Strukturell design, syntes och antioxidanter, antileishmania, antiinflammatoriska och anticanceraktiviteter av ett nytt quercetinacetylerat derivat

För mer information. Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Quercetin(Q) är en bioflavonoid med biologisk potential; dock begränsar dålig löslighet i vatten, omfattande enzymatisk metabolism och minskad biotillgänglighet dess biofarmakologiska användning. Syftet med denna studie var att utföra strukturell modifiering i Qby acetylering, och således erhålla quercetinpentaacetat(Q5)-analogen, för att undersöka de biologiska potentialerna (antioxidant, antileishmania, antiinflammatoriska och cytotoxicitetsaktiviteter) i cellkulturer. Q5 karakteriserades av FTIR-, 'H- och 13C NMR-spektra. Deantioxidantpotentialen utvärderades mot den radikala ABTS· plus . Den antiinflammatoriska potentialen utvärderades genom att mäta den pro-inflammatoriska cytokintumörnekrosfaktorn (TNF) och produktionen av kväveoxid (NO) i peritoneala makrofager från BALB/c-möss. Cytotoxicitetstester utfördes med AlamarBlue-metoden i cancerceller HepG2 (humant hepatokarcinom), HL-60 (promyelocytisk leukemi) och MCR-5 (friska humana lungfibroblaster) samt MTT-metoden för C6-celler kulturer (råttgliom). Q och Q5 visade antioxidantaktivitet på 29 procent respektive 18 procent, vilket motiveras av att hydroxyler ersätts med acetylgrupper. Q och Q5 visade koncentrationsberoende minskningar i NO- och TNF-produktion (s<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μM). Slutligen verifierades den cytotoxiska överlägsenheten för Q5 (IC50=11 μM), vilket vid 50 μM under 24 timmar inducerade förändringar i morfologin hos C6-gliomceller som kännetecknas av en rund kroppsform (ännu ej rapporterad i litteraturen) ). Analogen Q5 hade potentiella biologiska effekter och kan vara lovande för ytterligare undersökningar mot andra cellkulturer, särskilt neurala.

Nyckelord: quercetin;syntes; quercetinpentaacetat; antioxidant; antileishmania; antiinflammatorisk;cytotoxicitetsaktivitet

Klicka för att lära dig mer om produkterna

1. Introduktion

Quercetinär en bioflavonoid med en bevisad påverkan på hälsan och väldokumenterad biokemisk aktivitet. Denna förening anses vara en av de mest potenta antioxidanterna bland polyfenoler [1-3]. På grund av dess egenskaper har quercetin testats för olika terapeutiska tillämpningar, som t.exantioxidant, antiparasitisk,antiinflammatorisk, och anti-canceraktiviteter [4,5]. Vid parasitsjukdomar är flavonoider en högintressegrupp. Detta beror på deras låga toxicitet i värdar och flera mekanismer genom vilka de kan modulera patologiskt förändrade processer under infektioner [6].Flavonoiderhar flera mål för behandling av leishmaniasis och inkluderar mål, såsom arginas, ribonukleotidreduktas och topoisomeras II [7,8].

Quercetinhar flera anticanceraktiviteter i flera typer av solida tumörer. Dessutom har det visat sig ha aktivitet i HL-60-celler (som härrör från akut myeloid leukemi (AML)) för att avsevärt minska tumörtillväxt genom att minska intratumoral oxidativ stress, aktivering av extracellulärt reglerat kinas (ERK)-signalen och efterföljande apoptos [9]. Quercetin förbättrade det proinflammatoriska svaret genom att minska IL-6- och TNF-uttryck med positiv antiinflammatorisk aktivitet i humana THP1-makrofagerpopulationer [10].

Bland de olika typerna av cancer är gliom en av de mest aggressiva och med dålig prognos. Tyvärr är de huvudsakliga behandlingarna (kirurgiskt avlägsnande, strålbehandling och kemoterapi) inte effektiva. Den genomsnittliga totala överlevnaden för patienter ligger kvar på cirka 14 månader [11]. Ändå har nya föreningar, såsom temozolomid [12], retinoider [13] och flavonoider [14] visat anti-gliomaktivitet. De antitumorala effekterna av quercetin har beskrivits mot celler från glioblastom, som är det mest aggressiva av gliomen [15].

Onormala immunsvar är involverade i initieringen och utvecklingen av ett stort antal sjukdomar, inklusive autoimmuna sjukdomar, allergier, cancer och neurodegenerativa sjukdomar.Flavonoiderhar potentiell immunmodulerande aktivitet och studeras som alternativ för klinisk användning. Quercetin kan utöva betydande immunmodulerande effekter på den cellulära produktionen av cytokiner härledda från Th-1- och Th-2-profilen och lymfocytisk proliferation, vilket reglerar cellulär immunitet[16]. Dessutom kan quercetin differentiellt modulera uttrycket av interleukingener i perifera mononukleära blodceller (PBMC), vilket gynnar Th-1-profilen, vilket främjar cellulär immunitet genom interferon-gamma (IFN-y), minskningen av Th{ {6}}-profil involverad i humoral immunitet och makrofagaktivering av IL-4 [17].

