje som dras från tubulilumen genom en individuell cell. Dessa data analyserades sedan med hjälp av specialskriven programvara exekverad i Microsoft Excel 2016. Nettointensiteten vid varje pixel på linjen bestämdes sedan som skillnaden mellan absolut intensitet och genomsnittlig bakgrundspixelintensitet uppmätt utanför cellen. Totalt cellulärt uttryck bestämdes genom att integrera nettopixelintensitet över hela cellen. Cellhöjden bestämdes som avståndet i pixlar mellan de apikala och basolaterala kanterna på cellerna och omvandlades till absolut längd med användning av kalibrerad bestämning av individuell pixelstorlek. Ett minimum av 15 individuella celler från minst fyra mikrofotografier från varje njure analyserades. Data från alla undersökta celler av en given proximal tubulussegmenttyp togs som medelvärde för att ge en enda datapunkt per djur för statistisk analys.

Vi bestämde oss för att typ A interkalerad cellstorlek och cellspecifikt proteinuttryck som tidigare beskrivits (20, 22). Kortfattat erhöll vi digitala mikrofotografier med hög effekt av den inre randen av den yttre medulla av vävnadssnitt som hade genomgått immunhistokemi för den interkalerade cellspecifika markören Rhbg eller Rhcg. Individuella interkalerade celler omskrevs med hjälp av ImageJ-mjukvara (v. 1.34j, National Institutes of Health). Cellstorleken bestämdes som antalet pixlar inom de skisserade områdena och omvandlades till området med användning av kalibrerad mätning av pixlar per mikrometer. Immunolabelintensiteten vid varje pixel bestämdes som skillnaden mellan absolut pixelintensitet och genomsnittlig bakgrundsintensitet, och encellsimmunmärkningsintensitet bestämdes genom att integrera nettopixelintensiteten i cellen med hjälp av specialskriven programvara som körs i Microsoft Excel 2016.

cistanche behandla njursjukdom för att öka den sexuella förmågan

RESULTAT

Verifiering av njurspecifik AR-radering

AR farmakologisk blockering eller global deletion inducerar en mängd olika fenotypiska förändringar (43), som indirekt kan förändra njurstrukturen och ammoniaksvaren. För att undvika dessa problem genererade vi KS-AR-KO-möss med Cre loxP-tekniker. Vi bekräftade effektiviteten av renal AR-deletion med hjälp av immunhistokemi (Fig. 1). Hos WT-möss visade immunhistokemi nukleär AR-immunmärkning begränsad till den proximala tubuli; detta liknade våra fynd i den normala musnjuren (22). I KO-njuren fanns det ingen detekterbar AR-immunmärkning i något av könet (fig. 1). Dessa fynd visar genereringen av möss med renal AR-deletion.

statistisk analys med SPSS-programvara (26.2) och Microsoft Excel 2016.

Eftersom testosteron har många extrarenala effekter, som möjligen indirekt kan förändra njursyra-basmekanismer, övervägde vi möjligheten att KS-AR-KO kunde förändra plasmatestosteron- eller östradiolnivåerna. Plasmakoncentrationerna av testosteron och östradiol skilde sig dock inte signifikant mellan WT- och KO-möss i något av könet (tabell 2).

Fysiologisk karakterisering av njurspecifik AR-deletion Kroppsvikten var högre hos WT-hanmöss än i WT-honmöss trots att det inte fanns någon könsskillnad i födointag, som tidigare rapporterats (22), i överensstämmelse med kända extrarenala effekter av sex på kroppsvikten. KS-AR-KO förändrade dock inte dagligt födointag eller kroppsvikt hos något av könet (tabell 2).

Njurvikten var signifikant högre hos WT-hanmöss än hos WT-honmöss (Fig. 2), liknande vad vi tidigare har rapporterat hos normala möss (22). KS-AR-KO minskade signifikant njurvikten hos KS-AR-KO-hanmöss, till den grad att KS-AR-KO njurvikten av hankön inte skilde sig signifikant från kvinnlig WT eller KS-AR-KO njurvikt (Fig. 2). . Hos honmöss förändrade KS-AR-KO inte njurvikten signifikant. Effekten av sex på njurvikten kräver således AR-uttryck i den manliga njuren.

