Förbättring av utsläckningsminne genom farmakologiska och beteendemässiga interventioner riktade mot dess reaktivering

För mer information:ali.ma@wecistanche.com

how to improve memory

Förbättring av utrotningminnegenom farmakologiska och beteendemässiga interventioner riktade mot dess reaktivering

Josué Haubrich, Adriano Machado, Flávia Zacouteguy Boos, Ana P. Crestani, Rodrigo O. Sierra, Lucas de Oliveira Alvares & Jorge A. Quillfeldt

Extinktion är en process som involverar ny inlärning som hämmar uttrycket av tidigare förvärvade minnen. Även om det är tillfälligt effektivt, raderar utrotning inte en ursprunglig rädslaassociation. Eftersom utrotningsspåret tenderar att blekna med tiden, kommer originaletminnekan återuppstå. Å andra sidan har förstärkande effekter beskrivits i flera rekonsolideringsstudier med olika beteendemässiga och farmakologiska manipulationer. För att veta om ett utsläckningsminne kan stärkas genom reaktiveringsbaserade interventioner i den kontextuella rädslakonditioneringsuppgiften, började vi med att replikera det klassiska fenomenet spontant återhämtning för att visa att korta återexponeringssessioner kan förhindra förfallet av utrotningsspåret över tid i ett långvarigt sätt. Denna rädsla dämpning visade sig bero både på L-typ kalciumkanaler och proteinsyntes, vilket tyder på en rekonsolideringsprocess bakom den reaktiveringsinducerade stärkande effekten. Extinktionsspåret var också känsligt för förstärkning genom en infusion efter reaktivering av enminne-förstärkande läkemedel (NaB), som också kunde förhindra snabb återhämtning av rädsla (besparingar). Dessa fynd pekar på nya reaktiveringsbaserade tillvägagångssätt som kan stärka ett utrotningsminne för att främja dess uthållighet. De konstruktiva interaktionerna mellan utrotning och återkonsolidering kan representera ett lovande nytt tillvägagångssätt inom området för behandlingar av rädslarelaterade störningar.

the best herb for memory

Klicka till Cistanche och Cistanches för minne

Minneretrieval är ett dynamiskt fenomen som, givet de rätta förutsättningarna, kan utlösa två distinkta processer, rekonsolidering eller extinktion. Efter ett kort hämtningspass i samma träningssammanhang, en tidigare konsolideradminnekan komma in i ett labilt tillstånd som kräver de novo proteinsyntes för att återstabilisera och bestå, en process som kallas rekonsolidering1. Men långvariga, icke-förstärkta hämtningssessioner kan inducera utrotning2. Även om återkonsolidering av rädslaminnen har studerats omfattande3, 4, har mycket få studier hittills undersökt möjligheten att ett utdöendespår skulle genomgå rekonsolidering efter återhämtning5–7, och dess möjliga resultat och kliniska tillämpningar är för närvarande outforskade8.

Extinktion minskar betingade svar genom en process som innebär konsolidering av en ny hämmandeminne; det anses inte vara avlärning eller radering av det ursprungliga spåret9, 10. Utrotningsbaserade terapier används vanligtvis för att förhindra aversiva reaktioner hos patienter med rädslarelaterade störningar som posttraumatisk stressyndrom11, 12. Trots att det är en effektiv intervention, återfall av rädslasymtom rapporteras ofta13, vilket visar att, jämfört med robusta rädslaminnen, är utrotning mindre bestående och benägen att förfalla. Rädslareaktioner kan lätt återhämta sig på grund av flera återfallsprocesser, såsom spontant tillfrisknande, återställande, förnyelse och snabb återhämtning14, 15. Följaktligen är det av stor vikt att hitta bättre tillvägagångssätt för att förbättra utrotningsstyrka och uthållighet.

Trots att både rekonsolidering och utrotning utlöses av hämtning, är de distinkta processer. Beteendemässigt är rekonsolidering vanligtvis engagerad av korta exponeringar för den betingade stimulansen (CS) medan utrotning kräver längre. Dessutom moduleras induktionen av rekonsolidering av andra kontextuella och kognitiva faktorer som kollektivt kallas randvillkor16. Genom att variera exponeringstiden för CS kommer det anamnestiska medlet selektivt att försämra antingen rekonsolideringen av det ursprungliga spåret eller konsolideringen.

Psykobiologi och neuroberäkningslabb och neurobiologi avMinnelabb. Neurosciences Graduate Program, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, PortoAlegre, Brasilien. Korrespondens och förfrågningar om material ska adresseras till JH (e-post: biohaubrich@gmail.com) eller JAQ (e-post: quillfe@ufrgs.br) för utsläckningsspåret17–23. Det faktum att båda processerna inte äger rum samtidigt antyder en spårdominanseffekt, genom att det dominerande spåret kommer att vara det första, om inte det enda, som påverkas av någon interferens. Spårdominans uppstår också när tidigare konsoliderade rädsla och utrotningsspår samexisterar, vilket påverkar deras hämtning. Under sådana förhållanden kommer återexponering för CS, som potentiellt kan aktivera både rädsla och utrotningsspår, att resultera i uttrycket av det dominerande minnet och i hämning av det andra2. Som diskuterats ovan är utrotning till en början dominerande och undertrycker lätt rädsla. Men med tiden övervinner det ursprungliga rädslaspåret hämningen genom utplåning och blir dominerande uttryckt igen14. Dessutom finns det en dubbel dissociation mellan de två processerna avseende molekylära markörer som Zif26824, calcineurin19, 25 och BDNF26, vilket indikerar att båda processerna inte sker parallellt.

Det föreslås ofta att den funktionella rollen för destabiliserings-restabiliseringsprocessen bakom rekonsolidering är att tillåtaminneatt uppdatera för att behålla sin prediktiva och adaptiva relevans3, 27–29. Till exempel,minneinnehållet kan uppdateras genom att införliva ny information30–34 . Dessutom rapporterade flera studier att rekonsolidering kan förmedlaminneförbättring och förstärkning30, 35–39 samt minnesdämpning (utan utrotning) av aversiva upplevelser34, 40 . Intressant nog finns det studier som visar att i vissa uppgifter sker rekonsolidering endast när minnet ännu inte är på en asymptotisk nivå41–43, vilket ytterligare belyser dess roll i stärkandet av minnesspåret. Än så länge är det dock okänt om ett konsoliderat utrotningsspår kan modifieras genom rekonsolidering.