Den låga vattenlösligheten, omfattande metabolismen och enzymatisk nedbrytning begränsar biotillgängligheten och minskar den biofarmakologiska användningen av quercetin som ett terapeutiskt medel[13]. Ett intressant tillvägagångssätt för att övervinna den låga biotillgängligheten av polyfenoler, för att testa och utforska deras in vivo-aktivitet, är den kemiska modifieringen av den naturliga föreningen, vilket ökar lösligheten och saktar ner ämnesomsättningen. Således studeras många syntesvägar, såsom acetylering, tillsats av aminer och bromering, modifiering av oximer och komplexbildning med hydraziner [18-20].

I denna studie utför vi en strukturell modifiering av quercetin, som syftar till att erhålla analogen quercetinpentaacetat (Q5) för utvärdering av antioxidantpotentialen, antiinflammatorisk aktivitet och hämning av tillväxten av cancerceller, hepatokarcinom (HepG2), promyelocytisk leukemi (HL-60) och råttgliomceller (C6).

2. Resultat och diskussion

2.1.Syntes och karaktärisering

För syntesen av det analoga quercetinet (3,3', A',5,7-pentaacetat) användes den totala acetyleringsmetoden, som anpassades till de experimentella förhållanden som finns i litteraturen [21]. På detta sätt bevaras ättiksyraanhydrid som acyleringsmedel och pyridin som katalysator.

Den erhållna produkten (Q5), en gul fast substans, kännetecknades av att ha smältpunkter i intervallet 178-186 grader, kompatibelt med litteraturdata[18]. Dessutom visade den jämförande analysen av FTIR mellan quercetin och produkten frånvaron av absorptionsband i 3400 cm-1 som är karakteristiska för quercetinhydroxyler och genom uppkomsten av band runt 1600-1650 cm-' som indikerar karbonylester , som visar ersättningen av hydroxylgrupper med acetylgrupper: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,892,837 och (Figur 1). Spektrana jämfördes med de som beskrivs i litteraturen [21].

Kärnmagnetisk resonans (NMR)-analyser av quercetinet (Q) och den erhållna produkten (Q5) visade total acetylering, med försvinnandet av singletter som är karakteristiska för hydroxyler över 9 ppm i H NMR-spektrumet (kompletterande figurer S1, S2 och S{ {4}}S6) och uppkomsten av stora och karakteristiska signaler av metyl i de alifatiska områdena i spektrumet, mellan 2 och 3 ppm. För 13C NMR-spektrumet (kompletterande figurer S3 och S7-S9) visade den erhållna produkten en ökning av de representativa signalerna för esterkarbonylerna nära 170 ppm och uppkomsten av signaler mellan 20 och 21 ppm motsvarande kemikalien skiftningar av de fem alifatiska kolen i metyler, verifierade genom integrationen av signalerna. Spektran jämfördes med de som beskrivs i litteraturen [22].

Biasutto et al. [23] var pionjärer i undersökningen av prekursorer baserade på estrar, för att öka biotillgängligheten av quercetin. Baserat på sina studier har Mattarei et al. [21] främjade den totala acetyleringen av quercetin och erhöll Q5-derivatet i högt utbyte (79-97 procent ). På senare tid har Mohajeri et al. [24] erhöll ett utbyte på 85 procent genom att erhålla analog Q5, under uppvärmning (180 grader i 6 timmar). I den föreliggande studien var syntesen av Q5 effektiv och vi erhöll en förening vederbörligen karakteriserad enligt de data som beskrivs i litteraturen.

2.2. Antioxidant ABTS· plus radikal aktivitet

Den jämförande analysen av antioxidantaktiviteten hos Q och Q5 visade att quercetin (Q) var mer aktivt för att avlägsna ABTS* plus radikalen än O5 (29 procent respektive 18 procent), med IC50-värden (i μM) av 188,850±0,003 och 379,560± 0,004 för Q respektive Q5.

Flavonoidernas antioxidantaktivitet är direkt relaterad till deras molekylära struktur. Det finns två mekanismer genom vilka fenolföreningar kan utöva sina antioxidantfunktioner: väteatomöverföring och elektrondonation [25]. Quercetins överlägsna antioxidantaktivitet kan tillskrivas det betydande bidraget från hydroxyler och deras väte, som ersätts av acetyler i Q5-analogen, vilket minskar kapaciteten för vätedonation eller fria radikaler från syntetiska molekyler.

Inga data hittades i den vetenskapliga litteraturen som rapporterar antioxidantaktiviteten hos Q5-föreningen. Åh, et al. [26] utvärderade quercetinesterberedningar och deras antioxidantaktiviteter, vilket visade att quercetin hade den högsta radikalfångande aktiviteten bland de testade proverna. Därför är det höga bidraget från hydroxylgrupperna i antioxidantaktiviteten hos quercetin väsentligt [27].

2.3.Antileishmania-aktivitet

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>100 μM jämfört med amfotericin B （IC501.1 μM±0.1）. Dessutom utvärderades effekterna av Q5 på promastigotformerna av L.amazonenses, och denna förening uppvisade ett lägre IC50-värde （75,1 ± 4,7 μM）för denna art jämfört med L. braziliensis.