Varken plasma Naþ, K þ, eller bikarbonatkoncentrationer skilde sig signifikant mellan WT- och KS-AR-KO-möss för något av könen (tabell 2). Ureaclearance, använd som en markör för glomerulär filtrationshastighet, skilde sig inte signifikant mellan WT- och KS-AR-KO-möss i något av könet (tabell 2).

Netto syrautsöndring

Nettoutsöndring av syra involverar två processer: utsöndring av ammonium (NH4þ ) och utsöndring av titrerbar syra. Hos hanmöss ökade KS-AR-KO ammoniakutsöndringen signifikant, vilket eliminerade könsskillnaden i ammoniakutsöndring (Fig. 2). Ammoniakutsöndring förändrades inte signifikant hos honmöss av KS-AR-KO. Titrerbar syrautsöndring förändrades inte signifikant av KS-AR-KO hos något av könen (tabell 2). Urin-pH sänktes signifikant av KS-AR-KO i hanmöss men inte i honmöss (tabell 2); dock kvarstod effekten av KS-AR-KO på ammoniakutsöndring efter statistisk bedömning av urinens pH (P < 0.001="" av="" anova).="" således="" förmedlar="" proximal="" tubuli="" ar="" könsskillnader="" i="" ammoniakutsöndring="" hos="" hanmöss,="" men="" dess="" deletion="" hade="" ingen="" signifikant="" effekt="" på="" ammoniakutsöndring="" hos="">

Effekt av njurspecifik AR-deletion på proximal tubulistruktur

Proximala tubuli står för en större andel av kortikal volym i den manliga njuren än i den kvinnliga njuren, och detta är testosteronberoende (20, 22). Således bestämde vi effekterna av KS-AR-deletion i han- och honmöss på proximal tubulistruktur. Genom att använda PEPCK-immunolabel som en proximal tubuli-specifik markör visade immunhistokemi kvalitativt att KS-AR-KO minskade andelen av cortex som var proximal tubuli (Fig. 3A). Kvantitativ analys, med användning av formella punkträkningstekniker (41), visade att KS-AR-KO signifikant minskade proximal tubulivolymdensitet i cortex hos män, vilket är parallellt med förändringen i njurvikt (Fig. 3B). Däremot ändrade KS-AR-KO inte den proximala tubulivolymdensiteten i hanmöss signifikant i den yttre remsan av den yttre märgen (Fig. 3B). Hos honmöss förändrade KS-AR-KO inte kvalitativt andelen av cortex som var proximal tubuli (Fig. 3A) och kvantitativt förändrade inte proximal tubuli volymdensitet i vare sig cortex eller yttre medulla (Fig. 3B). Könsskillnaden i kortikal proximal tubuli volymdensitet närvarande i WT möss var inte närvarande i KS-AR-KO möss. I den manliga njuren förmedlar AR således könsskillnaderna i proximal tubulivolymdensitet i cortex. I den yttre märgen verkar AR-uttryck inte påverka den proximala tubulivolymdensiteten hos något av könet.

Dessa förändringar i proximal tubulistruktur hos KS AR-KO-hanmöss verkar involvera förändringar i cellstorlek. Hos hanmöss minskade KS-AR-KO den proximala tubulicellshöjden signifikant i både PCT och kortikal PST, dvs i hela cortex (Fig. 3C). Cellhöjden i PST i den yttre märgen förändrades inte signifikant (Fig. 3C). Dessa resultat är parallella med fynden av volymdensitet. Njurspecifik AR-deletion hos honmöss förändrade inte den proximala tubulicellshöjden i vare sig PCT, kortikal PST eller PST i den yttre märgen, vilket är parallellt med bristen på effekt på volymdensitet och total njurstorlek i honnjuren (Fig. 2B).

