Studie om bestämningsmetoden för tallkottsglykosid och ergosterolglykosidinnehåll i Cistanche Tubulosa

Cistanche tubulosa är en torr köttig stam med fjällande blad som tillhör släktet Cistanche av familjen Ledaceae. Den är varm till sin natur, söt och salt i smaken och tillhör njur- och tjocktarmens meridianer. Det har traditionella effekter som tonifierande njuryang, närande essens och blod, fuktar tarmarna och främjar tarmrörelser och fördröjer åldrandet. Det är känt som "Desert Ginseng". Från och med 2010 års upplaga av Folkrepubliken Kinas farmakopé, har Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight lagts till som en av de lagstadgade basalväxterna i Cistanche och listas tillsammans med C. deserticola.

Cistanche tubulosa produceras huvudsakligen längs den södra kanten av Tarimbassängen i Xinjiang Uygurs autonoma region, och växer parasitiskt på rötterna av Tamarix-växter. Det är den primära källan till Cistanche tubulosa medicinska material på Kinas marknad för närvarande, med en årlig produktion som står för mer än 60%. På grund av den ökande bristen på vilda resurser har den listats som en andra klassens skyddad växt i National Key Protected Wild Plant List (2021-utgåvan).

Modern farmakologisk forskning har visat att den farmakologiska kärnsubstansen i Cistanche tubulosa är baserad på fenyletanoidglykosider (PhGs), bland vilka Echinacoside (C35H46O20) och Acteoside/verbascoside (C29H36O15) har det högsta innehållet och den starkaste aktiviteten, och de är explicit utformade för att kontrollera den medicinska tubulosa-kvaliteten, och de är explicit utformade för att kontrollera den medicinska tubulosakvaliteten. Kinesisk farmakopé. Enligt 2020 års upplaga av den kinesiska farmakopén bör den totala mängden echinakrosid och verbascosid i den torkade produkten av Cistanche tubulosa inte vara mindre än 1,5 %, vilket är mycket högre än standarden på 0,30 % för Cistanche tubulosa i öknen. Att etablera korrekta, effektiva och reproducerbara metoder för bestämning av innehåll är därför av stor betydelse för kvalitetskontroll, ursprungsutvärdering, planteringsoptimering och produktutveckling av Cistanche tubulosa medicinska material.

Echinoside, den huvudsakliga kemiska komponenten i Cistanche tubulosa

Acteosid, den huvudsakliga kemiska komponenten i Cistanche tubulosa

Kemiska egenskaper hos Pinecone Chrysanthemum Glycoside och Ergotamin Glycoside

kemisk struktur

Pineconglykosid och ergosterolglykosid är båda fenyletanoidglykosider, vars grundskelett består av en fenyletanoidkärna ansluten genom glykosidbindningar till sockergrupper (vanligtvis glukos och ramnos), och substituerade grupper såsom koffeoylgrupper introduceras vid fenolpositionen. Molekylformeln för echinakosid är C35H46O20, med en relativ molekylvikt på 786,72. Dess struktur innehåller en koffeoylgrupp, en glukosgrupp och en ramnosgrupp. Den molekylära formeln för ergosterolglykosid (verbascoside) är C29H36O15, med en relativ molekylvikt på 624,59. Dess struktur liknar den hos pinealosid, men den saknar ramnos och vissa koffeoylsubstitutioner. Båda är lättlösliga i polära lösningsmedel som metanol, etanol och vatten och har karakteristisk absorption i det ultravioletta området (maximal absorptionsvåglängd runt 330 nm), vilket ger en teoretisk grund för HPLC-UV-detektion.

Farmakologisk aktivitet

Pinecon krysantemum-glykosid och ergosterolglykosid har ett brett spektrum av farmakologiska aktiviteter: (1) antioxidanteffekt - genom att rensa superoxidanjoner (O2 · -), hydroxylradikaler (· OH) och väteperoxid (H2O2), aktiverar Nrf2/ARE-signalvägen för Px, och uppreglerar aktiviteten av enzymer Px och GSH; (2) Neuroprotektiv effekt - främjar uttrycket av neurotrofiska faktorer såsom GDNF, som har en förbättrande effekt på modeller för Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom; (3) Hormonliknande effekter - främja uttrycket av testosteronsyntesrelaterade enzymer och förbättra reproduktionsfunktionen; (4) Leverskyddande effekt - minskar alkoholisk leverskada och oxidativ stress; (5) Antitumöreffekt - inducerar apoptos av cancerceller i matstrupen genom mitokondrieberoende vägar. Ovanstående aktiviteter gör dem till oersättliga indikatorkomponenter för kvalitetsutvärdering av Cistanche tubulosa.