Tasdemir et al. [8] jämförde de antitrypanosomala och antileishmaniala aktiviteterna av flavonoider och deras analoger (härledda från quercetin) och fann dem vara potenta och effektiva antiprotozoala medel mot amastigotformer av L donovani (IC50=1.0ug mL -l). För promastigota former av L.amazonensis, Fonseca och Silva et al.[27] hittade IC50=31.4 uM i kulturer behandlade med quercetin inom 48 timmar. Dessutom rapporterade de fullständig celltillväxtstopp med 96 μM quercetin på 96 timmar, vilket visade tillfredsställande antileishmanial-dal-aktivitet. Cataneo et al. [28]utvärderade antipromastigoteffekten av quercetin (upp till 192 μM) mot L.brasiliensis, i peritoneala celler av makrofager. I promastigotkulturer av L. major visade quercetin och dess analoga quercetin-pentaacetat en koncentrationsberoende effekt （IC 50 =2.5±0.92 och 2.85±0.99 μM, respektive 【24】.

Vissa författare har visat att quercetin inducerar död i L amazonensis promastigotes genom mitokondriell membrandysfunktion till följd av produktionen av reaktiva syrearter [27,28] och andra mål, såsom arginas [7], ribonukleotidreduktas [8,29] och topoisomeras II[30]. Resultaten som erhållits i denna studie indikerar att andra tester bör betraktas i perspektiv för de testade föreningarna (Q och Q5), med tanke på i silicotester för undersökning av mål som kan vara involverade i de observerade dödsmekanismerna.

2.4. Antiinflammatoriska och cytotoxicitetsaktiviteter

Sedan fokuserade vi på att utvärdera den biologiska aktiviteten hos det nya derivatet. Först bestämdes icke-toxiska koncentrationer av Q och Q5 i peritoneala makrofager erhållna från BALB/c-möss. CCs0-värdena visade inte cytotoxicitet vid koncentrationer lika med eller mindre än 80 μM (Figur 2A, D). Dexametason var inte cytotoxiskt vid den testade koncentrationen (20 μM). Baserat på detta utfördes efterföljande tester vid koncentrationer som inte översteg 80 μM.

Den immunmodulerande aktiviteten hos Q och Q5 undersöktes för att bestämma effekterna av föreningar på proinflammatorisk mediatorsekretion. De immunmodulerande effekterna av föreningarna (Q och Q5) utvärderades initialt i kulturer av peritoneala makrofager genom produktion av kväveoxid. Som förväntat ökade makrofagaktivering med LPS PLUS IFNy mängden nitritproduktion (Figur 2B, E). Behandling med quercetin hämmade, på ett koncentrationsberoende sätt, produktionen av nitrit (p<>

Pentadaktylföreningen (Q5) visade inte liknande aktivitet vid 20 μM. Intressant nog var aktiviteten signifikant vid de högsta testade koncentrationerna (40 och 80 μM) för båda föreningarna. Vid den högsta testade koncentrationen (80 uM) var effekterna av föreningarna liknande de som observerades i kulturer av aktiverade makrofager och behandlade med 20 μM dexametason. Föreningarna var inte cytotoxiska för peritoneala makrofager vid de testade koncentrationerna （20, 40 och 80 μM）.

För en bättre karakterisering avantiinflammatoriskEffekten av föreningarna (O och O5), kvantifierades det inflammatoriska cytokinet TNF genom metoden Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Makrofagstimulering med LPS plus INF-y inducerade en framträdande ökning av TNF-produktion. Behandling med Q och Q5 minskade signifikant produktionen av TNF (s<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

Reduktionen av inflammatoriska faktorer av quercetin beskrivs mångsidigt, inklusive modulering för Th-2 inflammatoriska profiler, relaterad till skydd vid neurala sjukdomar [31,32]. Den antiinflammatoriska effekten av quercetin är väl beskriven i litteraturen [33,34]. Det finns dock få studier som visar den antiinflammatoriska potentialen hos O5-analogen. Denna studie bekräftar resultaten av Chen et al. [35], som visade rollen av Q och O5 i hämningen av NO-produktionen inducerad av LPS, på ett koncentrationsberoende sätt utan skadliga cytotoxiska effekter för RAW 264.7-makrofaglinjen. Dessutom visade denna studie den oöverträffade effekten av Q5 för att hämma det pro-inflammatoriska cytokinet TNF.

De erhållna data indikerar bevarandet av effekterna på den semisyntetiska molekylen (O5); dock kan doseringen av andra faktorer, såsom cytokinet IL-10, vara ett perspektiv vid utvärderingen av dessa profiler. Därför kan Q5 betraktas som en potentiell molekyl för framtida in vitro- och in vivo-tester som syftar till ett ytterligare terapeutiskt alternativ med antiinflammatorisk aktivitet.

Cytotoxiciteten hos de testade föreningarna (Q och Q5) utvärderades vid 20, 40 och 80 uM med AlamarBlue kolorimetriska metod i en frisk cellinje (MRC-5, humana lungfibroblaster) och i två olika cancercellinjer , HepG2 (humant hepatocellulärt karcinom) och HL-60 (human promyelocytisk leukemi), såsom visas i figur 3. Doxorubicin var standardläkemedlet som användes som en positiv kontroll.

