Stx2 inducerar differentiellt genuttryck och stör dygnsrytmgener i den proximala tubuli Ⅱ

3. Diskussion

3.1. Den proximala tubulära patologin hos STEC-patienter och djurmodeller

Oliguria är ett tecken påakut tubulär nekros(ATN). På grund av ATN blockerar utslitna epitelceller lumen av tubuli för att minska vätskeflödet som uppträder som oliguri. Hos STEC-patienter är oliguri och anuri ofta fynd som tyder på ATN. Minskning av den proximala tubulifunktionen under tidigare stadier av STEC-infektionssjukdom har visats som ökningar i urin 2MG och NAG [3,33]. B2MG är ett 12 kDa litet protein som filtreras fritt genom glomeruli och helt absorberas av de proximala tubuli i ett friskt tillstånd. Men när de proximala tubuli är skadade, ökar mängden 2MG i urinen, vilket fungerar som en biomarkör för proximal tubulär funktion. NAG är ett stort lysosomalt enzym på 130 kDa och det huvudsakliga glukosidaset i den proximala tubuli. På grund av den stora storleken kan glomerulus inte filtrera NAG medan skadade proximala tubuli utsöndrar NAG i urinen. Således är en ökning av urin-NAG en annan biomarkör för proximal tubulär skada. Glomerulär histopatologi såsom fibrin-obstruerade kapillärer är ett vanligt fynd hos STEC-patienter; emellertid tyder ovanstående urindata på proximal tubulär skada i den tidigare sjukdomen. Dessutom innehåller urin från STEC-patienter gips som består av tubulärt epitel som är ett resultat av utsöndring av skadade proximala tubulära celler [1]. I djurmodeller återfinns ofta avslagning av de proximala tubulära cellerna både i STEC-infektions- och Stx-injektionsmodeller [25–27,34]. I den aktuella studien fann vi utsöndring av de proximala tubulära cellerna i Stx2-injicerade murina njurar vilket tyder på Stx{13}}inducerad proximal tubulär förändring (Figur 1). Dessutom upptäckte vi Stx2-receptor Gb3 i både mus ochmänskliga njure proximala tubulimed luminalt sidouttryck som indikerar en direkt interaktion av Stx2 med de proximala tubuli (figur 2 och 3). PDK4 fosforylerar pyruvatdehydrogenas för att hämma dess aktivitet, vilket resulterar i en minskning av glukosutnyttjandet och en ökning av fettmetabolismen som svar på långvarig fasta och svält. Det skyddar lossnade epitelceller mot celldöd (anoikis) [35]. PDK4 hade initialt en topp vid 4 timmar, sedan en annan topp vid 8 timmar (Figur 5A). Den reducerades vid 12 timmar, men därifrån hade den en gradvis ökning till 72 timmar med en log2-faldig förändring och slutade med 3 (12-faldig förändring) (Figur 5A). Avlossningen av epitelceller inträffade i Stx2-injicerade proximala tubulära musceller (sloughing) med relativt intakt morfologi (Figur 1), detta kan reflektera PDK4-uppreglering.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRAKTPULVER FÖR NJURE

Eftersom NHERF1 (SLC9A3R1) bidrar till normal cellvidhäftning till den extracellulära matrisen [36], aktincytoskelettorganisation och bibehållande av cellmorfologi, kan ett sänkt uttryck av denna gen få konsekvenser såsom utsöndring av celler (Figur 5K).

Effekten av Stx2 på de proximala tubuli verkar vara en så viktig faktor för STEC infektionssjukdom; dock var förändringar i genuttryck med fokus på in vivo proximala tubulära celler inte tillgängliga tidigare. Keepers et al. [37] visade differentiellt uttryckta gener (DEG) i njurarna hos Stx2+LPS-injicerade möss så att de flesta av de tidigare och till stor del förändrade generna var från LPS-inflytande och gener som förändrades mycket sent är från Stx2-effekten . Deras data visade värdefull insikt i de differentiella genuttrycken i njuren men skilde inte åt de typer av celler som var ansvariga för den förändringen. I den aktuella studien försökte vi hitta DEG som är associerade med de proximala tubulära cellerna genom att jämföra mikroarraydata från musnjure och human primär proximal tubulärceller som behandlades med Stx2.

