Skanna jonkonduktansmikroskopi av levande mänsklig glomerulus

För mer information:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2|Mykhailo Fedoriuk1,2|Elena Isaeva1,2|Andrew Shevchuk3|Oleg Palygin1|Alexander Staruschenko1,4

1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA2Department of Cellular Membranology, Bogomoletz Institute of Physiology, Kiev, Ukraina3Department of Medicine, Imperial College London, London, UK4Clement J. Zablocki VA Medical Center, Milwaukee, WI, USA

KorrespondensAlexander Staruschenko och Ruslan Bohovyk, Institutionen för fysiologi, Medical College of Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, USA.E-post: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

Finansieringsinformation Department of Veteran Affairs, Grant/Award Number: I01 BX004024; National Heart, Lung and Blood Institute, bidrags-/utmärkelsenummer: P01 HL116264 och R35 HL135749; American Physiological Society, Grant/Award Number: Research Career Enhancement Award; National Institute of Diabetes and Digestive andNjureSjukdomar, Bidrags-/utmärkelsenummer: DK126720

Abstrakt

Podocytskada är ett kännetecken för glomerulära sjukdomar, såsom fokal segmentell glomeruloskleros, typiskt förknippad med markerad albuminuri och progression av njurpatologi. Podocytstrukturella abnormiteter och förlust är också kopplade till minimal förändringssjukdom och vanligarediabetisk njursjukdom. Här tillämpade vi den första gången skanning jonkonduktansmikroskopi (SICM) teknik för att bedöma den nyligen isolerade människanglomerulustopologi. SICM ger en unik möjlighet att utvärderaglomeruluspodocyter såväl som andra nefronstrukturella segment med elektronmikroskopiupplösning men i levande prover. Här visas tillämpningen av SICM-metoden i den levande människanglomerulus, som ger principbevis för framtida dynamisk analys av membranmorfologi och olika funktionella parametrar i levande celler.

Klicka för att cistanche biverkningar och Cistanche för njursjukdom

1. INTRODUKTION

Glomerulusrepresenterar en tuft av kapillärer belägen vid nefronets ingångsdel, där blod selektivt filtreras över den glomerulära filtrationsbarriären bestående av endotelceller, glomerulär basalmembran och podocyter. Primära och sekundära processer av intilliggande podocyter flätas samman och skapar ett slits diafragma som tätt täcker glomeruli-kapillärer. Detta diafragma har en komplex morfologi och utgör den slutliga barriären för blodfiltrering, vilket bidrar till storleksselektivitet och tillåter permeabilitet för molekyler som är mindre än albumin. En minskning av antalet podocyter och utplåning av fotprocesser rapporterades vid fokal segmentell glomeruloskleros, minimal förändringssjukdom och diabetisk nefropati.1-3Dessutom kan podocyters förlust och modifiering av sin arkitektur vara uppenbar i mycket tidiga skeden avnjuresjukdomar som kan ligga bakom/förvärra deras utveckling. Högupplöst avbildning av cellmorfologi håller på att bli ett väsentligt och användbart verktyg för att studera cellulära strukturer och den roll de spelar i cellfunktion och sjukdomsprogression.4 Svepelektronmikroskopi (SEM) är en allmänt använd metod för att genomföra sådana studier. Ändå kräver det flera komplexa procedurer för provberedning, vilket gör det omöjligt att analysera ett levande prov.5 Därför finns det ett kritiskt behov av att utveckla nya verktyg för att studera förändringar av podocytmorfologi i levande prover. Hopping Probe mode of Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM) är en teknik som möjliggör högupplöst, icke-optisk avbildning av levande cellytor med komplex morfologi.6-8Den stora fördelen med denna metod är en nära flera nanometers rumslig upplösning och ett långt Z (vertikalt) intervall, som kan appliceras på levande prover med invecklad morfologi under fysiologiskt relevanta förhållanden. SICM är en multimodal avbildningsteknik som kan kombineras med andra etablerade tekniker, samtidig och dynamisk analys av membranmorfologi och olika funktionella parametrar, såsom cellvolym, membranpotentialer, enstaka jonkanalströmmar och till och med dynamiken i membranproteinkomplex i levande celler.9-11 Här ger vi ett exempel på tillämpningen av SICM för att analysera morfologin hos levande människorglomerulusstrukturera.