Som visas i figur 3, för HepG2-celler, visade quercetin (Q) inte signifikant cytotoxisk aktivitet vid den högsta undersökta koncentrationen (80 μM) och dess pentaacetatanalog (Q5) visade minskad aktivitet (IC{{4) }}.9μM). För cancercellinjen HL-60 visades quercetin inte vara särskilt aktivt (IC50=51.3 uM); Men intressant nog var Q5 betydligt mer aktivt än quercetin med ett IC50 på 33,6 uM. Standardläkemedlet doxorubicin hade IC50-värden från 0,1 till 0,2 uM för cancercellinjer som visade signifikanta cytotoxiska effekter mot den friska cellinjen MRC-5(Tabell 1), vilket inte sågs för föreningarna (Q och Q5) .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, som visar en selektiv profil mot cancercellinjen. Få studier har visat aktiviteten av quercetin O5-analogen i cancercellinjer. Q5-aktivitet i en HeLa-tumörcellslinje dokumenterades emellertid av Danihelovået al. [22], som visade att acetylerade estrar av quercetin var de mest effektiva cytotoxiska derivaten. Inga data hittades om den cytotoxiska rollen av Q5 i HepG2-härstamningsceller. Endast en studie hittades i litteraturen som avslöjade att den tetraacetylerade analogen av quercetin hade en signifikant effekt på hämningen av HL-60-härstamningsceller genom aktivering av kaspas-3, vilket främjade apoptos [36].

En MTT-analys med kolorimetrisk metod användes för att komma åt cytotoxiciteten i C6-cellkultur. Quercetin och Q5 inducerade en minskning av 57{{10}} nm MTT-absorbans som representerar mitokondriell dehydrogenasaktivitet och antyder en minskning av cellviabiliteten i C6-celler. Som avslöjas i figur 4, quercetin-inducerad cytotoxicitet i C6-celler i koncentrationer högre än 25 uM under 72 timmar (Figur 4A), medan 0.78 μM av Q5 under 72 timmar kunde minska cellviabiliteten (Figur 4B) ). Det observerades att 50 uM quercetin(O) och O5 minskade cellviabiliteten till 41,3 procent ± 2,9 procent respektive 47,5 procent ±1,2 procent jämfört med kontrollgruppen (100,0 procent ±6,4 procent) (Figur 4A, B) . Inga signifikanta förändringar i cellviabilitet visualiserades i C6-kulturer behandlade med DMSO (0,05 procent), jämfört med obehandlade celler.

Baserat på de erhållna resultaten undersökte vi sedan de morfologiska effekterna av föreningarna Q och Q5 (50 μM) på C6-cellerna, vid 24, 48 och 72 timmar efter behandlingen, med hjälp av optisk mikroskopi. Quercetinpentaacetat (Q5) vid 50 μM inducerade förändringar i morfologin hos C6-gliomceller inom de första 24 timmarna, med en synlig minskning av cytoplasmatiska förlängningar jämfört med kontrollgruppen (Figur 5). Efter 48 timmars behandling med Q5 antog cellerna en avrundad morfologi kännetecknad av tillbakadragning av cellkroppen och formlöst membran (vilket inte rapporterades i den vetenskapliga litteraturen), till skillnad från quercetin, som under denna behandlingstid uppvisade en morfologisk aspekt liknande fibroblaster [37]. Alla andra morfologiska förändringar visualiserades i celler under andra behandlingsförhållanden.

Hydroxylsubstitutionen av acetylgrupperna kan främja förbättrad cellulär absorption av quercetinanalogerna, vilket gynnar olika biologiska tester, särskilt i cancerceller [38,39]. Bispo da Silva et al. [40] visade, genom att behandla C6-celler med flavonoiderna rutin och quercetin, en signifikant minskning av andelen vidhäftande C6-celler, med en tunnare och bipolär morfologisk fenotyp, jämfört med kontrollkulturer. Behandling av C6-celler med flavonoider hämmade de migrerande egenskaperna hos livskraftiga C6-celler efter 24 timmars behandling. Under kontrollförhållanden uppvisade mikroglia en rundare fenotyp; efter rutinbehandling förvärvade mer än 50 procent av cellerna en grenad, multipolär fenotyp, och de andra förvärvade amöboidfenotypen, vilket båda indikerar aktivering.

Studier indikerar att quercetin interfererar i regleringen av cellsignaltransduktionsvägar associerade med celldöd genom apoptos och i stadierna av cellcykelprogression [41,42]. Santos et al. [14] indikerade en potentiell minskning av tillväxten av GL-15 humana glioblastomceller. Bi et al. [43] visualiserade en induktion av autofagi av U87 och U251 humana glioblastomceller på ett dosberoende sätt.

De erhållna resultaten bekräftar med Danihelova et al. [22], där acetylgrupperna infogade i quercetinmolekylen främjade en förbättring av anticanceraktivitet. Dessutom indikerade de en större tropism för cancerceller, särskilt för celler av neurala linjer. Denna studie är oöverträffad i förhållande till O5-analogen vid behandling av C6-gliomceller. Dell'Albani et al. [44] visade en bättre verkan av acylderivat av quercetin i kulturer av humana gliomstammar U373-MG och murint gliom 9L, vilket indikerar dödsvägar genom apoptos. Modifieringen av cellmorfologi till en avrundad profil kan hänvisa till dödsmekanismer, såsom apoptos, som allmänt tillskrivs quercetin [45-47]. I framtida perspektiv kan tester med friska neurala celler hjälpa till att belysa denna hypotes.