Rekonsolidering kan öppna ett fönster för att möjliggöra farmakologisk modulering av de reaktiverademinne. Detta skulle vara parallellt med klassiska experiment där infusion av amnestiska medel efter reaktivering försämrar minnet1, eller åtminstone effektivt minskar rädslareaktioner vid fobier44. Dessutom kan interventioner efter reaktivering som främjar rekonsolidering leda till förbättrad prestanda45–47. Därför administreras specifika föreningar under fönstret avminnelabilitet under rekonsolidering möjliggör positiv eller negativ modulering avminnestyrka.

enhance memory herbs

Med tanke på dess kliniska relevans finns det ett stort intresse för utvecklingen av mer effektiva utrotningsbaserade metoder48. Utsläckningsminnen är effektiva för att övergående undertrycka rädslareaktioner men rädslan återkommer lätt2. Härstammar från det faktum att den återvinningsdrivna processen av rekonsolidering kan leda tillminnestärkande, antingen beteendemässigt30, 35–39 eller farmakologiskt45–47, antar vi att om en utrotningminnereaktiveras kan den genomgå en rekonsolideringsprocess och moduleras positivt av beteendemässiga och farmakologiska ingrepp, vilket resulterar i ökad resistens mot återfall.

För att verifiera detta utvärderade vi effekten av korta återexponeringar för det betingade sammanhanget hos djur som tidigare tränats i kontextuell rädslakonditionering (CFC) och utsatts för utrotning. Vi fann att spontan återhämtning observerades 2 veckor efter utrotning, men periodiska reaktiveringssessioner kunde fördröja uppkomsten av skräckspår i minst 4 veckor. Denna effekt visade sig bero på spänningsstyrda kalciumkanaler av L-typ (L-VGCC), och en reaktivering en dag efter extinktionssessionen visade sig orsaka att extinktionsspåret tillfälligt blev labilt på ett proteinsyntesberoende sätt. Sammantaget tyder uppgifterna starkt på en rekonsolideringsprocess som verkar på utrotningsspåret. I ett protokoll som använts för att undersöka rädslas snabba återförvärv – en annan återfallsprocess efter utdöende49 - kunde en enda infusion efter reaktivering av natriumbutyrat (NaB), en HDAC-hämmare som positivt reglerar neuronal plasticitet50, förbättra utdöendeminnetill den grad att motstå rädsla återhämtning. Bevisen visar att utrotningsspåret effektivt kan stärkas genom reaktiveringsbaserade interventioner.

Experiment 1: Utrotningminnehämmar endast övergående uttryck av rädsla. Extinktion är ny inlärning som tillfälligt undertrycker en tidigare förvärvadminne. Sålunda, efter utrotning, existerar två motsatta minnen samtidigt och tävlar om uttryck. Inledningsvis är utsläckningsminnet dominant över skräckspåret och kan därmed hämma dess uttryck. Detta undertryckande är dock inte permanent. När tiden går övervinner rädslaminnet utrotningshämning och aversiva beteendereaktioner återkommer. Denna process kallas spontan återhämtning15. Först bedömde vi den tidsmässiga profilen för spontan återhämtning i vårt CFC-protokoll. Följaktligen var djuren rädsla och genomgick 24 timmar senare utrotningsträning. Nästa dag genomfördes en testsession för att utvärdera utrotningsretention. Ett andra test utfördes 7, 14, 21 eller 28 dagar senare för att bedöma spontan återhämtning (Fig. 1A).

Under utrotningssessionen avtog frysningsnivåerna med tiden i alla grupper, vilket indikerar utsläckning (Repeated-measures ANOVA, F(5,140)=13.625, P=0.001; Fig. 1B) . Vid test 1 uppvisade djuren låga frysningsnivåer, vilket tyder på utrotningsretention (Fig. 1C). För att bedöma spontan återhämtning jämfördes prestanda vid test 1 och test 2 med en ANOVA med upprepade mätningar, som visade en signifikant grupp x sessionsinteraktion (Repeated-measures ANOVA, F(3,27)=8.085, P { {18}}.0005). Tukeys post-hoc visade att det var signifikant återhämtning av rädslareaktioner endast i grupper där test 2 utfördes antingen 21 (P=0.013) eller 28 dagar (P=0.0002) efter test 1, men inte tidigare (7 dagar: P=0.999; 14 dagar: P=0.969; Fig. 1C).

Resultaten illustrerar den väl beskrivna15 tidsberoende spontana återhämtningen av rädslaminneefter utrotning. I vårt protokoll undertrycker utrotningsminne rädslasvar i minst 14 dagar. Efter 14 dagar kan spontan återhämtning av rädsla ske. Följaktligen, även om det initialt dominerar, försvinner minnet av utrotning med tiden, vilket möjliggör återupplivandet av uttryck av rädsla.

Experiment 2: Periodiska reaktiveringar av utsläckningsspår fördröjer dess tidsberoende sönderfall (spontan återhämtning). I experiment 1 fann vi att initialt utsläckningsminne är dominerande över aversivenminnespår, förhindrar dess uttryck. Denna effekt bleknar vid senare tidpunkter när utrotning inte längre kan undertrycka uttryck av rädsla. Det har rapporterats att återaktiveringssessioner kan leda tillminneförstärkning30, 36, 39. Eftersom utrotningsspåret avtar med tiden, förutspådde vi att dess återaktivering möjligen skulle resultera i dess förstärkning, vilket skulle förbättra dess uthållighet och förmåga att undertrycka rädsla vid avlägsna tidpunkter.

Figur 1. Utsläckningminnemisslyckas med att undertrycka rädsla permanent. (A) Schematisk representation av de experimentella förfarandena. Rädsla konditionerade råttor utsattes för 30-min utrotningssession och testades 24 timmar senare. Ett andra test utfördes 7, 14, 21 eller 28 dagar efter test 1 (N=6 /9 per grupp). (B) Frysnivåer under utrotningssessioner. (C) Frysnivåer under tester. (*) En signifikant skillnad mellan test 1 och 2 (P<0.05, repeated-measures="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="">

Följaktligen genomgick rädslakonditionerade råttor utrotningsträning, testades 1 dag senare och testades om 28 dagar senare för spontan återhämtning. Under intervallet mellan test och omtest genomgick en grupp djur 3-min reaktiveringssessioner dagarna 7, 14 och 21 dagar efter test 1 (reaktiveringsgrupp) eller förblev i sina hemburar (kontrollgrupp; Fig. 2A) . En ytterligare grupp skickades till reaktiveringssessioner men ingen utsläckningsträning (ingen utsläckning plus återaktiveringsgrupp). 7-dagarsintervallet mellan reaktiveringar valdes eftersom, vid denna tidpunkt, utrotning fortfarande är starkt uttryckt (experiment 1).