Njurvikt, kortikal proximal tubulivolymdensitet och cellhöjd i PCT och kortikal PST var alla större i WT manliga njure än i WT kvinnliga njurar, vilket är parallellt med våra tidigare observationer (20, 22). Hos KS-AR-KO-hanmöss existerade inte längre denna könsskillnad, och var och en av dessa parametrar skilde sig inte signifikant från den som observerades i varken WT- eller KS-AR-KO-honmöss. Sålunda är könsskillnader i njurvikt, kortikal proximal tubulivolymdensitet och cellhöjd i PCT och kortikal PST beroende av AR-uttryck.

Effekt av njurspecifik AR-deletion på uppsamlingskanalstruktur

Det finns viktiga könsskillnader i uppsamlingskanalen, där volymdensiteten för uppsamlingskanalen är större i andelen av cortex eller yttre medulla som samlade kanal hos antingen han- eller honmöss (Fig. 4A). Kvantitativ morfometrisk analys visade att KS-AR-KO inte förändrade uppsamlingskanalvolymdensiteten signifikant i vare sig cortex eller yttre medulla i något av könet (Fig. 4B). Således förmedlar njur-AR inte den sexuella dimorfismen vid uppsamling av kanalvolymdensitet.

Ammoniagens enzymuttryck Resultaten i nettosyrautsöndring visar att njurspecifik AR-deletion ökar ammoniakutsöndringen hos hanmöss även om den minskar den proximala tubulivolymdensiteten och cellhöjden i cortex. Detta indikerar att effekterna på ammoniakutsöndringen inte enbart kan tillskrivas proximal tubulihypertrofi som leder till ökad ammoniakbildning och istället är resultatet av separata och specifika effekter på ammoniakbildning och/eller ammoniaktransport. Därför undersökte vi nästa nyckelproteiner som är involverade i ammoniakgenerering och i ammoniaktransport.

PEPCK är ett nyckelenzym för proximalt tubulus som krävs för att skapa ammoniak och finns uteslutande i den proximala tubulus i njuren (16, 44). Hos hanmöss ökade KS-AR-KO kortikalt PEPCK-uttryck signifikant; det fanns ingen effekt av KS-AR-KO i honmöss (Fig. 5A). Ökningen av PEPCK-uttryck hos KS-AR-KO-hanmöss eliminerade könsskillnaden i WT-möss (Fig. 5A). Undersökning av PEPCK-immunmärkningsuttryck visade att KS-AR-KO-hanmöss hade större PEPCK-immunmärkningsintensitet i PCT och kortikala PST än WT-möss (fig. 5B). I den yttre randen av den yttre märgen fanns det ingen detekterbar skillnad i PEPCK-immunmärkningsintensitet (Fig. 5B). Kvantitativ immunhistokemi hos möss av hankön visade att KS-AR-KO ökade PEPCK-immunmärkningsintensiteten signifikant i både PCT och kortikal PST men inte i den yttre randen av den yttre medulla (Fig. 5C). Således, i hanmöss, men inte i honmöss, minskar proximal tubulus AR-uttryck PEPCK-uttryck i kortikala proximala tubulisegment, men inte i PST i den yttre märgen.

Den proximala tubulen har en ammoniakåtervinningsförmåga som involverar GS (37, 42, 45, 46). I varken han- eller honmöss förändrade KS-AR-KO signifikant GS-uttryck (Fig. 5D). Således verkar njur-AR inte modulera GS-uttryck.

Effekt av njurspecifik AR-deletion på NBCe1-uttryck

NBCe1 är ett proximalt tubulärt integrerat membranprotein med en viktig roll i reabsorption av filtrerat bikarbonat som också reglerar ammoniakmetabolism (47–49). Två splitsningsvarianter av NBCe1, NBCe1-A och NBCe1-B, finns i musnjuren (50, 51). Med hjälp av en pan-NBCe1-antikropp, som känner igen båda NBCe1-varianterna, fann vi att KS-AR-KO signifikant minskade kortikalt NCBe1-uttryck i den manliga, men inte kvinnliga, njuren (Fig. 6A).