3. Material och metoder

3.1.Reagens och material

Alla reagenser (quercetin, pyridin, ättiksyraanhydrid, trikoloroisocyanursyra, diklormetan, 2,4-dinitro-fenylhydrazin, hydroxylaminhydroklorid, natriumacetat, petroleumeter, svavelsyra, kaliumpersulfat och nitrat av analytisk kvalitet) var kommersiellt tillgängliga (Ouimex, Merck, Brasilien och Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). För beredning av alla standardlösningar och prover användes ultrarent vatten (med resistivitet 18 MOcm-I) erhållet från Milli-Q Plus vattenreningssystem (Millipore, Molsheim, Frankrike). Alla laboratorieglasvaror tvättades i en 10 % （ o/ø） HNO3-lösning i 24 timmar, sköljd med högrent vatten och torkad vid rumstemperatur.

3.2. Syntes och karaktärisering

Den strukturella analogen erhölls efterquercetinmolekylär modifiering från den mer tillgängliga och reproducerbara syntetiska vägen (Penta-acetylering). Vi tillämpade principerna för grön kemi med minimering av substansanvändning. Pentadaktylanalogen (Q5) erhölls efter molekylär modifiering av quercetin, från en syntetisk väg, som använder ättiksyraanhydrid som ett acyleringsmedel och pyridin som en katalysator.

Blandningen innehållande quercetin (300 mg, 1 t.ex.), ättiksyraanhydrid (0,80 mL, 20 t.ex.) och pyridin (7,5 mL) hölls under magnetisk omröring vid rumstemperatur. Efter 24 timmars omrörning sattes 250 ml diklormetan till reaktionsmediet. Därefter tvättades reaktionen med 10 % HCl (3 x 100 ml), utspädd NaOH (3 x 50 ml) och vatten (3 x 100 ml); torkas över vattenfritt natriumsulfat; filtrerad; och indunstades i rotationsindunstaren (Fisatom, Minas Gerais, Brasilien)[21]. Mängden O5 och det erhållna utbytet var 280 mg respektive 54 procent.

Den strukturella modifieringsreaktionen för quercetinmolekylen övervakades med tunnskiktskromatografi (TLC) med användning av en blandning av hexan och etylacetat (1:1) som lösningsmedel. För den fysikalisk-kemiska karakteriseringen användes smältpunkten. Fourier Transform Infrared (FTIR)-tester med Atenuated Total Reflection (ATR)-metoden utfördes av en FTIR Spectrum 100S-modell (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA), med förvärvet av skanningsspektra i mellaninfrarött (4000 till 600 cm-1).

Provet (massa~5,0 mg) placerades på ATR-kristallen och utsattes för ett tryck av ungefär 20 N med hjälp av en manuell mekanisk press. FTIR-spektra spårades av OriginPro8-mjukvaran, OriginLAB4 (www.originlab.com, tillgänglig 10 september 2021). Kärnmagnetresonans(NMR)spektra registrerades i en Bruker Avance IⅢI500 MHz (Uster, Schweiz) spektrometer -500 MHz för 1H NMR och 125 MHz för 13C NMR, med användning av DMSO som lösningsmedel. Kemiska skift uttrycktes i ppm-skalan (ug/ml), och kloroform (CHCla) användes som intern referens.

NMR-spektra bearbetades av TopSpin⑤4.0 programvara (Bruker Biospin, Coventry, Storbritannien) och jämfördes med litteraturdata [38]. NMR-data var: 'H NMR(500 MHz, CDCI3)2.34(6H,s,-OCOCH3);2.35(3H,s,-OCOCH3);2.35(3H,s, -OCOCH3);2,44(3H, s,-OCOCH3);6,88(IH,d, J=2,5 Hz);7,34(IH,d,J=2.0 Hz);7,36(1H,d,J=8.5);7.70 (1Hd, J=2.0Hz);7.73(1H,dd,J1=8,5 Hz,J 2=2.0Hz）;13CNMR（125 MHz, CDCl3）δ 170.04;169.24;167.86;167.79;156.87;154.28;150.43;144.04;2127.40;2127.40;2127.40;2127.40;2127.40;2127.42; ;113.89;108.96;21.16;21.02;20.65; och 20.49.

3.3. Antioxidant ABTS* plus radikal aktivitet

ABTS* plus-sekvestreringsaktiviteten anpassades från den metod som beskrivs av Dorman och Hiltunen[48]. Kaliumpersulfat och ABTS (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) löstes i destillerat vatten för att bilda en slutlig koncentration av 2,45 mM respektive 7 mM. ABTS-lösningen framställdes genom att tillsätta båda lösningarna i en hastighet av 1:1, och sedan inkuberades lösningen vid rumstemperatur i 16 timmar i mörker.