Effekter av cistanche-antitumör

Översikt över metoder för innehållsbestämning

För närvarande inkluderar metoderna för att bestämma halten av tallkottsglykosid och ergosterolglykosid i Cistanche tubulosa främst högpresterande vätskekromatografi (HPLC), ultrahögpresterande vätskekromatografi (UPLC), tunnskiktskromatografi bilddigitalisering (TLC ImageJ) och vätskemassspektromatografi (LCMS-kromatografi/tandemkromatografi). Bland dem har HPLC-metoden antagits som den juridiska bestämningsmetoden av den kinesiska farmakopén på grund av dess höga utrustningspopularitet, enkla användning och goda reproducerbarhet, och är för närvarande den mest rapporterade metoden i litteraturen. Följande fokuserar på systemetableringen och optimeringsprocessen för HPLC-metoden.

Olika ursprungs och värdars inflytande på innehållet

Skillnader i ursprung

Flera studier har genomgående visat att det finns signifikanta skillnader i halten av echinakrosid och ergosterol i Cistanche tubulosa från olika regioner. Med Xinjiang som exempel kan skillnaden i innehållet av två komponenter i prover från platser som Hetian Moyu County, Kashgar Jiashi County och Alar City nå 2-5 gånger. Generellt sett är den totala mängden fenyletanoidglykosider i Cistanche tubulosa som produceras i Hotan-området (särskilt Moyu County, Minfeng County och Yutian County) relativt hög, och halten av fenyletanoidglykosider i vissa högkvalitativa prover kan nå 2,5 % till 5,0 %, vilket vida överstiger standarden för pharmacopoeia på 1,5 %.

Olika värdinfluenser

Cistanche tubulosa parasiterar rötterna hos olika växter i släktet Tamarix, och värdarterna har en betydande inverkan på kvaliteten på medicinska material. Chen et al. (2005) rapporterade att halten av fenyletanolsyra i prover parasiterade på T. talama kanensis generellt sett var högre än den som parasiterat på T. ramosissima. Dessutom finns det skillnader mellan vilda och odlade produkter. Generellt är halten av två komponenter i vilda produkter högre än i odlade produkter, men högkvalitativa odlade produkter kan också uppnå högre nivåer genom att optimera planteringsförhållandena.

Skillnader i specifikationer och delar

Specifikationerna (diameter, längd) och medicinska delar av Cistanche tubulosa har också inverkan på dess innehåll. Forskning har visat att halten av echinakosid och ergosterol i tunnare köttiga stjälkar ofta är högre än i tjockare stjälkar; Halten i den övre delen av stjälken (nära blomställningsänden) är vanligtvis högre än i basen. Denna regel ger en referens för val av delar under skörd och bearbetning av medicinska örter.

Introduktion till andra mätmetoder

Ultrahögpresterande vätskekromatografi (UPLC)

Cistanche tubulosa experiment

Klicka här för att se Cistanche Tubulosa Extract Natural Supplement Powder

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / WhatsApp: 0086 18599088692 / WeChat: 18599088692

UPLC-metoden använder en kromatografikolonn med en mindre partikelstorlek (såsom Waters HSS T3, 1,8 μm, 100 × 2,1 mm), en flödeshastighet på 0,3 mL/min, en injektionsvolym på endast 1 μ L, och analystiden kan förkortas till 10-350 min. känslighet. Liang Jiansong et al. (2021) etablerade en UPLC-metod för samtidig bestämning av sex fenyletanolglykosider, som har ett brett linjärt område och hög återvinningshastighet, och är lämplig för snabb screening av stora mängder prover.

LC-MS/MS-metod

Vätskekromatografi-tandemmasspektrometrimetoden har extremt hög känslighet och kan samtidigt bestämma dussintals komponenter i Cistanche tubulosa, inklusive echinakosid, ergosterolglykosid, isoergosterolglykosid och guanosin A. Den är lämplig för metabolomisk forskning och omfattande kvalitetsutvärdering. Den kombinerade RPLC-HILIC-tekniken kan till och med mäta 23 polära och opolära komponenter samtidigt, vilket täcker ett innehållsintervall på 5 storleksordningar.