Effekt av njurspecifik AR-deletion på ammoniaktransportörer Renal ammoniakutsöndring involverar koordinerad NH3/NH4þ-transport av specifika membranproteiner (10, 16, 52). Detta involverar transportörer i den proximala tubuli (NHE3), TAL i slingan av Henle (NKCC2), och uppsamling av duct immunolabel var inte detekterbar i yttre märg proximala tubuli segment (Fig. 6C), som tidigare rapporterats (48). Vi använde sedan kvantitativ immunhistokemianalys för att kvantifiera segmentspecifika förändringar i NBCe1-A-uttryck. Detta visade att KS-AR KO i hanmöss minskade NBCe1-A-uttryck i PCT och kortikal PST, dvs i hela cortex (Fig. 6D). Således reglerar AR-uttryck kortikala proximala tubuli NBCe1-Ett uttryck i den manliga njuren men inte i den kvinnliga njuren.

(Rhbg och Rhcg). Könsskillnader i ammoniakutsöndring korrelerar med skillnader i uttrycket för var och en av dessa (6, 20), och testosteron reglerar uttrycket av både NHE3 och NKCC2 (22). NKCC2 förmedlar TAL-ammoniakreabsorption (10, 16, 52). Hos hanmöss ökade KS-AR-KO NKCC2-proteinuttrycket med användning av immunoblotanalys signifikant; i honmöss fanns det ingen signifikant förändring (fig. 8). Denna förändring i uttryck i hanmöss bidrar sannolikt till förändrad medullär ammoniakshunting och underlättar därigenom effekten av KS-AR-KO för att öka ammoniakutsöndringen hos hanmöss.

Rh-glykoproteinerna Rhbg och Rhcg är de primära proteinerna som förmedlar uppsamling av ammoniakutsöndring i kanalen, och deras uttryck är generellt parallellt med förändringar i ammoniakutsöndring (10, 16, 52). Emellertid förändrade KS-AR-KO inte signifikant uttrycket av Rhbg-protein hos vare sig KS-AR-KO-hanmöss eller honmöss i vare sig cortex eller inre rand av den yttre märgen (Fig. 9). Effekterna på Rhcg-uttryck var liknande. Rhcg-immunhistokemi, utvärderad kvalitativt och med användning av kvantitativ immunhistokemi, visade inga signifikanta förändringar i Rhcg-immunomärkt intensitet i interkalerade celler i den yttre randen av den yttre märgen i något av könet (fig. 10). Således verkar inte renal AR modulera varken Rhbg- eller Rhcg-uttryck.

DISKUSSION

Den aktuella studien ger viktig ny information om mekanismen för hur AR modulerar sexuella dimorfismer i njurarna. Eftersom AR har många extra-renala roller, vilket kan komplicera förståelsen av dess roll i njuren, skapade vi den första KS-AR-KO-musen. KS-AR-KO hos möss av hankön ökade ammoniakutsöndringen, men minskade den totala njurstorleken, den proximala tubulivolymdensiteten och den proximala tubulicellshöjden, vilket eliminerade tidigare identifierade könsskillnader. Uttrycket av flera nyckelproteiner (PEPCK och NKCC2) involverade i ammoniakhantering ökades av KS-AR-KO, vilket sannolikt bidrar till den ökade ammoniakutsöndringen. Samtidigt minskade uttrycket av andra proteiner (NHE3 och NBCe1-A), vilket tenderar att trubba förändringar i ammoniakutsöndringen. KS-AR-KO hade ingen detekterbar effekt i honmöss eller i uppsamlingskanalen av något av könet. Tabell 3 visar dessa effekter. Dessa fynd tyder på att njurammoniakhantering och proximal tubulistruktur involverar njur-AR-beroende signalvägar i cortex av den manliga njuren men inte den kvinnliga njuren och inte i den yttre märgen av något av könen.