Den resulterande lösningen, intensivt färgad, justerades med etanol, i spektrofotometern, till en absorbans av {{0}}.7±0,05 nm vid 734 nm före användning. Vi använde 30 μL av proverna, eller Trolox (Sigma Aldrich⑧, St.Louis, MO), som referensstandard vid olika koncentrationer (5,10,25,50,75 och 100 μM), sattes till 3 mL av ABTS* plus lösning och väntade på att reagera i 6 min. Absorbansen mättes vid 734 nm mot en blank (etanol). ABTS· plus spolningskapaciteten beräknades som:

ABTS* plus reningseffekt ( procent ){{0}} (1- A0/A1)×100;

där A0 är absorbansen för kontrollen och A1 är absorbansen för provet eller standarden. Alla bestämningar utfördes i triplikat. IC5so-värden beräknades och uttrycktes som medelvärde ± SD i μM.

3.4.Antileishmania-aktivitet

Lamazonensis (MHOM/BR88/BA-125Leila-stam) och Lbraziliensis (MHOM/BR88/BA-3456)promastigotes (1 × 10 grader per brunn) odlades i en 96-brunnsplatta i Schneider-medium (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS; GIBCO) och 50 ug mL-'gentamicin (Life, Carlsbad, CA, USA) och utsatt för behandling med olika koncentrationer（ 100 μM; sex spädningar 1∶2） av Q5. Parasiterna inkuberades i 72 timmar vid 26 grader. Sedan tillsattes 20 μL/brunn av AlamarBlue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) under 2 timmar. Avläsningen utfördes i en spektrofotometer med användning av våglängder på 570 och 600 nm. Beräkningen av axenisk kulturinhibering bestämdes baserat på den obehandlade kontrollen [49].

3.5. Antiinflammatoriska och cytotoxicitetsaktiviteter

3.5.1.Droger

Dexametason (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), en syntetisk glukokortikoid, användes som en positiv kontroll i immunmodulerande analyser. Doxorubicin (doxorubicinhydroklorid, Laboratory IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) användes som referensläkemedel mot cancer. Alla föreningar löstes i dimetylsulfoxid (DMSO; PanReac, Barcelona, ​​Spanien) och späddes i ett cellodlingsmedium för användning i analyserna. Den slutliga koncentrationen av DMSO var mindre än 1 procent i alla experiment.

3.5.2.Djur

BALB/c-möss, 4-10 veckor gamla, tillhandahölls av vivarium från Goncalo Moniz Institute/FIOCRUZ-BA (IGM, Salvador, Bahia, Brasilien) där de hölls i burar som innehöll högst fem möss. Alla burar hölls i ett acklimatiserat rum vid 21 grader ±1 grad, på en 12-h ljus/mörker-cykel, med vatten och mat ad libitum under hela experimentperioden. Försöken med djur godkändes av Ethics and Animal Use Committee vid Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA Institute (IGM-018/15).

3.5.3. Celler

HL-60(human akut promyelocytisk leukemi) och HepG2(humant hepatocellulärt karcinom) erhölls från American Type Culture Collection-ATCC(Rockville, ML.USA), användes. För att bedöma selektiviteten för quercetin(O) och O5-derivatet på proliferationen av icke-cancerceller, användes MRC-5-linjen (human lungfibroblast), även erhållen från ATCC. Celllinjer odlades i cell odlingsflaskor (75 cm3 250 ml volym) med RPMI 1640 odlingsmedium (GibcoTM) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (GibcoM) och 50 ug/ml gentamicin (GibcoTM). Cellerna hölls i inkubatorer med en atmosfär av 5 procent CO, vid 37 grader och övervakas dagligen. Alla cellinjer testades för mykoplasma med användning av ett Hoechst-färgningsmykoplasma-detektionskit (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). C6-cellinje härleddes från råttglialtumörer inducerade av n-nitrosometylurea [50]. Dessa gliomceller odlades såsom beskrivits av de Oliveira et al. [51]. Cellerna inkuberades vid 37 grader i en fuktad inkubator vid 5 procent CO2. C6-celler odlades på cellodlingsskålar (100- mm Ø, TPP) i DMEM-medium kompletterat med 100 UI/mL penicillin G, 100 ug/mL streptomycin, 7 mM glukos, 2 mM L-glutamin, 1 mM pyruvat, och 10 procent fetalt kalvserum. Odlingsmediet byttes varannan dag. Tjugofyra timmar före behandlingar såddes C6-celler i petriskålar med 35 mm i diameter eller 96-brunnsplattor med en densitet av 3,5 × 10* celler/brunn.

Alla cellinjer testades för mykoplasma med användning av Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich) för att validera användningen av celler fria från kontaminering. Celllinjeinformationen finns i databasen "Cell Bank of Rio de Janeiro (BCRJ)": HepG2-cell(kod: 0291), HL-60-cell (kod: 0104) och C6-cell (kod: 0057) .

3.5.4. Cytotoxisk aktivitetsanalys

För att bedöma cytotoxiciteten hos de testade föreningarna (Q och Q5) på HL-60 (human akut promyelocytisk leukemi) och HepG2-celler, användes den kolorimetriska metoden av Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Alamar Blue (resazurin) är en indikator som producerar en kolorimetrisk förändring och en fluorescerande signal som svar på metabolisk aktivitet. Resazurin reduceras till resorufin av metaboliskt aktiva celler. Den oxiderade formen är blå (icke-fluorescerande/icke-viabla cell), och den reducerade formen är rosa (fluorescerande/viable cell). Reduktionen av resazurin till resorufin återspeglar cellviabilitet [52].