3.2. Proximala tubulära faktorer involverade i Stx2-inducerad patologi i relation till kända Stx2-aktiviteter i Gb3-uttryckande celler

3.2.1. Aktivitet (I), Signaltransduktion inducerad av Stxs-bindning till Gb3

B-subenheter av Stxs inducerar icke-receptor src tyrosinkinas Ja fosforylering [4]. Fosforylerat Yes aktiverar nedströms signalmolekyler genom sin kinasaktivitet och leder till ombyggnad av cytoskelett [5]. Yes-associerad protein (YAP) fosforylering i Y357 av Yes är känd för att inducera YAP nukleär translokation där det fungerar som en transkriptionell samaktivator för att inducera målgener såsom CTGF [38]. Matricellulära proteiner CYR61 (CCN1) och CTGF (CCN2) utsöndras till den extracellulära matrisen (ECM) och bidrar till att upprätthålla cell-ECM-adhesion genom att binda receptorintegriner och cellyt-fästa heparansulfatproteoglykaner (HSPG) [39,40]. Nyckelmolekylen för CCN1- och 2-transkription är YAP, och den hålls inaktiv (fosforylerad vid serinrest 127) i ett normalt tillstånd under Hippo-signalvägen. När låg cell-celladhesion detekteras, är YAP (S127) inte längre fosforylerad så att den kan komma in i kärnan, och transkriptionen av CCN1 och 2 ökar [41-43]. CCN1 och 2 fungerar som sårläkande molekyler för att reparera cellförlorad vävnad [38,44]. I vår datauppsättning hade CCN1 och 2 små toppar vid en tidigare tidpunkt (6 timmar). Detta kan återspegla Stx2-bindningsinducerad Ja-aktivering. Senare timmar kan sloughing ha utlöst ytterligare YAP-aktivering genom att stänga av Hippo-signalvägen för att inducera större uttryck av CCN1 och 2 vid 12 timmar eller senare (Figur 5C).

3.2.2. Aktivitet (II), Framkallande av ER-stress/UPR

Stxs når ER, där kluvna A1-fragment och B-subenheter härmar oveckade proteiner [9,10,45,46]. Glukosreglerat protein 78 kDa (Grp78, bindande immunoglobulinprotein (Bip)) förankrar tre UPR-nyckelproteiner Inositol-krävande enzym-1 (Ire-1), proteinkinas R-liknande endoplasmatiskt retikulumkinas (PERK) ) och aktivera transkriptionsfaktor 6 (ATF6) i ER-membran under normalt tillstånd. På grund av högre affinitet hos Grp78 till oveckade proteiner frisätter den emellertid dessa förankrade proteiner. ATF6 aktiveras efter frisättningen och ökar CHOP (DDIT3) och X-box-bindande protein 1 (XBP-1) mR NAs, medan Ire-1 splitsar XBP-1 mRNA för att producera XBP{{ 22}} protein, vilket bidrar till CHOP (DDIT3) transkription. PERK-aktivering leder till ATF4-aktivering som också ökar CHOP (DDIT3) mRNA. Därför är en ökning av CHOP (DDIT3) mRNA ett kännetecken för UPR [47,48]. Stxs rapporteras inducera UPR och CHOP (DDIT3) är uppreglerad i vår datauppsättning (Figur 5D–G).

GDF15 tillhör familjen transformerande tillväxtfaktor beta (TGF ). Nyligen har GDF15 visat sig förmedla diabetesläkemedel metformin-inducerad viktminskning [49]. Hos möss som administrerades oralt med metformin ökade intestinalt och renalt GDF15-mRNA vilket resulterade i en höjning av serum-GDF15. Cirkulerande GDF15 verkar via en hjärnstam-begränsad receptor för att undertrycka födointag och minska kroppsvikten [50]. Hos de metformin-administrerade mössen är ökad renal GDF15 åtminstone delvis under regleringen av CHOP (DDIT3). I vår datauppsättning av Stx2-injicerade mössnjurar ökade CHOP (DDIT3) initialt efter 4 timmar med en mycket liten topp och började sedan ha en ökande trend mot 48 timmar där den bibehöll nivån för en logg{{16 }} veck förändring runt 1,3 (Figur 5E). Enligt STRING-klusteranalys tar GDF15 emot aktiv input från transkriptionsfaktorerna CHOP (DDIT3) och ATF3 (Figur 5E) [51,52]. Den Stx2-injicerade murina vikten började minska eller avvika från saltlösningskontrollen efter 24 timmar (Figur S3B). En ökning av GDF15-mRNA i njuren vid 12 timmar kan ha påverkat hjärnstammen att minska födointaget, vilket i sin tur visade sig som en viktminskning (figur 5E och S3B). Eftersom GDF15-expressionsnivån fortsatte att vara hög efter 24 timmar, fortsatte mössen att gå ner i vikt (figur 5E och S3B).