Det första stora fyndet i denna studie är att AR-uttryck medierar könsskillnader i njurstorlek. Tidigare studier på människor, råttor och möss har visat att den manliga njuren är större än honnjuren (3, 56, 57). Det första beviset på att detta involverade en testosteronberoende signalväg var observationen att överskott av androgenadministrering kvalitativt ökade råttans proximala tubulistorlek (57). Ytterligare bevis hos vuxna män tyder på att det finns en dosberoende ökning av njurvolymen, med en uppskattad ökning på 4.04-cm3 per 100 mg testosterontillskott per vecka (58). Vi har nyligen visat att hanmöss har större njur- och proximal tubulistorlek än honmöss (20, 22) och att dessa skillnader var testosteronberoende (22). I överensstämmelse med dessa tidigare fynd visar den aktuella studien att hos hanmöss reglerar njur-AR-uttryck både hela njurarna och den proximala tubulistorleken. Dessutom resulterar KS-AR-KO i att manlig njurstorlek är densamma som hos kvinnor med intakt AR-uttryck. Hos hanmöss kan testosteron som verkar genom njur-AR-beroende signalvägar helt och hållet förklara den sexuella dimorfismen i njurarna och den proximala tubulistorleken.

Det andra stora fyndet är att könsbaserade skillnader i ammoniakutsöndring medieras genom AR-beroende vägar hos hanmöss. Våra tidigare studier visade att honmöss utsöndrar ungefär dubbelt så mycket ammoniak i urinen som möss av hankön (20–22), använder olika reaktionsvägar för att svara på syraladdning (21) och att skillnaden i basal ammoniakutsöndring involverar ett testosteronberoende mekanism (22). Den aktuella studien utökar dessa fynd genom att visa att KS-AR-KO eliminerar sexuell dimorfism i ammoniakutsöndring. Förändringar i dietfixerade syramängder kan förändra ammoniakutsöndringen, men förändringar i ammoniakutsöndring hos möss med AR-deletion kan inte tillskrivas denna mekanism eftersom KS-AR-KO inte förändrade födointaget. De flesta förändringar som sker i ammoniakmetabolismen, såsom sker vid metabol acidos eller hypokalemi, resulterar i förändringar i njurarnas och proximala tubulistorlek som parallellt med ammoniakutsöndringen (59–61). Emellertid har hanmöss med renal AR-deletion ökad ammoniakutsöndring men minskad total njurstorlek och proximal tubulistorlek, vilket indikerar att effekten på ammoniakutsöndring inte är ett ospecifikt svar på förändringar i njurmassan. Denna inkongruenta njurstorlek och ammoniaksvar som svar på renal AR-deletion liknar fynden i våra tidigare studier med en gonadektomimodell som utvärderade effekten av testosteron (22). Hos hanmöss reglerar testosteron som verkar genom renal AR hos hanar ammoniakutsöndring genom vägar som inte är relaterade till effekter på njurstorlek, proximal tubulistorlek och endogen syrabelastning relaterad till födointag.

Huvuddelen av ammoniakgenereringen sker i den proximala tubuli. Vårt tidigare arbete har identifierat sexuella dimorfismer i generering av proximal tubuli ammoniak som är beroende av testis-härledd testosteron (22). Resultaten av den föreliggande studien utökar dessa fynd ytterligare genom att visa att renal AR hos hanmöss reglerar uttrycket av det ammoniakgenererande enzymet PEPCK men inte ammoniakåtervinningsenzymet GS. Denna effekt på PEPCK-uttryck är inte en ospecifik effekt relaterad till förändringar i proximal tubulistorlek, eftersom effekterna av renal AR-deletion på proximal tubulistorlek är motsatsen till dess effekter på PEPCK-uttryck. Dessutom visar upptäckten att renal AR-deletion inte förändrar GS-uttrycket att GS regleras genom mekanismer som skiljer sig från de som används för PEPCK.

Ammoniak som produceras i den proximala tubuli utsöndras företrädesvis i luminalvätskan genom en apikal NHE3-beroende mekanism (54, 55). Tidigare studier har visat att förlust av testosteron minskar uttrycket av NHE3 (22, 62). Resultaten av föreliggande studie utökar dessa fynd ytterligare genom att visa att renal AR-deletion hos hanmöss minskar uttrycket av NHE3. Således verkar testosteron som verkar genom AR-aktivering öka kortikal proximal tubulus NHE3-uttryck. Det är dock viktigt att inse att dessa effekter inte går parallellt med ammoniakutsöndring och istället förutsägs minimera de observerade förändringarna i ammoniakutsöndring. Istället, eftersom NHE3 också är kritisk för filtrerad NaCl och vattenreabsorption, kan dessa effekter bidra till den större proximala tubuli-NaCl-reabsorptionen hos män (6, 7).