Under utrotningsträning visade djuren effektivt en tidsberoende minskning av rädslareaktioner (F(5,110)=30.516, P=0.001; Fig. 2B). På test 1 var det signifikant skillnad mellan grupperna (F(2,28)=8.11, P=0.002; Fig. 2C). Tukeys post-hoc visade att kontroll- och återaktiveringsgrupper visade liknande frysningsnivåer (P=0.915) och båda visade lägre frysning än gruppen No extinction plus reactivation (P=0.007 och P { {21}}.001, respektive). Under reaktiveringssessioner visade ANOVA med upprepade åtgärder en signifikant skillnad mellan reaktivering och ingen utsläckning plus reaktiveringsgrupper (F(1,19)=46.63, P=0.0001) och ingen effekt av session (F) (2,38)=2.28, P=0.116) eller grupp x sessionsinteraktion (F(2,38)=1.00, P=0.376 Fig. 2D). Jämförelse mellan test 1 och test 2 avslöjade signifikant grupp x sessionsinteraktion (Repeated-measures ANOVA, F(2,28)=3.89, P=0.03). Tukey´s post-hoc visade att rädslan i reaktiveringsgruppen och i gruppen No extinction plus reaktivering inte förändrades från test 1 till test 2 (P=0.844), men det fanns en signifikant återhämtning av rädsla i kontrollgruppen (P=0.02). Viktigt är att frysningen av reaktiveringsgruppen var lägre än alla andra i test 2 (Reaktivering x Kontroll: P=0.007; Reaktivering x Ingen utsläckning plus reaktivering: P=0.0001; Fig. 2E). Detta visar att reaktivering stärkte utrotningenminneoch förhindrade på så sätt rädsla återhämtning vid en avlägsen tidpunkt. I detta protokoll hade reaktiveringssessioner i sig ingen effekt på rädslanivåer när ingen utsläckningsinlärning ägde rum.

Experiment 3 - Reaktiveringsinducerad förstärkning av utrotning beror på L-VGCC. För att framkalla rekonsolidering,minnemåste återaktiveras och gå in i ett labilt tillstånd. Tidigare arbeten har visat att aktivering av typ spänningsstyrda kalciumkanaler (L-VGCC) under reaktivering krävs för destabilisering, och deras blockering av nimodipin förhindrar rekonsolidering från att äga rum51. För att bedöma rollen av L-VGCC i den reaktiveringsinducerade förstärkningen av utrotning, upprepade vi den experimentella designen av det sista experimentet och administrerade nimodipin före reaktivering (Fig. 3A).

Under utrotningsträning visade djuren en tidsberoende minskning av rädslareaktioner (F(5,125)=13.55, P=0.001; Fig. 3B). I test 1 uppvisade djur från Vehicle- och Nimodipin-grupperna lika låga frysningsnivåer (Students t-test; t(25)=0.510, P=0.615; Fig. 3C). Under reaktiveringssessioner var det en signifikant grupp x sessionsinteraktion (F(2,50)=7.863, P=0.001; Fig. 3D) med nimodipinbehandlade djur som uppvisade ökad rädsla över sessioner (P=0.004), medan det inte fanns någon förändring i uttrycket av rädsla hos vehikelbehandlade råttor (P=0.983).

Vid det andra testet uppvisade nimodipinbehandlade råttor högre frysnivåer än kontroller (t(25)=5.44, P=0.0001; Fig. 3E). Genom att jämföra prestandan för båda testsessionerna fann en ANOVA med upprepade mätningar en signifikant grupp kontra sessionsinteraktion (F(1,20)=7.75, P=0.006). Tukeys post-har avslöjat att prestandan hos nimodipinbehandlade djur vid test 2 var högre än prestandan för alla andra grupper och sessioner (P < 0,001).="" detta="" visar="" att="" utsläckningsförbättring="" genom="" reaktiveringar="" kräver="">

Experiment 4: En enstaka utsläckningsspårreaktivering öppnar ett proteinsynteskänsligt fönster. Efter återaktivering,minnekan genomgå en fas som kräver att de novo proteinsyntesen återkonsolideras och kvarstår. I detta labila tillstånd är det således mottagligt för störningar av proteinsyntesinhibitorer1. I tidigare arbeten har det visat sig att utrotningenminneär mottaglig för rekonsolidering

Figur 2. Periodiska reaktiveringar förhindrar spontan återhämtning av utrotningminne. (A) Schematisk representation av de experimentella förfarandena. Rädsla-konditionerade råttor utsattes för 30-minst utrotningssessioner eller förblev i sina hemburar (ingen utrotning plus återaktiveringsgrupp: N=7). Ett test utfördes nästa dag och ett omtest 28 dagar senare. Under intervallet mellan testerna återaktiverades djuren med 3-min på dagarna 7, 14 och 21 efter test 1 eller förblev i sina hemburar (Extinction plus No reactivation group: N=10; Extinktion plus Reactivation group: N=14). (B) Frysnivåer under utrotningssessioner. (C) Frysnivåer under testet. (D) Frysnivåer under reaktiveringar. (E) Frysnivåer under omtest. (*) Signifikanta skillnader mellan grupper (P<0.05, two-way="" or="" repeated-measures="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="">

störning av interferens efter reaktivering i paradigmet för hämmande undvikande5, 6. Efter att ha använt återexponeringssessioner i tidigare experiment, utvärderade vi här om dessa återexponeringar faktiskt var reaktiveringssessioner som involverade rekrytering av proteinsyntes. Följaktligen var djuren betingade av rädsla och nästa dag genomgick en grupp utrotningsträning (utrotningsgrupp) medan andra stannade kvar i sina hemburar (grupp utan utrotning). På dag 2 efter träning genomgick alla djur en kort 3 min reaktiveringssession och omedelbart efter injicerades med proteinsyntesinhibitorn cykloheximid (CHX) eller dess vehikel. Följande dag testades djur (Fig. 4A).