Vid ER-stress frisätts PERK från Grp78 (Bip) och oligomeriseras för att fosforylera och hämma eIF2 vilket leder till global translationsrepression, förutom några få UPR-responsiva proteiner som ATF4, CHOP och Grp78. GADD34 (proteinfosfatas 1 regulatorisk subenhet 15A (PPP1R15A)) är ett av de ökade proteinerna under fosforylerad eIF2 (eIF2 (P))-associerad hämning och uppreglerad i vår datauppsättning (Figur 5D, G). GADD34 är ett proteinfosfatas-1 som defosforylerar eIF2 (P) för att negativt reglera UPR-inducerad proteinsynteshämning [53]. GADD34 (PPP1R15A) uttryck blir log2-faldig förändring större än 1 efter 12 timmar av Stx2 i vår datauppsättning och fortsätter att öka tills 24 timmar när det platåer (log2-faldig förändring är lika med 2,1) och bibehåller detta nivå till slutet (Figur 5D,G). Detta tyder på att Stx2-inducerad UPR hade negativ feedback efter 12 timmar. Ökad transkription och translation av CHOP (DDIT3, GADD153) är ett kännetecken för ER-stress och det differentiella uttrycksmönstret liknar GADD34 förutom att log2 större än 1 inträffar efter 24 timmar och gradvis platåer därefter (log2 är lika med 1,3) (Figur 5D, G). Dessutom är CEBPB, den dominerande dimeriserande partnern för CHOP, uppreglerad i vår datauppsättning (Figur 5D, G). Dessa resultat tyder på att även om Stx2-inducerad ER-stress börjar från mycket tidigt i tidsförloppet, ökar den effekten upp till 24 timmar och bibehåller denna nivå av ER-stress till slutet medan en negativ återkopplingsarm också balanserar sig själv samtidigt

3.2.3. Aktivitet (III), ribosominaktiverande protein (RIP) aktivitet

Genom att klyva ett adenin från rRNA hämmar Stxs de novo proteinsyntesen. Depurinerat rRNA påverkar förändringen av ribosomal morfologi, vilket aktiverar signaltransduktion [11] känd som en ribotoxisk stressrespons (RSR), vilket leder till karakteristisk genaktivering (se nästa stycke).

3.2.4. Aktivitet (IV), Ribotoxic Stress Response (RSR) Aktivitet

ZAK (en MAPKKK) är det kända kinaset i RSR och aktiverar nedströms JUN N terminal kinas (JNK) och p38 MAPK vägar [12,15]. Stx1 inducerar JUN- och FOS-mRNA-uttryck i humana tarmepitelceller och denna händelse krävde RIP-aktivitetspositiv Stx1 som tros vara under RSR-kontroll [15]. En annan RSR nedströms molekyl, p38 MAPK, är känd för att inducera tidiga svarsgener såsom JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 och ATF3 [54], som alla uttrycktes differentiellt i vår datauppsättning. JNK- och p38 MAPK-vägar är också kända för att aktiveras nedströmshändelser av Ire-1 under UPR (figur 4B,D och 5B,E,F) [47]. På grund av detta kan Stxs aktivera dessa två vägar genom RSR och/eller UPR. Den extracellulära signalreglerade kinas (ERK) 1/2-vägen visas också vara nedströms RSR [55] och DUSP1 (MKP1)-genen är känd för att induceras av ERK1/2-vägen [56]. Stx1 och anisomycin (en annan proteinsynteshämmare) kan inducera DUSP1-uttryck i Caco-2-celler [57]. I vår datauppsättning inducerades DUSP1-uttryck och detta kan indikera ERK1/2-aktivering (Figur 4B, D).