Symtom på Cistanche-njursjukdom

2. MATERIAL OCH METODER

För experimentet använde vi en del av det kortikala området från den kasserade transplanterade människannjuredissekerades och lagrades i Wisconsin-konserveringslösning följt av inkubation i en syresatt fysiologisk saltlösning (PSS).12 Renala glomeruli isolerades med en vibrodissociationsteknik som tidigare beskrivits.13 Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb isolering av välbevarade renal glomeruli från människanjurar. För att utföra SICM-avbildning, nyisolerad människaglomerulusfästes till poly-L-lysinglasyta placerad i cellkammaren fylld med PSS-lösning. Prover placerades manuellt i xy-riktningarna under ett inverterat optiskt mikroskop Nikon TE2000-U (Nikon Instruments). För hoppproben användes SICM-avbildningsnanopipetter av borosilikatglas med en resistans på cirka 100 MΩ, vilket motsvarar en uppskattad spetsdiameter runt 120 nm. Nanopipetter drogs med den horisontella flammande/bruna avdragaren P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Nanopipetterna fylldes med samma PSS-lösning som användes för badet och placerades i z-riktningen med ett piezoelektriskt ställdon. Jonströmmen som flödade genom nanopipetterna mättes med en Axopatch 700B patch-clamp-förstärkare (Axon Instruments) i spännings-clamp-läge och övervakades av den specialmodifierade universella styrenheten (ICAPPIC Ltd, UK), som samtidigt kontrollerade prov- och pipettpositionering. 6 Alla experiment utfördes vid rumstemperatur (20-22 grad). För avbildning av komplexa invecklade strukturer såsom podocyter fotprocesser iglomerulus, använde vi backstep/hopping-läge SICM som är mest tillämpbart för att avbilda topografin av levande celler med hög upplösning.6,14 Det enda steget i hoppprincipen består av en händelse när referensströmmen mäts genom att placera nanopipetten långt ovanför prov. Sedan närmar sig nanopipetten längs z-axeln till provytan tills den uppmätta strömnivån sjunker till det förinställda börvärdet som motsvarar ~1,0 procent -1,2 procent av referensströmmen. I detta ögonblick avslutas tillvägagångssättet, XYZ-koordinaterna för XY- och Z-piezomanöverdonen registreras som provytkoordinaten för den första avbildningspunkten och pipetten dras bort från ytan. Denna procedur upprepas sedan vid varje enskild bildpunkt längs xy-axeln som bestäms av förinställd upplösning och avsökningsområde. För figur IB var avsökningsomfång och bildupplösningar 30 µm × 30 µm och 512 px × 512 px, och för figur IC var 5 µm × 5 µm respektive 480 px × 480 px. Rå SICM-topografidata och bildefterbehandling utfördes med hjälp av SICM ImageViewer mikroskopianalysmjukvara (ICAPPIC Ltd, Storbritannien).

FIGUR 1 Tillämpning av avbildning med skanningjonkonduktansmikroskopi. A, Nyisolerad människaglomerulusfäst på poly-Llysine glasytan. Till vänster visas en mikropipett som närmar sig glomerulusytan för att utföra SICM-avbildning. B, Ett exempel på glomerulus-filtreringsbarriärkomponenter, inklusive podocyt- och fotprocesser täckta kärl, visualiserade av SICM. 45 min för total area scan (30 × 30 µm, upplösning 512 × 512 pixlar; z-axeln ändras 15 µm). C, Utökad syn på arkitekturen för mänskliga podocyters sekundära fotprocesser avslöjade av högupplöst SICM. 12 min för total area scan (upplösning 5 × 5 µm, upplösning 480 × 480 pixlar; z-axeln ändras 3 µm). Skalstaplar visas

3. RESULTAT OCH DISKUSSION

SICM-bildkvaliteten är jämförbar med SEM och tillåter exakt granskning avglomerulusytstruktur, inklusive blodkärl och podocyter, och arkitekturen för de sekundära fotprocesserna.4 I vår tidigare studie använde vi SICM-avbildning för att uppskatta de patologiska strukturella förändringarna i podocytfotprocesser hos typ 2-diabetisk nefropati (T2DN)-råttor.15 Vi genomförde en jämförande analys av den tredimensionella arkitekturen av podocytfiltreringsbarriären hos icke-diabetes- och T2DN-råttor. Våra data avslöjade en signifikant förlust av podocytfotprocesser i T2DN glomeruli, vilket ger en korrekt utvärdering av histopatologiska förändringar som inträffade vid diabetisk nefropati som ligger bakom nefrinuri och albuminuri hos dessa råttor.15Här visade vi för första gången ett framgångsrikt tillvägagångssätt för att bedöma de tre -dimensionell ytstruktur av nyligen isolerad, levande mänsklig glomerulus. Human renal glomeruli är sfäriska strukturer med en diameter på cirka 300 µm16; sålunda måste pipettens spets noggrant närma sig toppen av området av intresse. Vår SICM-uppsättning har en 25 µm z-axel och 30 × 30 µm xy-axel skannerområde, vilket gjorde att vi kunde få en högupplöst bild av den stora delen avglomerulusyta. Insamlingstiden beror starkt på skanningsområdet, upplösningen och hoppelektrodspetsens storlek. För avbildning av levande celler i komplexa strukturer som nyligen isolerad glomerulus varierar skanningstiden från 10 till 50 minuter per bildruta (se figurförklaring för mer information). Den kumulativa effekten av den höga upplösningen, det stora skanningsområdet och de stokastiska fluktuationerna i levande system kan resultera i avbildningsartefakter som representeras som horisontella och vertikala förskjutningar mellan hoppande pipettomplaceringscykler. Observera att i komplexa geometrier med plötsliga förändringar i ytlägena kan både insamlingstiden och avbildningsartefakter, som mörka eller dåliga pixlar, öka. SICM-topografibilden (Figur 1A) illustrerar glomerulära kapillärer täckta av tydligt synliga primära och sekundära podocytfotprocesser. SICM gör det möjligt att ta provbilder med olika skanningsområden i nanometerskalan, och bibehålla en tillräcklig upplösningsnivå.17 Figur 1B representerar arkitekturen för mänskliga podocyters sekundära fotprocesser som avslöjas av högupplöst SICM. Ytterligare analys av sådana topografibilder kan användas för att studera morfologiska förändringar av podocytfotprocesser under patologiska förhållanden och som svar på olika läkemedelstillämpningar.