Under utsläckningssessionen avslöjade en ANOVA med upprepade åtgärder utsläckningsförvärv (F(5,75)=24.08, P=0.001; Fig. 4B). Under reaktivering indikerade en tvåvägs ANOVA att djur som tidigare genomgick utrotning visade lägre frysningsnivåer jämfört med gruppen utan utrotning (F(1,43)=23.32, P=0. 001; Fig. 4C). Vid testet avslöjade en tvåvägs ANOVA en signifikant grupp x läkemedelsinteraktion (F(1,43)=22.64, P=0.001). Tukey´s post-hoc avslöjade att cykloheximidbehandlade djur i gruppen utan utrotning uppvisade lägre frysnivåer än vehikelbehandlade (P=0.01), vilket tyder på att rädslaminnevar nedsatt. I utrotningsgruppen,

Figur 3. Reaktiveringsinducerad förstärkning av utsläckning bygger på spänningsstyrda kalciumkanaler av L-typ. (A) Schematisk representation av de experimentella förfarandena. Rädsla konditionerade råttor utsattes för 30-min utrotningssession. Ett test genomfördes nästa dag och ett omtest 28 dagar senare. Under intervallet mellan testerna återaktiverades djuren med 3-min på dagarna 7, 14 och 21 efter test 1. Nimodipin (N=15) eller dess vehikel (N=12) var sc. infunderas 30 minuter före varje reaktivering (B) Frysnivåer under utsläckningssession. (C) Frysnivåer under testet. (D) Frysnivåer under reaktiveringar. (E) Frysnivåer under omtest. (*) Signifikanta skillnader mellan grupper (P<0.05, two-way="" or="" repeated-measures="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="" test).="" chx-treated="" animals="" showed="" higher="" freezing="" levels="" than="" vehicle-treated="" ones="" (p="0.001)," indicating="" that="" extinction="">minnestördes.

Följaktligen, när ingen utsläckningsträning genomfördes, destabiliseras rädslaspåret genom reaktivering och störs av CHX. När minnen av utrotning och rädsla samexisterar sker en spårlig dominanseffekt och utsläckningenminneär den som lider av destabilisering, vilket kräver att de novo proteinsyntesen kvarstår. Detta fynd visar att extinktionsspåret effektivt återaktiverades, vilket tyder på att rekonsolidering är den mekanism som förmedlar utrotningsminnets förstärkning.

Experiment 5 – En annan återfallsprocess för extinktionsspår, Rapid Reacquisition, kan stoppas farmakologiskt med en efterreaktiveringsbehandling. Det har rapporterats att rekonsolidering kan förstärkas genom post-reaktiveringsadministrering av föreningar såsom HDAC-hämmare, vilket resulterar i ökad prestanda på lång sikt efter reaktiveringminnetest45, 52–54. Här frågade vi om utsläckning kunde moduleras positivt genom behandling efter reaktivering med HDAC-hämmaren natriumbutyrat (NaB). Vi använde därför ett rekonditioneringsprotokoll som tillåter detektering av relativa förändringar i styrkan av rädsla och utrotningsminne enligt förhållandet mellan rädslaåterförvärv. Till exempel, vanligen efter standardutrotningsprocedurer, är återanskaffningen snabb32, 34, men den kan vara långsam under vissa omständigheter, såsom omfattande utsläckningsinlärning eller svag initial konditionering14.

Rädsla konditionerade råttor genomgick utrotningsträning och en reaktiveringssession 24 timmar senare. Omedelbart efter reaktivering infunderades NaB eller dess vehikel (ip). Under de fyra följande dagarna genomgick djuren en blandad testning och en svag rekonditioneringsprocedur för att bedöma rädslas återupptagning. Varje session bestod av ett 4 min test följt av en svag fotchock och ytterligare 30 s period i lådan (Fig. 5A). Under utrotningsträning visades djur

Figur 4. Utsläckningminnekräver de novo proteinsyntes efter dess reaktivering för att bestå. (A) Schematisk representation av de experimentella förfarandena. Rädsla konditionerade råttor utsattes för 30-minst utrotningssessioner eller förblev i sina hemburar. En återaktiveringssession genomfördes 7 dagar senare följt av ett test nästa dag. Omedelbart efter reaktivering fick djuren ip-infusion av cykloheximid (Extinktionsgrupp: N=10; Ingen-extinktionsgrupp: N=14) eller dess vehikel (Extinktionsgrupp: N=9; No-extinktion grupp: N=11). (B) Frysnivåer under utsläckningssession. (C) Frysnivåer under återaktiveringssessionen. (D) Frysnivåer under testsessioner. (*) Signifikanta skillnader mellan grupper (P<0.05, repeated-measures="" or="" two-way="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="">

en tidsberoende minskning av rädslareaktioner (F(5,110)=32.89, P=0.001; Fig. 5B). Vid reaktivering fanns det ingen skillnad mellan grupper som senare infunderats med NaB eller Veh (t(22)=0.59, P=0.56; Fig. 5C). Under de 4 testsessionerna (som slutade med en svag rekonditionering vars effekt analyserades i följande test; Fig. 5D), indikerade ANOVA med upprepade åtgärder en signifikant läkemedels-x-sessionsinteraktion (F(3,66)=4.82 , P=0.004). Tukeys post-hoc avslöjade att under det första testet var Veh- och NaB-grupperna lika i frysnivå (P=0.99). Efter en rekonditioneringssession visade Veh-behandlad omedelbart rädsla på nytt (P=0.0002) medan NaB-behandlad inte gjorde det (P=0.99). Den NaB-behandlade gruppen visade endast signifikant återförvärv efter tre rekonditioneringssessioner, vid test 4 (P=0.002).

Dessa resultat visar att NaB-behandling efter reaktivering gjorde utrotningenminnemotståndskraftig mot snabb återupptagning. Djur från fordonsgruppen visade lätt besparingar efter en enda svag omskolningssession.

Figur 5. Infusion efter reaktivering av enminne-förbättrande drog, stärker också utrotningsspår genom att förhindra snabbt återupptagande av rädsla. (A) Schematisk representation av de experimentella förfarandena.