3.2.5. Aktivitet (V), Särskild gentranskription som leder till cytokin

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 efter 24 respektive 48 timmar (Figur 5F). Detta tyder på att hattgener under båda NF-KB-vägarna, IκB (klassisk) och RelB (alternativ), induceras. Eftersom CHOP (DDIT3) differentiellt uttryck överstiger log2 större än 1 efter 24 timmar, genomgår musnjure UPR, vilket aktiverat PERK fosforylerar eukaryot translationsinitieringsfaktor 2 subenhet alfa (eIF2) för att hämma translation av NFKBIA [60]. Av denna anledning kan en ökning av NFKBIA-mRNA inte hämma mycket av NF-KB-vägen, sålunda tillåts transkription av inflammatoriska faktorer (Figur 5L).

Sobbe et al. [61] visade att både de klassiska (RelA-p50) och alternativa (RelB-p52) NF-KB-vägarna var aktiva i Stx-injicerade möss som upptäckte uppreglering av RelA-målcytokinerna CCL20, CXCL1 och CXCL10 som också uttrycktes differentiellt i vår dataset (Figur 5L).

3.2.6. Aktivitet (VI), Stxs-inducerad apoptos

Klyvt kaspas 3 har hittats i Stxs-associerad celldöd [13,15,62]. Det har visats att kaspas-3-aktivering eller induktion av apoptos av Stxs sker i samband med RSR och UPR. I Stxs-inducerad RSR är både p38 MAPK- och JNK-vägar involverade [15] liksom ERK-aktivering rapporteras [55]. UPR å andra sidan är känt för att inducera NF-KB-, JNK- och p38 MAPK-vägar. CHOP (DDIT3) under UPR har visat sig vara involverad i apoptos [63] och det har också visats i Stxs-associerad apoptos [13]. JNK-inblandning i UPR-inducerad apoptos har också rapporterats [64]. I vår datauppsättning är flera DEGs som CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN och JUNB involverade i RSR och UPR (Figur 5B, F).

3.3. Circadian Dysregulation av Stx2

En ökning av serumendotelin-1 (ET-1, EDN1) inträffar hos STEC-HUS-patienter [65]. Experimentellt inducerar Stx2 också EDN1-uttryck genom att aktivera signaltransduktionskaskader som involverar MAPKs [66], medan UPR är känt för att inducera EDN1-transkription [67]. I vår datauppsättning inducerade Stx2-behandling EDN1-uttryck i både musnjure och humana proximala tubulära celler (Figur 5G). Eftersom EDN1-genuttryck var en gemensam nämnare för musnjure och humana proximala tubulära epitelceller, visar det att EDN1-uttryck förekommer, åtminstone delvis, i de proximala tubulära epitelcellerna in vivo förutom endotelceller. Utsöndrad ET-1 inducerar också EGR1-uttryck via MAPK-aktivering [68]. Våra data bekräftar uppregleringen av EGR1 i timing när EDN1 är uppreglerad (Figur 5H). EGR1 inducerar dygnsrytm nyckelfaktor PER1 uttryck [69], och justerar således amplituden för andra dygnsrytmfaktorer (Figur 5H).

I dygnsrytmreglering uppreglerar heterodimeren av CLOCK-BAML1 (ARNTL) PER1 och CRY1. I gengäld binder PER1-CRY1-heterodimeren till CLOCK-BAML1 (ARNTL) för att undertrycka ytterligare transkription av sin egen, vilket gör en negativ loop av dygnsrytmen. Sålunda inträffar uttryckstoppar för positiva regulatorgener (CLOCK och BAML1 (ARNTL)) och negativa regulatorgener (PER1 och CRY1) på en omväxlande timme som när CLOCK och BAML1 (ARNTL) har en ökning i uttryck, minskar PER1 och CRY1, och mönstret växlar under följande timmar. När vi lade till log2-faldiga förändringsvärden för CLOCK och BAML1 (ARNTL) till grafen (Figur 5J), under de tidigare tidpunkterna, visade PER1 och BAML1 (ARNTL) ett motsatt rytmiskt mönster med skarpa/smala toppar, Men efter 24 timmar började topparna bli matta och öka kontinuerligt utan rytm. Detta antyder att Stx2 påverkade njurens dygnsrytm inklusive inom de proximala tubuli. Även om ytterligare ett bekräftelseexperiment behövs, tyder våra data i kombination med publicerad litteratur som beskriver PER1-effekt på njurdygnsreglering vid stimuli [70,71], möjlig Stx2-inblandning i dygnsrytmstörningar och effekter på proximala tubulära funktioner genom att minska njurklockgener- reglerade faktorer såsom SGLT1 (SLC5A1) (Figur 5K). Faktum är att vi observerade glukosuri hos Stx2-injicerade möss som reproducerar sig i en annan studie med Stx1-injicerade möss [21] vilket tyder på SGLT1 (SLC5A1) dysfunktion i de proximala tubuli (tabell 3). Så vitt vi vet är detta den första rapporten som indikerar Stx2-inblandning i njurdygnsrytmrubbningar.