Online trycksatt lösningsmedelsmikroextraktion virvelströmskromatografi HPLC-metod

Denna metod kopplar provextraktion, rening och kromatografisk separation online, vilket avsevärt minskar förbrukningen av organiska lösningsmedel och provanvändning. LOQ för de tre fenyletanolglykosiderna är 0,50 mg/L (echinakosid), 0,25 mg/L (ergosterolglykosid) respektive 0,38 mg/L (isoergosterolglykosid), vilka är lämpliga för snabb analys av värdefulla prover.

TLC Image Digitalization Method

cistancheextraktpulver

Baserat på ImageJ-mjukvaran utfördes kvantitativ analys på gråvärdena för tunnskiktskromatografifläckar. Korrelationskoefficienterna r för tallkottkrysantemumglykosid, guanosin A, ergosterolglykosid och isoergosterolglykosid var 0,9974, 0,9931, 0,9923 respektive 0,9890, vilket var förenligt med HPLC-metoden. Denna metod är låg kostnad, enkel att använda och lämpar sig för snabb screening i gräsrotsenheter och fält.

diskussion

Nyckelfrågor för att optimera kromatografiska förhållanden

Valet av mobil fas är avgörande i utvecklingen av HPLC-metoder. Litteraturjämförelse visar att: (1) vattenacetonitrilsystemet är benäget att orsaka svans av fenyletanolglykosidtoppen, och tillsats av 0,1 % myrsyra eller 1 % ättiksyra kan avsevärt förbättra toppformen; (2) Separationseffektiviteten för det ternära systemet med metanolacetonitrilättiksyra är överlägsen den för det binära systemet med ren metanol eller ren acetonitril; (3) Detekteringsvåglängdsvalet på 330-334 nm kan balansera absorptionsintensiteten för båda komponenterna, med ett något högre svar vid 334 nm och mindre interferens från ergosterol vid 330 nm. Kolonntemperaturen har en inverkan på retentionstiden men ändrar inte signifikant separationsgrad, med ett rimligt intervall på 30-35 grader.

Optimering av extraktionsmetoder

Lösningsmedelskoncentrationen, förhållandet mellan fast och vätska, ultraljudstemperatur och tid påverkar alla extraktionseffektiviteten. Forskning har visat att: (1) 50%~80% metanol eller etanol effektivt kan extrahera båda glykosidkomponenterna, med en något högre extraktionshastighet på 60%~80% etanol; (2) Ett förhållande mellan fast och vätska på 1:30~1:50 (g/ml) är tillräckligt för noggrann extraktion; (3) Den optimala kombinationen är en ultraljudstemperatur på 50-60 grader och en tid på 40 min; (4) Ultraljudsextraktion är överlägsen återflödesextraktion, eftersom den senare lätt kan leda till nedbrytning av värmekänsliga fenyletanolglykosider.

Diskussion om farmakopéns rationalitet

Den nuvarande farmakopén föreskriver att den totala mängden paeoniflorin och ergosterolglykosider i Cistanche tubulosa ska vara större än eller lika med 1,5 %. Denna standard är relativt lös - högkvalitativa prover från Xinjiang når vanligtvis 3% till 5%, med endast ett fåtal lågkvalitativa prover som närmar sig den nedre gränsen. Vissa forskare föreslår att man höjer standarden till 2,0 % till 2,5 % för att bättre säkerställa kvaliteten på medicinska material. Dessutom använder farmakopén endast två komponenter som indikatorer, medan Cistanche tubulosa också innehåller olika aktiva fenyletanolglykosider som guanosin A, isoergosterolglykosider och hesperidin. Multi-indikator omfattande utvärdering är den framtida utvecklingsriktningen.

Förslag på metodval

För kvalitetskontroll av allmänmedicinskt material och daglig produktionskvalitetskontroll rekommenderas att man använder farmakopé-HPLC-metoden. Metoden är mogen, utrustningskraven låga och resultaten är mycket jämförbara. För storskalig provscreening eller värdefull provanalys är UPLC eller online PLME-TFC-HPLC-metoder mer effektiva. LC-MS/MS klassificeringsmetoden är den föredragna metoden för djupgående kvalitetsutvärdering och sortidentifiering. TLC-bildmetoden är lämplig för snabb initial screening på gräsrotsnivå. Forskare bör göra rimliga val utifrån faktiska behov.

cistancheextraktpulver

Slutsats

Denna artikel utvecklar systematiskt HPLC-metoden för att bestämma innehållet av echinakosid och ergosterol i Cistanche tubulosa. Denna metod har validerats med flerdimensionell metodik och har egenskaperna hos ett brett linjärt område (r Större än eller lika med 0,999), god precision (RSD)<3%), high accuracy (recovery rate 95.7%~100.7%), and easy operation, fully meeting the quality control requirements of the Chinese Pharmacopoeia for Cistanche tubulosa.