I analysen fördelades celler i {{0}}brunnsplattor med en fördefinierad densitet av 0.3×1{{10}} graders celler/ml för celler av HL-60-linjen och 0.7× 10 celler/ml för celler av HepG2-linjen. Föreningarna tillsattes i en serie om åtta koncentrationer (80 till 0,62 uM), med undantag av doxorubicin, som användes i koncentrationer från 0,003 till 5 μM. Den negativa kontrollen fick samma mängd DMSO (0,025 procent). Plattorna inkuberades under 72 timmar i en ugn vid 37 grader och 5 procent CO2. Efter denna period tillsattes 20 μL/brunn av Alamar Blue och plattorna inkuberades i ytterligare 4 timmar. Plattorna avlästes med användning av en spektrofotometer (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), vid våglängder på 570 och 600 nm.

C6-cellviabiliteten bestämdes med användning av den kolorimetriska metoden beskriven av Hansen et al. [53]. MTT(3-4,5-dimetyltiazol-2-yl,25-difenyltetrazoliumbromid) löstes i en koncentration av 5 mg/ml i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i rummet temperatur, och lösningen steriliserades ytterligare genom att passera genom ett 0.2-mm filter och förvarades vid 4 grader i mörker. I analysen fördelades celler i 96-brunnsplattor med en fördefinierad densitet på 3,5 × 10* celler/ml för C6-cellslinjen. Föreningarna tillsattes i en serie av åtta koncentrationer (80 till 0,39 uM).

MTT sattes till varje brunn vid en slutlig koncentration av 2 mg/ml och cellerna inkuberades i 2 timmar. Därefter lyserades celler med 20 procent (w/ø) natriumdodecylsulfat (SDS) och 50 procent (o/ø) dimetylformamid (DMF) lösning (pH 4,7) i en inkubation över natten vid rumstemperatur [54] . Absorbansen mättes med en spektrofotometer mikroplattläsare (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (version 3001, Thermo Fisher Scientific, Vanda, Finland). Åtta replikat användes för varje koncentration. Cellviabilitet uttrycktes som andelen absorbans vid 570 nm, och kontrollen antogs som 100 procent. Efter behandlingar utvärderades cellmorfologin genom ljusmikroskopi med användning av ett optiskt mikroskop (Eclipse TS100 inverterat mikroskop, Nikon Instruments, Tokyo, Japan) och fotograferades med hjälp av en digitalkamera (Coolpix S4300, Nikon Instruments, Tokyo, Japan).

3.5.5. Makrofagkultur

Peritoneala exsudatmakrofager (2×105 celler/brunn) inkuberades i 96-brunnsplattor i DMEM-medium kompletterat med 10 procent PBS och 50 ug/ml gentamicin, i tre exemplar, stimulerade eller inte med LPS (500 ng/mL) och IFN-y （5 ng/ml） och behandlade eller inte med olika koncentrationer av föreningar (20,40 och 80 uM). Cellerna hölls i en inkubator vid 37 grader och 5 procent CO2 i 4 24 timmar. Efter denna period samlades odlingssupernatanterna in för cytokin- och kväveoxiddosering. I vissa analyser, för att bedöma cytotoxiciteten, ersattes supernatanten med medium-plus 10 procent Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) och plattorna inkuberades i ytterligare 4 timmar. Spektrofotometeravläsningen utfördes vid 570 och 600 nm.

3.5.6. TNF-dosering

TNF-mätning utfördes från cellkultursupernatanter, med användning av sandwich ELISA-teknik, med användning av Development System kitsDuoset ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA), enligt tillverkarens rekommendationer. ELISA-plattor （NUNC—IMMUNO PLATE Maxisorp Surface） sensibiliserades med 50 μL/brunn av infångningsantikroppen, i en koncentration av 2 ug/ml, utspädd i PBS 1x och inkuberades i 16 timmar vid 4 grader. Plattorna tvättades tre gånger med 1 × PBS/0.05 procent tween 20 och blockerades med 100 μL/brunn av 1× PBS och 0,05 procent tween 20 och 0,1 procent bovint albumin under 2 timmar .

Därefter, 50 μL/brunn av prover, en blank och standardkurva av rekombinanter utspädda i Tris-saltlösningsbuffert (20 mM Trix i basen och 150 mM NaCl) innehållande 0,1 procent bovint albumin och 0,05 procent tillsattes mellan 20 under 2 timmar vid rumstemperatur. Standarden späddes i serie (1:2), från den initiala koncentrationen av 2000 pg/ml, med 11 dubbla spädningar. Plattan tvättades tre gånger med PBS/0,05 procent tween och inkuberades med 50 μL av detektionsantikroppen (biotinylerad) vid en koncentration av 400 ng/ml under en period av 2 timmar.

Plattan tvättades tre gånger med PBS/{{0}}.05 procent tween och inkuberades i 20 minuter med avidin-peroxidas utspätt 1:200. Utvecklingen genomfördes genom tillsats av TMB-substrat (Thermo Fisher) och avbröts med 0,05 M fosforsyra. Avläsningen av reaktionen bestämdes med användning av en spektrofotometer (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), med ett 450 nm filter. Analyser utfördes med hjälp av programvaran Softmax 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

3.5.7. Dosering av kväveoxid

Produktionen av nitrit i supernatanter av makrofager uppskattades genom kvantifiering av dess oxidativa produkt, nitrit, med Griess-metoden [50]. Absorbansen bestämdes i en spektrofotometer (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), med ett 570 nm filter. Analyser utfördes med Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), och resultaten uttrycktes i μM nitrit, baserat på en standardkurva av natriumnitrit med en initial koncentration på 400 uM.