Rädsla konditionerade råttor utsattes för 30-min utrotningssession. En reaktivering genomfördes 24 timmar senare följt av omedelbar administrering av natriumbutyrat (NaB; N=12) eller dess vehikel (N=12). Under de kommande 3 dagarna genomgick djuren testsessioner som slutade med leverans av en svag fotchock plus ytterligare 30 s av kontextuell utforskning (snabbåtervinningsprotokoll). En dag senare genomfördes ett standardtest. (B) Frysnivåer under utsläckningssession. (C) Frysnivåer under reaktivering. (D) Frysnivåer under tester. (*) Signifikanta skillnader mellan grupper (P<0.05, independent-samples="" t-test="" or="" repeated-measures="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="">

NaB-behandlade djur visade i sin tur endast besparingar efter 3 rekonditioneringssessioner. Detta visar att extinktionsspåret kan stärkas genom farmakologiska ingrepp efter reaktivering.

Diskussion

I denna studie visar vi att en kontextuell rädsla utrotasminnekan förbättras genom korta återaktiveringssessioner. För det första visade vi att efter inlärning av utrotning kan spontan återhämtning av rädsla observeras 21 dagar efter, men inte 14 dagar eller tidigare (experiment 1). Därefter fann vi att när utrotningminneperiodiskt återaktiverades, dess tidsberoende sönderfall förhindrades och ingen spontan återhämtning av rädsla verifierades under minst 28 dagar (experiment 2), en effekt som också visades förmedlas av L-VGCCs (experiment 3). För att verifiera om proteinsyntesen rekryterades av återexponeringssessionerna infunderade vi cykloheximid efter reaktivering och observerade förekomsten av ett nytt plasticitetsfönster, vilket stöder tanken att rekonsolidering är processen som äger rum (experiment 4). Slutligen, genom att använda ett annat protokoll som syftar till en annan återfallsmekanism för utsläckningsminne – snabb återförvärv (besparingar) – verifierade vi att farmakologisk hämning av HDAC efter reaktivering också kunde förbättra utrotningsspåret, vilket bevisats av den observerade resistensen mot snabb återförvärv av rädsla svar.

Det är känt att förlusten av betingade reaktioner efter utrotning inte är permanent55 eftersom utrotning faktiskt inte är beroende avminneradering. Istället främjar det ny inlärning som förhindrar uttrycket av den tidigare lagrade associationen14. Därför existerar minnen av utrotning och rädsla samtidigt och tävlar om uttryck. Detta leder till en spårdominanseffekt med utrotning som hämmar uttryck av rädsla. Men utrotning förfaller lätt och rädslaminnet övervinner sin hämning genom flera återfallsmekanismer15, 20. Den mest uppenbara av dessa är att rädslan återvänder genom tidens gång, kallad spontan återhämtning15. Dessutom kan rädslaminne lossna från hämning av utsläckning av beteendefenomen som snabbt återförvärv, återställande och förnyelse14. Utrotningens förfallminneöver tid visas i experiment 1. Till en början undertrycker extinktion betingade rädslareaktioner. Men vid avlägsna tidpunkter försvinner denna effekt, vilket resulterar i spontan återhämtning. Snabb återförvärv observeras i experiment 5. Kontrollråttor visar snabbt hög rädsla efter en enda svag rekonditioneringssession. Nya metoder utformade för att kringgå utrotningens dåliga uthållighet genom att öka dess styrka skulle potentiellt förbättra psykiatriska behandlingar av rädslarelaterade störningar48.

Sedan utrotningenminneförsvagas med tiden och förlorar sin förmåga att undertrycka rädsla15, vilket skulle vara fördelaktigt att förhindra detta förfall. I experiment 2 fann vi att beständigheten hos ett utsläckningsminne kan moduleras positivt genom dess enkla reaktivering. Följaktligen fanns det inga tecken på spontan återhämtning när djuren genomgick korta reaktiveringar, även 4 veckor efter utrotningsträning. Intressant nog ökade inte reaktivering rädslareaktioner hos djur som inte genomgick utrotningsträning som tidigare rapporterats30, troligen på grund av en takeffekt. Därför kunde korta reaktiveringssessioner förhindra utrotningens tidsberoende förfall på ett långvarigt sätt.

Det föreslås ofta att omkonsolidering sker för att tillåtaminneinnehåll som ska uppdateras och bibehåller sin adaptiva relevans för att bättre vägleda framtida beteenden. Rapporter om rekonsolideringsdriven minnesuppdatering visar att det kan ske genom inkorporering av ny information32, 34 eller genom att stärka befintliga associationer30, 35–39. Det är viktigt att påpeka att även när förstärkningen är resultatet av ytterligare lärande från ett identiskt andra inlärningsförsök, krävs fortfarande destabiliserings-restabiliseringsprocessen36. Därför antog vi att den reaktiveringsdrivna stärkande effekten som observerades i experiment 2 kunde förmedlas av en rekonsolideringsprocess, som omfattar en reaktiveringsberoende destabiliseringsfas följt av en restabiliseringsfas som kräver de novo proteinsyntes. Tidigare arbeten har visat att L-VGCC-blockeraren nimodipin förhindrar minnesdestabilisering och därmed förhindrar rekonsolidering51. I experiment 3 fann vi att den stärkande effekten av reaktivering förhindrades av L-VGCC-blockeraren nimodipin, som stöder inblandningen av rekonsolidering i förbättringen av utrotningsspår. Nimodipin har också varit inblandad i försämringen av utsläckningsförvärv såväl som konsolidering56, 57. I vårt experimentella protokoll injicerades nimodipin dock flera dagar efter att utrotningssessionen ägde rum, vilket gjorde dess effekter skilda från dem som erhölls kring den första utrotningsinlärningen. Oavsett vilken process som faktiskt blockeras – rekonsolidering eller utrotning – visar experiment 3 att reaktiveringsinducerad förstärkning av utsläckning kräver att aktivering av-VGCC äger rum.