4. Sammanfattningar

Vi bestämde viktiga gener angående proximala tubuli-associerade uttryck som ändrades av Stx2. Differentiellt uttryck av dessa gener antas vara resultatet av Stx2-aktiviteter såsom UPR-induktion, rRNA-depurineringsassocierad RSR och signaltransduktion inducerad av plasmamembranreceptor Gb3-bindning. Den mest uttryckta genen, GDF15, kan påverka viktminskning orsakad av Stx2 genom hjärnstam-begränsade receptorer genom att minska födointaget. Extracellulär matris och cellvidhäftning kan påverkas av PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 och CTGF som orsakar Stx2-specifik histopatologi och sloughing. Dessutom kan störningar i den renala dygnsrytmen av Stx2 resultera i proximala tubulära funktionsdefekter såsom reabsorption av glukos.

5. Material och metoder

5.1. Djur Möss

(C57BL/6, hane, 19–22 g, specifik patogenfri) köptes från Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japan). Mat och vatten gavs ad libitum. Möss hölls med en standardcykel på 12 h: 12 h ljus-mörker där ljuset är på klockan 7 på morgonen och av klockan 19. Djurens rumstemperatur hölls runt 24 ◦C. Alla procedurer godkändes av University Animal Care Committee.

5.2. Mänsklig njurvävnad

Kadavervävnad utan några personliga identifierare användes i denna studie, och den anses vara undantagen av universitetets riktlinjer för mänskliga undersökningar.

5.3. Cell kultur

Mänsklig njurproximal tubulär epitelcell (RPTEC) primärkultur köptes från Clonetics (Walkersville, MD, USA) och hölls vid 37 ◦C, 5 % CO2-atmosfär. Celler odlades i ett tillväxtmedium för njurepitelceller kompletterat med human epidermal tillväxtfaktor, hydrokortison, epinefrin, insulin, tri-jodtyronin, transferrin, GA-1000 och FBS.

5.4. Rening av LPS-fri Stx2 LPS-borttagning från Stx2 utfördes som beskrivits tidigare [72]. I korthet användes den anti-Stx2 11E10-antikroppskonjugerade kolonnen för att erhålla Stx2-fraktionen, och fraktionen passerades därefter genom Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) för att ta bort LPS. Stx2-fraktionen filtrerades med ett 0,2 µm filter och LPS-nivån testades med Limulus amebocytlysatanalys (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA). Stx2-fraktionen bestämdes ha mindre än 0,03 endotoxinenheter (EU)/ml. Stx2-varianttypen var Stx2a.

5.5. Stx2 Administrering till möss En 2LD50 dos (5 ng Stx2/20 g kroppsvikt), som dödar möss inom fyra dagar (Figur S3A), injicerades till möss intraperitonealt i en volym av 0,1 ml i LPS-fri saltlösning (Otsuka pharmaceutical, Japan). Toxininjektion gjordes mellan 7 och 9 på morgonen, då möss i en längre tid fick Stx2 vid 7 på morgonen och följt av 24, 48 och 72 timmars provtagning vid 7 på morgonen.