Omfattande analys visar att: (1) innehållet av tallkottkottsglykosid i Cistanche tubulosa vanligtvis är 3-8 gånger så högt som ergosterolglykosid, och den totala mängden av de två varierar beroende på ursprungsort, värd, storlek och plats; (2) Den totala mängden fenyletanolsyra i högkvalitativa prover från Hotan, Xinjiang kan nå 2-3 gånger eller mer av farmakopéns standard; (3) Nya teknologier som UPLC och LC-MS/MS tillhandahåller kraftfulla verktyg för flerkomponents synkron bestämning och djup kvalitetsutvärdering.

Framtida forskning bör fokusera på: (1) upprättande av ett kvalitetsutvärderingssystem med flera index som täcker fler fenyletanoidglykosider; (2) grundligt undersöka den omfattande påverkan av planteringsmiljön, värdskördperioden och bearbetningsmetoden på innehållet; (3) främja standardiseringen av hela industrikedjan Guanhua Cistanche från medicinalväxter till hälsokost och kosmetiska råvaror.

Referenser

[1] Soup moss HPLC-metod för att bestämma innehållet av echinacosid och ergotamin i Guanhua Roucong Kui [J]. Chinese Pharmacist, 2009, 12 (8): 1061-1063

[2] Chen M, Xiao SP, Cui GH, et al. Bestämning av echinakosid och acteosid i örter från Cistanche tubulosa[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2005, 30(11): 839-841.

[3] Baoshan, Ju Aihua, Xiao Zhibin. Bestämning av innehåll av echinakosid och ergotamin i Guanhua Roucong Kui [J]. Chinese Medicine Review, 2017, 23 (19): 39-40, 44

[4] Liang Jiansong, Xue Cuili, Wu Menghua, etc. UPLC-innehållsbestämning och kemometrisk utvärdering av sex fenyletanoidglykosider i Roucong Kui och Shacong Kui [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2021, 41 (2): 226-235

[5] Folkrepubliken Kinas farmakopékommitté Folkrepubliken Kinas farmakopé (2020 års upplaga, volym 1) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2020: 148-149

[6] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing, etc. Bestämning av Echinochlorin Content i Roucongkui Total Glycosides Capsules med HPLC [J]. Northwest Pharmaceutical Journal, 2002, 17 (1): 3-4

[7] Ju Aihua, Ao Geriletu, Zhou Kai Bestämning av innehållet av echinakosid och ergotamin i saltat kött och solros från Inre Mongoliet [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2011, 26 (1): 178-180

[8] Song Peng, Tu Pengfei. Forskningsframsteg om kvalitetskontroll och utvärdering av traditionell kinesisk medicin Roucongkui [J]. Northern Pharmacy, 2011, 8 (2): 45-47

[9] Guo Dingyu, Xiao Jinglei. Framsteg inom kvalitetskontroll och forskning om biologisk aktivitet av funktionella komponenter i Roucongkui [J]. Jilin Traditional Chinese Medicine, 2023, 43 (7): 856-860

[10] Lu Yinghui, Pi Wenmin, Zhang Yue, etc. Jämförande studie och marknadsstatusanalys av Roucong Kui och Guanhua Roucong Kui [J]. Modern Chinese Medicine, 2019, 21 (8): 1105-1110

[11] National Pharmacopoeia Committee Standard för formelgranulat av Roucongkui (Guanhua Roucongkui) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2021

[12] Fu C, Li J, Aipire A, et al. Cistanche tubulosa fenyletanoidglykosider inducerar apoptos i Eca-109-celler via den mitokondrieberoende vägen [J]. Oncology Letters, 2019, 17(2): 1883-1892.

[13] Xu Mingjun, Wait Quality Analysis and Comprehensive Evaluation of Desert Meat Sunflower från olika regioner i Kina [J]. Food Industry Science and Technology, 2022, 43 (15): 312-320

[14] Syster Hao, Chen Sumei, Yan Donghai, etc Forskningsframsteg kring tillämpningen av Roucongkui i kosmetika [J]. Journal of Daily Chemical Science, 2021, 44 (9): 28-33

[15] Hou Ji, Wang Bo, Li Guanghui, etc Forskningsframsteg och industrialiseringsstatus för Roucongkui [J]. Shandong Agricultural Science, 2020, 52 (12): 147-154