Rekonsolidering är en process där en tidigare etableradminnereaktiveras och blir labil, vilket kräver de novo proteinsyntesen för att bestå. För att ytterligare ta itu med frågan om huruvida en reaktiveringssession inducerar rekonsolidering av utrotningsspåret, undersökte vi effekten av hämning av proteinsyntes efter reaktivering hos djur som tidigare genomgick utrotningsträning eller inte tidigare (experiment 4). Hos djur som inte genomgick utrotning, störde hämning av proteinsyntes efter reaktivering återkonsolidering av den kontextuella rädslanminne, vilket resulterar i låga frysnivåer. Det motsatta beteenderesultatet ägde rum i gruppen som genomgick utrotning: i testet uppvisade CHX-behandlade djur höga frysningsnivåer, vilket tyder på att utrotningsminnet var stört. I detta experiment, eftersom utrotning stördes av proteinsyntesinhibering efter en enda återexponering (som bekräftades i ett test följande dag), undersöktes inga extra återexponeringssessioner. Resultaten av detta experiment tyder på att utrotningsspåret hindrades till en grad att det inte längre kunde undertrycka rädsla. Tidigare arbete5, 7 indikerar att reaktivering inte bara främjade "ytterligare utsläckningsinlärning", utan fick utrotningsspåret att gå in i ett labilt tillstånd som krävde omkonsolidering för att bestå. Man måste lägga märke till att antingen utsläckningsminnet eller rädslaminnet uttrycktes vid tidpunkten för återaktivering. Följaktligen var spåret som är dominerande aktiverat av reaktiveringen det som destabiliserats och därmed försämrats av proteinsyntesinhiberingen.

Slutligen bedömde vi om extinktionsspåret kunde moduleras positivt genom behandling efter reaktivering med enminne-förstärkande drog. Flera farmakologiska medel har visat sig förbättraminnekonsolidering och rekonsolidering, inklusive HDAC-hämmare som natriumbutyrat45, 52, 53. I experiment 5 fann vi att NaB-behandling efter reaktivering förbättrade extinktionsspåret, vilket gjorde att det kunde motstå återfall genom ett snabbt återförvärvsprotokoll. Djur behandlade med NaB uppvisade anmärkningsvärt motstånd mot besparingar efter ett snabbt återförvärvsprocedur. Fordonsbehandlade djur visade besparingar efter en enda svag rekonditioneringssession, medan NaB-behandlade råttor krävde 3 rekonditioneringssessioner för att visa samma återhämtningseffekt. Detta visar att även en kort återaktiveringssession gör ett utsläckningsspår mottagligt för förbättring genom positiv interferens. Förbättring av utsläckning genom HDAC-hämning efter reaktivering, som rapporterats här, tyder på att samma fördelaktiga effekt skulle kunna uppnås med andra minneshöjande läkemedel för att hämma uttryck av rädsla över tid.

Möjligheten att den reaktiveringsberoende förstärkningen av extinktion kunde ha förmedlats genom ytterligare extinktion istället för rekonsolidering måste övervägas. Det har rapporterats att även korta återexponeringar av ett sammanhang kan leda till utrotning när de utförs vid avlägsna tidpunkter35. Även om det experimentella protokollet i den artikeln skiljer sig från vårt i ett betydande antal aspekter, har vi inkluderat ytterligare en experimentell grupp för att kontrollera detta specifika problem: i experiment 2 genomgick gruppen "No-extinction plus reactivation" samma tre reaktiveringssessioner men skickades inte till en utrotningssession. Denna grupp visade ingen rädsladämpning, varken under reaktiveringar eller testet, annorlunda än vad som skulle förväntas vid utrotning. Ytterligare bevis kommer från experiment 4. Om en kort exponering inducerade ytterligare utdöende, skulle cykloheximidbehandlingen endast ha stört den inkrementella inlärningen av den sessionen, och lämnat besparat det som tidigare lagrats. Emellertid har cykloheximid efter reaktivering stört utrotningsspåret, vilket avskaffat hämningen av rädsla i ett test som genomfördes 24 timmar senare. Avbrottet av ett tidigare lagrat spår genom hämning av proteinsyntes efter reaktivering överensstämmer med tolkningen av rekonsolidering. Med tanke på konvergensen av alla beteendemässiga och farmakologiska bevis som erhållits med den nuvarande experimentella designen, indikerar våra resultat att det som ägde rum under reaktiveringssessionerna var en rekonsolideringsprocess som förmedlade förstärkningen av utrotningminne.

Återhämtning av rädsla efter utrotningsbaserade tillvägagångssätt är avgörande att förstå för att förbättra beteendemässiga och farmakologiska behandlingar av ångeststörningar. Faktum är att förbättring av utrotning kan anses vara ett kännetecken för psykiatrisk forskning. Här fann vi att korta återaktiveringssessioner var effektiva för att förhindra spontan återhämtning av utdöd rädslaminne. Denna effekt medierades av L-VGCC och involverar proteinsyntes, vilket starkt tyder på att rekonsolidering är mekanismen bakom denna förstärkning. Vi fann också att positiv farmakologisk modulering efter reaktivering kunde förhindra snabb återförvärv av rädsla. Tillsammans visar dessa fynd att utrotning kan dra nytta av reaktiveringsbaserade interventioner som syftar till att förbättra dess styrka och uthållighet. Det bidrar också till uppfattningen att rekonsolidering och utrotning inte är helt separata processer som nuvarande paradigm ofta antyder58. På grund av framträdandet av utrotningsbaserade kognitiva beteendeterapier ger dessa fynd relevanta insikter till både grundläggande och klinisk forskning.

enhance memory natural herbs

Metoder

Ämnen. Wistar-hanråttor från vår avelskoloni som vägde 300–350 g, i åldern 60–70 dagar, användes. Djuren hölls i plastburar, fyra till fem per bur, med vatten och mat tillgänglig ad libitum. Alla experiment utfördes av nationell djurvårdslagstiftning och riktlinjer (brasiliansk lag 11794/2008) och godkändes av universitetets etiska kommitté.

Kontextuell rädsla konditionering. CFC-kammaren bestod av en upplyst plexiglaslåda (25.0 ×25.0-cm rutnät med parallella 0.1-cm kaliberstänger av rostfritt stål med ett avstånd på 1.{{ 7}} cm från varandra). Under konditioneringssessionen placerades råttor i kammaren i 3-min och fick sedan två 2-sekunders 0,7 mA fotchock åtskilda av ett 30-sekundersintervall. Djuren hölls i konditioneringsmiljön i ytterligare 30 sekunder innan de återvände till sina hemburar.

Minneutrotning, återaktivering och testsessioner. Korta eller långa kontextåterexponeringar användes för att inducera minnesreaktivering respektive utsläckningsinlärning. Utsläckningsträning bestod av 30-minst återexponering för det betingade sammanhanget och inträffade alltid 24 timmar efter CFC. Minnesåteraktiveringssessioner bestod av en 3-min återexponering för det betingade sammanhanget. I experiment 2 och 3 genomfördes reaktiveringar på dagarna 7, 14 och 21 efter test 1. I experiment 4 och 5 genomfördes de 24 timmar efter extinktionsträning.