Ammoniakreabsorption i TAL etablerar den interstitiella ammoniakgradient som är nödvändig för att samla upp ammoniakutsöndring i kanalen (63, 64). Tidigare studier från vår grupp har visat att NKCC2-uttryck är större hos möss av honkön än hos möss av hankön (20–22), att det finns sexuell dimorfism i svaret av NKCC2 på syraladdning (21), och att skillnaden i basalt uttryck av NKCC2 involverar en testosteronberoende mekanism (22). Den aktuella studien visar att förlust av renal AR hos hanmöss ökade NKCC2-expression. Storleken på denna effekt var nästan identisk med skillnaden vi har identifierat mellan han- och honmöss (20, 21) och i den aktuella studien eliminerade den sexuella dimorfismen av NKCC2-uttryck. Dessutom, den identifierade skillnaden mellan hanmöss med intakt renal AR och AR-deletion parallellt med våra tidigare identifierade skillnader mellan hanmöss med orkiektomi jämfört med intakta och skenopererade kontroller (24). Således verkar testosteron som verkar genom AR förmedla den sexuella dimorfismen i NKCC2-uttryck. Denna reglering verkar dock vara indirekt, eftersom det inte fanns något detekterbart AR-uttryck i TAL i varken vår tidigare rapport (22) eller i den aktuella studien. En möjlig indirekt mekanism som förklarar denna observation är att hos män leder AR-deletion till minskad proximal tubulistorlek som i kombination med minskad proximal tubuli NHE3-uttryck ökar ökad leverans av lösta ämnen till TAL, vilket stimulerar NKCC2-uttryck.

Utsöndring av ammoniak i kanalen är den huvudsakliga bestämningsfaktorn för ammoniakutsöndring i urinen, och Rh-glykoproteinerna Rhbg och Rhcg är de primära transportörerna för ammoniak i kanalen (16, 65–68). Vi har tidigare visat sexuella dimorfismer vid insamling av kanalvolymdensitet och uttryck av Rh-glykoproteiner, med honmöss som har större uppsamlingskanalvolymdensitet, interkalerad cellstorlek och Rhbg- och Rhcg-uttryck (20). Den aktuella studien fann inga detekterbara förändringar i uppsamlingskanalvolymdensitet eller Rhbg- och Rhcg-uttryck som svar på KS-AR-KO hos varken han- eller honmöss. Detta är parallellt med bristen på effekt av testosteronbrist, inducerad av orkiektomi, på insamling av kanalvolymdensitet, interkalerad cellstorlek och Rhbg- och Rhcg-uttryck (22). Vi drar slutsatsen att den sexuella dimorfismen i uppsamlingskanalen sker genom mekanismer som inte involverar testosteron och AR-beroende signalvägar.

Den yttre märgen verkar reagera annorlunda på kön, testosteron och AR än cortex. Till skillnad från njurbarken, i den yttre märgen, finns det ingen sexuell dimorfism i proximal tubulivolymdensitet eller proximal tubulihöjd (20), ingen effekt av orkiektomi-inducerad testosteronbrist på dessa parametrar (22) och ingen effekt av njurarna. AR-deletion (nuvarande studie). Denna brist på effekt av sex, testosteron och AR-uttryck beror inte på frånvaron av AR-uttryck, eftersom vi har visat AR-uttryck genom hela den proximala tubuli, inklusive i den yttre medulla (22). Att förstå mekanismerna bakom denna axiella skillnad i den proximala tubulusresponsen på kön, testosteron och AR kommer att vara en viktig väg för framtida undersökningar.