Tillämpningen av SICM-tekniken för att undersöka mjukdelsprovernas tredimensionella ytstruktur, inkl.glomerulusoch podocytceller, introducerades initialt av Nakajima et al4. Författarna användenjureskivor för att jämföra denna teknik med konventionell SEM. Här utökade vi dessa studier till levande mänsklig glomerulus. Med detta tillvägagångssätt avslöjade vi den stora potentialen hos SICM-tekniken för snabb och pålitlig undersökning avglomerulusfiltreringsbarriär. En av de stora fördelarna med SICM (utöver användningen av levande prover) är att det inte kräver flera provberedningsprocedurer som vanligtvis behövs för EM-mikroskopi, inklusive uttorkning och fixeringslösning. Därför tillåter SICM att undvika krympning av prover observerade med EM, vilket kan leda till missvisande faktiska dimensioner. Viktigt är att SICM i realtid på nyligen isolerade glomeruli också tillåter testning av dynamiken i fotprocessernas rörelse som svar på den akuta exponeringen för läkemedel av intresse. Slutligen kan SICM-pipetten användas för att utföra patch-clamp-inspelningar av enkanalsströmmar.18För detta ändamål, efter rekonstruktionen av topografikartan, tillät inhämtningsmjukvaran (ICAPPIC Ltd, UK) en kontrollerad broms av SICM-glaset hoppar sond på kammarytan, minskar mikroelektrodresistansen mot patch-clamp-förhållandena (7 till 12 MΩ) och gör den lämplig för enkanalsinspelning i samma experiment. SICM tillåter valet av patch-clamp-elektrodens exakta placering på cellytan baserat på topografiska data genom ett välkontrollerat vertikalt tillvägagångssätt med nanometerprecision, vilket resulterar i den lätta bildningen av en kontaktgigaseal med det cellulära membranet som kallas Smart Patch.19

Sammanfattningsvis har metoden som beskrivs här utmärkt potential för studier av glomeruli och andra nyligen isolerade nefronsegment. Dessutom visar det att det är möjligt att använda människanjureprover utan omfattande förberedelser för att utvärdera morfologiska förändringar i studien av patologier.

Cistanche för njursjukdom

TACK

Forskning i författarnas laboratorium finansierades av Department of Veteran Affairs I01 BX004024, National Heart, Lung, and Blood Institute R35 HL135749 och P01 HL116264, National Institute of Diabetes and Digestive andNjureSjukdomar R01 DK126720 och American Physiological Society Research Career Enhancement Award.

INTRESSEKONFLIKT

Dr. Andrew Shevchuk är aktieägare och erhåller konsultarvoden från ICAPPIC Ltd. Alla andra författare förklarade att det inte finns några konkurrerande intressen

FÖRFATTARBIDRAG

Ruslan Bohovyk: Konceptualisering (lika); Datakurering (lead); Formell analys (lead); Skrivande originalutkast (lika); Skriv-granskning & redigering (lika). Mykhailo Fedoriuk: Datakurering (stödjande); Formell analys (stödjande); Skriv-granskning & redigering (lika). Elena Isaeva: Konceptualisering (stödjande); Datakurering (stödjande); Formell analys (stödjande); Skrivande originalutkast (stödjande); Skriv-granskning & redigering (lika). Andrew Shevchuk: Konceptualisering (stödjande); Programvara (stödjande); Skriva originalutkast (stödjande); Skriv-granskning & redigering (lika). Oleg Palygin: Konceptualisering (lika); Formell analys (stödjande); Metodik (stödjande); Projektadministration (stödjande); Skrivande originalutkast (stödjande); Skriv-granskning & redigering (lika). Alexander Staruschenko: Conceptualization (lead); Projektadministration (ledare); Resurser (lead); Övervakning (leda); Skrivande originalutkast (lika); Skriv-granskning & redigering (lika).

DATA TILLGÄNGLIGHET

Data som stöder resultaten av denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.