3.6. Statistisk analys

Envägs ANOVA-testet följt av Bonferronis multipla jämförelse efter testet användes för att bestämma den statistiska signifikansen av jämförelserna mellan grupperna i studierna. Resultaten ansågs statistiskt signifikanta när sid<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4. Sammanfattningar

Betingelserna och reaktionssyntesmedierna för quercetinanaloger visade effektivitet i att erhålla en förening vederbörligen karakteriserad, enligt de data som beskrivs i litteraturen. Den jämförande analysen av antioxidantaktiviteten hos Q och Q5 visade att quercetin (O) var mer aktivt för att avlägsna ABTS* plus radikalen än O5 (29 procent respektive 18 procent). Den minskade antioxidantpotentialen visade inte interferens i immunmodulerande och antitumorala aktiviteter. De kemiska modifieringarna som föreslagits i denna studie förstärkte den antiproliferativa effekten och bibehöll den antiinflammatoriska aktiviteten men inte cytotoxicitetsaktiviteten i friska testade celler.

Det närvarande acetylerade derivatet (Q5) förbättrade cytotoxiciteten i cancerhepatocellulära celler (HepG2), promyelocytisk leukemi (LH-60)-celler och i synnerhet i gliom (C6)-celler. Råttgliom C6-cellerna som handlades visade ett morfologiskt aldrig tidigare skådat mönster av celldöd. Q5 vid 50 μM under 24 timmar inducerade förändringar i C6gliom-cellmorfologi som kännetecknas av en rund kroppsform (vilket inte rapporterades i den vetenskapliga litteraturen), till skillnad från quercetin, som presenterade en fibroblastliknande morfologi.

Ytterligare undersökningar måste göras för att bättre förstå effekterna av acetylerade derivat av quercetin, särskilt i neuronala celler. Denna studie möjliggjorde, för första gången, tillämpningen av strukturellt modifierat quercetin i neurala celler för potentiella neuroprotektiva effekter.

Referenser

1. Formica, JV; Regelson, W. Genomgång av biologin av quercetin och relaterade bioflavonoider. Food Chem. Toxicol. 1995, 33, 1061-1080. [CrossRef]

2. Materska, M. Quercetin och dess derivat: Kemisk struktur och bioaktivitet — En översikt. Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, 58, 407–413.

3. Wang, TY; Li, Q.; Bi, KS Bioaktiva flavonoider i medicinalväxter: struktur, aktivitet och biologiskt öde. Asiaten J. Pharm. Sci. 2018, 13, 12–23. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Andrea, G. Quercetin: En flflavonol med mångfacetterade terapeutiska tillämpningar? Fitoterapia 2015, 106, 256–271. [CrossRef]

5. Araújo, MV; Queiroz, AC; Silva, JFM; Silva, AE; Silva, JKS; Silva, GR; Silva, ECO; Souza, ST; Fonseca, EJS; Camara, CA; et al. Flavonoider inducerar celldöd i Leishmania amazonensis: In vitro karakterisering med flödescytometri och Raman-spektroskopi. Analytiker 2019, 144, 5232–5244. [CrossRef] [PubMed]

6. Faixová, D.; Hrˇcková, G.; Kubašková, TM; Mudro ˇnová, D. Antiparasitiska effekter av utvalda isofflavoner på flätmaskar. Helminthology 2021, 58, 1–16. [CrossRef]

7. Manjolin, LC; Reis, MBG; Maquiaveli, CC; Santos-Filho, OA; Silva, ER Dietära flavonoider fisetin, luteolin och deras härledda föreningar hämmar arginas, ett centralt enzym i Leishmania (Leishmania) amazonensis-infektion. Food Chem. 2013, 141, 2253–2262. [CrossRef]

8. Tasdemir, D.; Kaiser, M.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, TJ; Tosun, F.; Rüedi1, P. Antitrypanosomal och antileishmanial verksamhet av flflavonoider och deras analoger: In vitro, in vivo, struktur-aktivitetsförhållande och kvantitativa struktur-aktivitetsförhållandestudier. Antimikrob. Agenter Chemother. 2006, 50, 1352–1364. [CrossRef] 9. Lee, WJ; Hsiao, M.; Chang, JL; Yang, SF; Tseng, TH; Chang, CW; Chow, JM; Lin, KH; Lin, YW; Liu, CC; et al. Quercetin inducerar mitokondriehärledd apoptos via reaktiva syrespecies-medierad ERK-aktivering i HL-60 leukemiceller och xenotransplantat. Båge. Toxicol. 2015, 89, 1103–1117. [CrossRef]

10. Drummond, EM; Harbourne, N.; Marete, E.; Martyn, D.; Jacquier, J.; O'Riordan, D.; Gibney, ER Hämning av pro-inflammatoriska biomarkörer i THP1-makrofager av polyfenoler som härrör från kamomill, ängssöt och pilbark. Phytother Res. 2013, 27, 588–594. [CrossRef]