5.6. Urinsamling och uringlukosmätning Efter 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 och 84 timmars Stx2-injektion togs urin och 10 µL släpptes på Fuji torrkemikalieglas GLU- P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japan) och uringlukos mättes med Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) vid den anläggning som förvaltas av. Urin från pre-Stx2-injektion användes som 0 timmars prov. Urinuppsamling utfördes med två möss

5.7. Vävnadsbearbetning Efter 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 och 72 timmars Stx2-injektion avlivades tre möss per tidpunkt av CO2 och njurarna samlades in. Hälften av en njure fixerades med 4 % paraformaldehyd/fosfatbuffrad saltlösning i 7 dagar vid 4 ◦C och bearbetades för paraffinsnittet. Ytterligare en halva av njuren användes för att extrahera RNA för mikroarrayanalys. Tre möss utan någon behandling användes som normal (naiva eller 0 h) kontroll. Tre möss injicerades med PBS (vehikel) och avlivades vid 72 timmar och fungerade som vehikelkontroll för att visa att det finns försumbara förändringar i genuttryck jämfört med normal kontroll.

5.8. Periodic Acid-Schiff (PAS)-färgning Paraffinsektioner hydratiserades och färgades med 0,5 % perjodsyralösning, följt av en sköljning med destillerat vatten. Sektioner överfördes till Schiff-reagens. Efter att sektionerna tvättats med 0,6 % natriumbisulfitlösning noggrant, motfärgades de med hematoxylin.

5.9. Stx2-behandling i humana RPTEC RPTEC-celler behandlades med 10 ng/ml Stx2 under 6, 13 och 19 timmar under 37 ◦C, 5 % CO2. RPTEC utan Stx2-behandling användes som kontroll. Två biologiska repliker utfördes per tidpunkt. Efter tvättning med PBS användes celler för RNA-extraktion.

5.10. Fritt flytande immunfluorescensfärgning För bearbetning av fritt flytande sektioner perfuserades en normal mus som beskrivits i Obata et al. [69]. Murina njurar dissekerades sedan och nedsänktes i 4% PFA/PBS i 3 timmar vid 4 ◦C med försiktig omrörning. Vävnader tvättades med PBS och kryoskyddades med 30 % sackaros/PBS vid 4 ◦C över natten eller tills de sjunkit till botten. Tjocka frysta sektioner (50 µm) skars med glidmikrotom med frysta inställningar. Sektioner blockerades med 1:50 get-anti-rått-IgM-antikropp i PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, USA) under 1 timme och inkuberades med anti-Gb3/CD77-antikropp 1:100 i blockeringen lösning eller isotypkontroll (råtta IgM) i en matchad koncentration som den primära antikroppen över natten vid 4 ◦C. Efter tvättning inkuberades sektioner med en sekundär antikropp (anti-rått IgM Alexa Fluor 488, 1:2000 utspädning i PBS) i 2 timmar vid 4 ◦C. Sektioner färgades för andra prober AQP1 (1:1000 spädning, Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan) och CD31 (550274, 1:50 spädning, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) med sekundära antikroppar anti-kanin IgG Alexa Fluor 546 (1:2000 spädning i PBS) respektive anti-mus IgG Alexa Fluor 647 (1:2000 spädning i PBS). Efter tvättning med PBS gjordes 40,6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI, D21490, Thermo Fisher) färgning i 15 minuter vid 4 ◦C. Sektioner nedsänktes i vätskor i en brunn i 96-brunnsplattan (U-formad) med en liten målarrouge varje gång lösningen byttes. Tvättsteget gjordes i större brunnar som i 12- eller 6-brunnsplattor. Vattenhaltiga monteringsmedia användes för täckglas. För human vävnadsberedning fixerades postmortem njuren i 20 % formalin i 2 veckor och bearbetades för fritt flytande beredning som gjorts för musvävnad med ett undantag anti-human CD31-antikropp (CBL468, 1:20 spädning, Merck KGaA, Darmstadt , Tyskland) användes.