Testsessionerna bestod av en 4-min. återexponering för sammanhanget. På experiment 1, 2 och 3 genomfördes det första testet 24 timmar efter utsläckningsträningen, och ett andra test genomfördes 7, 14, 21 eller 28 dagar senare för att bedöma rädsla för spontan återhämtning. I experiment 4 och 5 genomfördes testsessionen 24 timmar efter reaktivering för att bedöma effekten av farmakologiska manipulationer efter reaktivering.

För att hantera snabb återförvärv (eller "besparingar"; experiment 5) genomgick djuren ett 4-mintest följt av en svag fotchock (en 2-sekund 0,4 mA). Efter ytterligare 30 sekunder återvände de till sina hemburar. Denna procedur upprepades dagligen tre gånger, följt av ytterligare ett test en dag senare. I denna procedur gjordes alltid en poäng om frysning före fotchocken (som bestod av en standardtestsession). Detta gjorde det möjligt för oss att både mäta prestanda och skicka djuren till en svag rekonditioneringssession.

Läkemedel. Proteinsyntesinhibitor cykloheximid (CHX; Sigma) löstes i steril isoton saltlösning med 1 procent dimetylsulfoxid till en koncentration av 2,2 mg/ml. Cykloheximid eller dess vehikel injicerades intraperitonealt (ip) omedelbart efter reaktiveringen. Den totala injicerade volymen var 1 ml/kg.

L-typ spänningsstyrda kalciumkanaler (LVGCC)-antagonisten nimodipin (Sigma) löstes i steril isoton saltlösning med 8 procent dimetylsulfoxid till en koncentration av 16 mg/ml. Nimodipin eller dess vehikel injicerades subkutant 30 minuter före reaktiveringssessionerna. Den totala injicerade volymen var 1 ml/kg.

Natriumbutyrat (NaB; Sigma), en histondeacetylas (HDAC)-hämmare, löstes i steril isotonisk koksaltlösning till en koncentration av 0.6g/ml. Den totala injicerade volymen var 1 ml/kg ip, omedelbart efter reaktivering.

Dataanalys.Minnemättes genom att kvantifiera frysbeteende och uttrycktes som en procentandel av den totala sessionstiden. Frysning bedömdes av en observatör som var blind för de experimentella förhållandena. Homoscedasticitet och normalitet av datafördelningen bekräftades med Levenes test respektive Kolmogorov-Smirnov-test. Extinktionssessioner analyserades med användning av Repeated-Measures ANOVA. Reaktiveringssessioner analyserades med hjälp av Students t-test, tvåvägs ANOVA eller upprepade åtgärder ANOVA, följt av Tukey post-hoc test. Testsessioner analyserades med hjälp av Students t-test, Two-way ANOVA eller Repeated-Measures ANOVA, följt av Tukey post-hoc test.

Referens

1. Nader, K., Schafe, GE & Le Doux, JE Rädsla minnen kräver proteinsyntes i amygdala för rekonsolidering efter återhämtning. Nature 406, 722–6 (2000).(2010).

3. Finnie, PSB & Nader, K. Metaplasticitetsmekanismernas roll vid regleringminnedestabilisering och återkonsolidering. Neurosci. Biobeteende. Upps. 36, 1667–707 (2012).

5. Rossato, JI, Bevilaqua, LR, Izquierdo, I., Medina, JH & Cammarota, M. Hämtning inducerar återkonsolidering av utrotning av rädslaminne. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 21801–21805 (2010).

7. Eisenberg, M. & Dudai, Y. Återkonsolidering av färskt, avlägsna och släckt rädslaminne i Medaka: gamla rädslor dör inte. Eur J Neurosci 20, 3397-3403 (2004).

8. Rosas-Vidal, L., Rodriguez-Romaguera, J., Do-Monte, F. & Anderson, R. Inriktning på återkonsolidering av utrotningsminnen: en ny potentiell strategi för att behandla ångestsyndrom. Mol. Psychiatry 20, 1264–1265 (2015).

9. Bouton, ME, Westbrook, RF, Corcoran, KA & Maren, S. Kontextuell och tidsmässig modulering av utrotning: beteendemässiga och biologiska mekanismer. Biol. Psykiatri 60, 352–60 (2006).

11. Furini, C., Myskiw, J. & Izquierdo, I. The learning of fear extinction. Neurosci. Biobeteende. Upps. 47, 670–683 (2014).

13. Vervliet, B., Craske, MG & Hermans, D. Rädsla utrotning och återfall: toppmoderna. Annu. Rev. Clin. Psychol. 9, 215–48 (2013). (2002).

15. Rescorla, Ra Spontan återhämtning. Lära sig. Mem. 11, 501–9 (2004).

17. Pedreira, ME & Maldonado, H. Proteinsyntes förhindrar rekonsolidering eller utrotning beroende på påminnelsens varaktighet. Neuron 38, 863–869 (2003).

18. Bustos, SG, Maldonado, H. & Molina, VA Störande effekt av midazolam på rekonsolidering av rädsla minne: avgörande inverkan av reaktivering tidsspann och minnesålder. Neuropsychopharmacology 34, 446–57 (2009).

19. Merlo, E., Milton, AL, Goozée, ZY, Theobald, DE & Everitt, BJ Rekonsolidering och utplåning är dissocierbara och ömsesidigt uteslutande processer: beteendemässiga och molekylära bevis. J. Neurosci. 34, 2422–31 (2014).

20. Eisenberg, M., Kobilo, T., Berman, DE & Dudai, Y. Stabilitet av hämtat minne: omvänd korrelation med spårdominans. Science 301, 1102–1104 (2003).

21. Suzuki, A. et al. Minnesrekonsolidering och utplåning har distinkta tidsmässiga och biokemiska signaturer.J. Neurosci. 24, 4787–95

(2004).

22. Lee, JLC, Milton, AL & Everitt, BJ Rekonsolidering och utrotning av betingad rädsla: hämning och potentiering. J. Neurosci. 26, 10051–6 (2006).

23. Flavell, CR & Lee, JL Rekonsolidering och utplåning av aptitligt pavlovsk minne. Neurobiol Learn Mem 104, 25–31

(2013).

24. Tedesco, V., Roquet, RF, DeMis, J., Chiamulera, C. & Monfils, M.-H. Extinktion, applicerad efter återhämtning av auditivt rädslaminne, ökar selektivt zinkfingerprotein 268 och fosforylerat ribosomalt protein S6-uttryck i den prefrontala cortexen och laterala amygdala. Neurobiol. Lära sig. Mem. 115, 78–85 (2014).