En sista observation är att AR-deletion inte hade detekterbara effekter på den kvinnliga njuren. AR finns i hela den proximala tubulus hos båda könen, och även om den uttrycks på lägre nivåer hos kvinnor, var den absoluta skillnaden i uttryck endast - 50 procent (22). Delvis kan bristen på effekt av AR-deletion indikera minskad AR-aktivering genom att cirkulera testosteron, vilket är, som visas i föreliggande studie, väsentligt mindre hos kvinnor än hos män. Emellertid indikerar immunhistokemi betydande nukleär AR-lokalisering i den kvinnliga njuren (Ref. 22 och nuvarande studie), vilket typiskt indikerar aktivering av AR-beroende signaleringsprocesser. Dessa observationer tyder på möjligheten att andra könsberoende skillnader försämrar AR-beroende signalmekanismer i den kvinnliga proximala tubuli.

Perspektiv och betydelse

En bättre förståelse av mekanismen och de biologiska implikationerna av sexs effekt på njurstrukturen och ammoniakmetabolismen är avgörande för att optimera vår förmåga att ta hand om både män och kvinnor med syra-basrubbningar. Trots de senaste framstegen i vår förståelse av effekten av sex på ammoniakmetabolism och rollen av renal AR, behövs ytterligare studier. Det finns säkert testosteronoberoende effekter av sex, vars mekanism är ofullständigt förstådd för närvarande. Huruvida detta involverar direkta effekter av andra könssteroidhormoner, såsom östrogener eller progesteron, indirekta effekter av proximal tubuli AR-aktivering eller effekter av könskromosomer som är oberoende av gonadala hormoner kommer att vara viktiga frågor för framtida studier att ta itu med.

cistanche lindrar njurproblem och förstärker knjurfunktion

TACK

Vi tackar Dr Sharon W. Matthews och Chao Chen (University of Florida, College of Medicine Electron Microscopy Core Laboratory) för utmärkt vävnadsbearbetning för våra immunhistokemiska experiment. Vi tackar University of Virginia School of Medicine Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core för mätning av serumtestosteronnivåer. Vi tackar Dr Gail Prins för att ha levererat anti-AR-antikroppar och för deras expertis inom AR.

UPPLYSNINGAR

Inga intressekonflikter, ekonomiska eller andra, deklareras av författarna.

FÖRFATTARBIDRAG

ANH och IDW skapade och designade forskning; ANH, RAC, H.-WL och JWV utförde experiment; ANH, RAC, H.-WL, JWV och IDW analyserade data; ANH, RAC, JWV och IDW tolkade resultat av experiment; ANH förberedda siffror; ANH utarbetade manuskriptet; ANH, RAC, H.-WL, JWV och IDW redigerade och reviderade manuskriptet; ANH, RAC, H.-WL, JWV och IDW godkände den slutliga versionen av manuskriptet.

REFERENSER

1. Institutet för medicin Kommittén för förståelse av biologin av kön och genus D; Wizemann TM, Pardue ML (Redaktörer). Utforska de biologiska bidragen till människors hälsa: spelar sex roll? Washington, DC: National Academies Press, 2001. doi:10.17226/ 10028.

2. Karp NA, Mason J, Beaudet AL, Benjamini Y, Bower L, Braun RE, et al. Prevalens av sexuell dimorfism i däggdjurs fenotypiska egenskaper. Nat Commun 8: 15475, 2017. doi:10.1038/ncomms15475.

3. Sabolić I, Asif AR, Budach WE, Wanke C, Bahn A, Burckhardt G. Könsskillnader i njurfunktion. Pflugers Arch 455: 397–429,b2007. doi:10.1007/s00424-007-0308-1.

4. Ramirez LA, Sullivan JC. Könsskillnader vid högt blodtryck: var vi har varit och vart vi är på väg. Am J Hypertens 31: 1247–1254,2018. doi:10.1093/ajh/hpy148.

5. Layton AT, Sullivan JC. Nya framsteg i könsskillnader i njurfunktion. Am J Physiol Renal Physiol 316: F328–F331, 2019. doi:10.1152/ajprenal.00584.2018.