5.11. Mikroarrayanalys

Hälften av njuren är nedsänkt i 2 ml RNALater (Ambion, Austin, TX, USA) vid 4 ◦C och totalt RNA extraherades med Rneasy Midi-kitet (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA). Mus Genome 430A 2.0-matriser (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) användes. CEL-filer erhölls och normaliserades med robust multi-chip medelvärde (RMA), beräkning av RNA-kopiantal och veckändringar mot 0 h utfördes i R (v.3.6.0) med dess paket affy [73] och RankProd 2.0 [74]. Data visas i logg2-veckändringsvärden. Datauppsättningen deponeras till Gene Expression Omnibus (GEO) (accessionsnummer GSE172465). Från RPTEC-celler extraherades totalt RNA med RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, Tokyo, Japan). Hela humana genomets oligonukleotidmikroarray (44K oligonukleotid-DNA-mikroarray, Agilent Technologies, Tokyo, Japan) användes för mikroarrayexperiment. De totala RNA-proverna användes för framställning av Cy5- och Cy3-märkta cDNA-sonder. Fluoroformärkta prover hybridiserades på varje objektglas och tvättades, skannades sedan med en DNA-mikroarrayskanner (modell G2505A; Agilent Technologies). Mjukvaran Feature Extraction and Image Analysis (Agilent Technologies) användes för att lokalisera och avgränsa varje fläck i arrayen och för att integrera intensiteterna, som sedan filtrerades och normaliserades med hjälp av den lokalt viktade spridningsutjämningsmetoden. Reproducerbarheten av mikroarrayanalys utvärderades genom två repetitioner av färgbyte i varje experiment. Skillnader i mRNA-uttryck mellan kontroll och Stx2-behandlad RPTEC skördad vid 6, 10 eller 19 timmar jämfördes. TXT-formatdata från GeneSpring-programvaran användes för att bestämma gennamn från sond-ID och konvertera veckändringar till logg2-veckändringar. Datauppsättningen deponeras till GEO (accessionsnummer GSE172466).

5.12. Bioinformatisk analys av mikroarraydata och visualisering I både musnjure och RPTEC-mikroarraydata, gener som är gemensamma för båda och där förändringen i uttrycket var mer än 2-faldigt minskar eller ökar (eller log2-faldigt) är antingen mindre än -1 eller större än 1) vid någon tidpunkt valdes av R. Dessutom, i musnjure mikroarraydata. Genförändringar som passar kubiska kurvor valdes med R-paketet maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (senast tillgängligt den 4 januari 2022)] [75]. Den kubiska kurvan är lämplig för att ta emot dessa geners ökning eller minskning under ett tidsförlopp. En högre polynomgrad som en kubisk kurva gör det möjligt att välja gener med flera förändringar under tidsförloppet bättre än en kvadratisk kurva. Gener som uppförde sig med liknande bana klustrades och deras minsknings-/ökningsmönster visualiserades av en värmekarta med hjälp av R-paketets gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (senast tillgänglig den 4 januari 2022)] [76]. Genontologi (GO) tilldelades och funktioner hos GO bland vanliga gener berikades med Metascape [http://metascape.org (senast tillgänglig den 4 januari 2022)] [77]. Koppling/relation mellan vanliga gener analyserades med STRING [https://string-db.org/ (senast tillgänglig den 4 januari 2022)] [78]. Samband mellan vanliga gener söktes manuellt såväl som med hjälp av textutvinningsfunktionen för STRING.

Referenser

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. The Hemolytic-Uremic Syndrome.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vitsky, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. The hemolytic-uremic syndrome: En studie av njurpatologiska förändringar.Am. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. Försämring av verotoxin av tubulär funktion bidrar till njurskador som ses vid hemolytiskt uremiskt syndrom.J. Infect.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Aktivering av Src-familjen kinas ja inducerad av Shiga-toxinbindning till globotriaosylceramid (Gb3/CD77) i lågdensitet, detergentolösliga mikrodomäner.J. Biol. Chem.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Fujimoto, J. Shiga-toxinbindning till globotriaosylceramid inducerar intracellulära signaler som förmedlar ombyggnad av cytoskelett i humana njurkarcinomhärledda celler.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed (på engelska)] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Furin-inducerad klyvning och aktivering av Shigatoxin.J. Biol. Chem.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majoul, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Reduktion av proteindisulfidbindningar i en oxiderande miljö. Disulfidbryggan av koleratoxin A-subenheten reduceras i det endoplasmatiska retikulumet.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Watson, PD; Marsden, CJ; Smith, DC; Moore, KAH; Cook, JP; Lord, JM; Roberts, LM Proteindisulfid-isomeras reducerar ricin till dess A- och B-kedjor i det endoplasmatiska retikulumet.Biochem. J.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Yu, M.; Haslam, DB Shiga-toxin transporteras från det endoplasmatiska retikulumet efter interaktion med den luminala chaperonen HEDJ/ERdj3.Infektera. Immun.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Shiga-toxin B-subenhet binder till chaperonen BiP och det nukleolära proteinet B23.Biol. Cell2006, 98, 125–134. [CrossRef]