25. de la Fuente, V., Freudenthal, R. & Romano, A. Rekonsolidering eller utplåning: transkriptionsfaktorbyte vid bestämning av minnesförlopp efter hämtning. J. Neurosci. 31, 5562–73 (2011).

27. Lee, JLC Rekonsolidering: bibehålla minnesrelevans. Trender Neurosci. 32, 413–20 (2009).

29. Nadel, L. & Hardt, O. Uppdatering om minnessystem och processer. Neuropsychopharmacology 36, 251–73 (2011).

31. Forcato, C., Rodríguez, MLC, Pedreira, ME & Maldonado, H. Rekonsolidering hos människor öppnar upp deklarativt minne för ingången av ny information. Neurobiol. Lära sig. Mem. 93, 77–84 (2010).

32. Monfils, M.-H., Cowansage, KK, Klann, E. & LeDoux, JE Extinktion-rekonsolidering gränser: nyckeln till ihållande dämpning av rädsla minnen. Vetenskap (80-.). 324, 951–955 (2009).

33. Hupbach, A., Gomez, R., Hardt, O. & Nadel, L. Rekonsolidering av episodiska minnen: en subtil påminnelse utlöser integration av ny information. Lära sig. Mem. 14, 47–53 (2007).

34. Haubrich, J. et al. Rekonsolidering gör att rädslaminnet kan uppdateras till en mindre aversiv nivå genom inkorporering av aptitlig information. Neuropsychopharmacology 40, 315–326 (2015).

35. Inda, MC, Muravieva, EV & Alberini, CM Minnesåtervinning och tidens gång: från återkonsolidering och förstärkning till utrotning. J. Neurosci. 31, 1635–43 (2011).

(2008).

37. Fukushima, H. et al. Förbättring av rädsla minne genom återhämtning genom rekonsolidering. Elife 2014, 1–19 (2014).

39. Forcato, C., Rodríguez, MLC & Pedreira, ME Upprepade labiliserings-rekonsolideringsprocesser stärker det deklarativa minnet hos människor. PLoS One 6, e23305 (2011).

(2015).

41. Garcia-DeLaTorre, P., Rodriguez-Ortiz, CJ, Arreguin-Martinez, JL, Cruz-Castaneda, P. & Bermudez-Mattoni, F. Samtidiga men inte oberoende anisomycininfusioner i insulär cortex och amygdala hindrar stabilisering av smakminnet när den uppdateras. Lära sig. Mem. 16, 514–519 (2009).

42. Lee, JLC Minnesrekonsolidering förmedlar uppdateringen av hippocampus minnesinnehåll. Främre. Behav. Neurosci. 4, 168 (2010).

44. Souter, M. & Kindt, M. En abrupt transformation av fobiskt beteende efter ett amnesiskt medel efter hämtning. Biol Psychiatry, doi:10.1016/j.biopsych.2015.04.006 (2015).

45. Bredy, TW & Barad, M. Histon-deacetylashämmaren valproinsyra förbättrar förvärv, utrotning och återkonsolidering av betingad rädsla. Lära sig. Mem. 15, 39–45 (2008).

47. Tronson, NC, Wiseman, SL, Olausson, P. & Taylor, JR Dubbelriktad beteendeplasticitet av minnesrekonsolidering beror på amygdalärt proteinkinas A. Nat. Neurosci. 9, 167–9 (2006).

48. Fitzgerald, PJ, Seemann, JR & Maren, S. Kan rädsla utrotning förbättras? En genomgång av farmakologiska och beteendemässiga fynd. Brain Res. Tjur. 105, 46–60 (2014).

49. Bouton, ME, Winterbauer, NE & Todd, TP Återfallsprocesser efter utrotningen av instrumentell inlärning: Förnyelse, återupplivning och återförvärv. Behav. Processer 90, 130–41 (2012).

50. Gräff, J., Kim, D., Dobbin, MM & Tsai, L. Epigenetisk reglering av genuttryck i fysiologiska och patologiska hjärnprocesser. 603–649, doi:10.1152/physrev.00012.2010 (2011).

51. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, PW & Kida, S. Aktivering av LVGCCs och CB1-receptorer som krävs för destabilisering av återaktiverade kontextuella rädslaminnen. Lära sig. Mem. 15, 426–33 (2008).

52. Federman, N., Fustinana, MS & Romano, A. Rekonsolidering involverar histonacetylering beroende på minnets styrka. Neuroscience 219, 145–156 (2012).

53. Villain, H., Florian, C. & Roullet, P. HDAC-hämning främjar både initial konsolidering och återkonsolidering av det rumsliga minnet hos möss. Sci. Rep. 6, 27015 (2016).

54. Stefanko, DP, Barrett, RM, Ly, AR, Reolon, GK & Wood, MA Modulering av långtidsminne för objektigenkänning via HDAC-hämning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 9447–52 (2009).

56. Flavell, CR, Barber, DJ & Lee, JLC Beteendeminneskonsolidering av mat- och rädslaminnen. Nat. Commun. 2, 504

(2011).

57. Cain, CK, Blouin, AM & Barad, M. Spänningsstyrda kalciumkanaler av L-typ krävs för utsläckning, men inte för förvärv eller uttryck, betingad rädsla hos möss. J. Neurosci. 22, 9113–9121 (2002).

58. Almeida-Correa, S. & Amaral, OB Minneslabilisering vid rekonsolidering och utplåning – bevis för ett gemensamt plasticitetssystem? J Physiol Paris 108, 292–306 (2014).

Erkännanden

Vi tackar fru Zelma Regina V. de Almeida för hennes vänliga och professionella tekniska assistans, och M.Sc. Jane Zhang för hennes generösa och kompetenta språkrevision. Detta arbete stöddes av stipendier och anslag från CAPES (MEC), CNPq (MCT) och PROPESQ (UFRGS). Alla författarna förklarar att de inte har någon annan ersättningskälla än primär institution och federal finansiering.

Författarbidrag

JH designade studien, utförde experimenten, analyserade data och skrev manuskriptet. AM, FZB, APC och ROS hjälpte till i experimenten och bidrog med idéer. LOA och JAQ hjälpte till att designa studien och skriva manuskriptet. Alla författare har granskat manuskriptet.