6. Veritas LC, Girardi ACC, Curry J, Pei L, Ralph DL, Tran A, Castelo-Branco RC, Pastor-Soler N, Arranz CT, Yu ASL, McDonough AA. Det sexuella dimorfa mönstret av njurtransportörer och elektrolythomeostas. J Am Soc Nephrol 28: 3504–3517, 2017. doi:10.1681/ASN.

7. Li Q, McDonough AA, Layton HE, Layton AT. Funktionella implikationer av sexuell dimorfism av transportmönster tillsammans med råttans proximala tubuli: modellering och analys. Am J Physiol Renal Physiol 315: F692–F700, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00171.2018.

8. Mitch WE. Metaboliska och kliniska konsekvenser av metabol acidos. J Nephrol 19 Suppl 9: S70–S75, 2006.

9. Hamm LL, Nakhoul N, Hering-Smith KS. Syra-bas homeostas. Clin J Am Soc Nephrol 10: 2232–2242, 2015. doi:10.2215/ CJN.07400715.

10. Weiner ID, Mitch WE, Sands JM. Urea- och ammoniakmetabolism och kontroll av renal kväveutsöndring. Clin J Am Soc Nephrol 10: 1444–1458, 2015. doi:10.2215/CJN.10311013.

11. Fel O, Davies HE. Utsöndringen av syra vid njursjukdom. QJ Med 28: 259–313, 1959.

12. Baertl JM, Sancetta SM, Gabuzda GJ. Relation av akut kaliumutarmning till renal ammoniummetabolism hos patienter med cirros. J Clin Invest 42: 696–706, 1963. doi:10.1172/JCI104761.

13. Maher T, Schambelan M, Kurtz I, Hunter HN, Jones JW, Sebastian A. Förbättring av metabolisk acidos genom dietkaliumrestriktion hos hyperkalemiska patienter med kronisk njurinsufficiens. J Lab Clin Med 103: 432-445, 1984.

14. Shear L, Gabuzda GJ. Kaliumbrist och endogen ammoniumöverbelastning från njuren. Am J Clin Nutr 23: 614–618, 1970. doi:10.1093/acne/23.5.614. F642 AJP-Renal Physiol doi:10.1152/ajprenal.00260.2021 www.ajprenal.org

15. Tannen RL, McGill J. Influens av kalium på renal ammoniakproduktion. Am J Physiol 231: 1178–1184, 1976. doi:10.1152/ajplegacy. 1976.231.4.1178.

16. Weiner ID, Verlander JW. Ammoniaktransportörer och deras roll i syra-basbalansen. Physiol Rev 97: 465–494, 2017. doi:10.1152/ physrev.00011.2016.

17. Kovesdy CP, Anderson JE, Kalantar-Zadeh K. Sammanslutning av serumbikarbonatnivåer med mortalitet hos patienter med icke-dialysberoende CKD. Nephrol Dial Transplant 24: 1232–1237, 2009. doi:10.1093/ndt/gfn633.

18. Navaneethan SD, Schold JD, Arrigain S, Jolly SE, Wehbe E, Raina R, Simon JF, Srinivas TR, Jain A, Schreiber MJ Jr, Nally JV Jr. Serumbikarbonat och dödlighet i stadium 3 och stadium 4 kronisk njursjukdom . Clin J Am Soc Nephrol 6: 2395–2402, 2011.

19. Raphael KL, Murphy RA, Shlipak MG, Satterfield S, Huston HK, Sebastian A, Sellmeyer DE, Patel KV, Newman AB, Sarnak MJ, Ix JH, Fried LF; Hälsa ABC-studie. Bikarbonatkoncentration, syra-basstatus och dödlighet i studien om hälsa, åldrande och kroppssammansättning. Clin J Am Soc Nephrol 11: 308–316, 2016.

20. Harris AN, Lee HW, Osis G, Fang L, Webster KL, Verlander JW, Weiner ID. Skillnader i njurammoniakmetabolism i manliga och kvinnliga njurar. Am J Physiol Renal Physiol 315: F211–F222, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00084.2018.