Synergistiska antiinflammatoriska effekter av Laminaria Japonica Fucoidan och Cistanche Tubulosa-extrakt

Som ett immunsvar mot främmande antigener frisätter makrofager pro-inflammatoriska cytokiner såsom tumörnekrosfaktor- (TNF-), interleukin-1 (IL- 1), IL-6 och andra. Sådana cytokiner inducerar ett kemotaktiskt inflöde av granulocyter, monocyter, lymfocyter och mastceller till skadad vävnad som främjar antigenavlägsnande och vävnadsåtervinning. Överdriven infiltration och aktivering av cellerna förvärrar dock vävnadsskador, vilket leder till ödem (kärlutsöndring) och smärta som är välkända inflammationsfenomen.

TNF- är en viktig faktor för att inducera kväveoxidsyntas (iNOS) genuttryck i flera cellinjer. iNOS-aktivering leder till produktion av kväveoxid (NO) som inte bara modulerar flera fysiologiska funktioner som bakteriedödande och vasodilatation utan också orsakar inflammation. Efter vävnadsskada genererar nedbrytning av fosfolipaser av cellmembranfosfolipider arakidonsyra. Arakidonsyra sönderdelas ytterligare av cyklooxygenas (COX) till prostaglandiner (PG). Överdriven mängd PGE2 bildad av COX-II inducerar flera cytokiner för inflammation. Eftersom både NO och PGE2 fungerar som huvudfaktorer för inflammation och smärtframkallande, är TNF- –NO- och COX-II-PGE2-vägarna huvudströmmarna i den inflammatoriska processen, som hämmas av kortikosteroider och icke-steroida.antiinflammatoriska läkemedel(NSAID) respektive.

Även om det finns flera steroider och NSAID förterapi av inflammatoriska sjukdomar, kan dessa läkemedel ge upphov till negativa effekter på immunsystemet, mag-tarmkanalen, njurarna, levern, centrala nervsystemet, blodtrycket och det kardiovaskulära systemet. Därför är det nödvändigt att minimera de negativa effekterna av kemiska läkemedel genom att ersätta dem eller använda dem i kombination med naturliga produkter.

Fucoidan, ett sulfatpolysackaridkomplex från sjögräs som Laminaria japonica och Cladosiphon okamuranus som är brett distribuerat i många länder, har använts som terapeutik inom orientalisk medicin under en lång period. I tidigare studier har det visat sig att fucoidan har antioxidativa, antikoagulerande, anti-cancer- ochantiinflammatoriska aktiviteter. Följaktligen drar de fördelaktiga effekterna av fucoidan på inflammatoriska sjukdomar, ischemi, immundysfunktion och tumörer forskares uppmärksamhet. Å andra sidan,Cistanche tubulosa(CT) har också använts i stor utsträckning som ett traditionellt läkemedel i Kina. Det rapporterades att CT-extrakt sänker produktionen av TNF-á och IL- 4 som är viktiga faktorer för NO-produktion i inflammatoriska vägar [19].

Sådana tidigare fynd ledde till att vi undersökte den kombinationseffektiva effekten av fucoidan och CT-extrakt på de två huvudvägarna för inflammation. För att belysa verkningsmekanismen analyserade vi NO och PGE2 i utsöndringarna från karragenaninducerad luftpåseinflammation.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR FÖREBYGGANDEINFLAMMATORISKA AKTIVITETERPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Material och metoder

Material

Halvrenat fucoidan och vattenextrakt av CT erhölls från Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Fucoidan och CT-extrakt hölls vid 4 grader, blandades (1:3) löstes i renat vatten före användning och administrerades oralt i en volym av 5 ml/kg.

Cellodling och NO-kvantifiering

Den murina makrofagen RAW 264.7-cellinjen köptes från American Type Culture Collection (Manassas, USA) och odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (Sigma, St. Louis, USA) innehållande 10 % fetalt bovint serum och antibiotika [100 U/ml penicillin (Sigma) och 100 µg/ml streptomycin (Sigma)]. Cellerna inkuberades i en fuktad 5% CO2-atmosfär vid 37 grader.

För att bedöma effekterna av fucoidan och CT-extrakt på utsöndringen av NO, inkuberades RAW 264.7-celler (1×106 celler/ml) med fucoidan eller CT-extrakt (1–320 µg/ml) i 5 minuter följt av interferon- (IFN-, 10 U/ml) och lipopolysackarid (LPS, 10 µg/ml) under 24 timmar. I våra preliminära studier bekräftades det att behandling med IFN-plus LPS för aktivering av RAW 264.7-celler inte påverkade cellernas livsduglighet upp till 24 timmar och att fucoidan och CT-extrakt inte var cytotoxiska upp till 1 mg/ml. Koncentrationen av nitrit (NO2 – ), den oxiderade produkten av NO, mättes som en indikator på NO. Odlingsmediet blandades med en lika stor volym Griess-reagens (1 % sulfanilamid, 0,1 % naftyletylendiamin i 2,5 % fosforsyra) [21] och inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter. Nitritkoncentrationen analyserades vid 540 nm, där NaNO2 användes för att generera en standardkurva.

Djur och behandling

ICR-hanmöss (7 veckor gamla) köptes från Daehan Biolink (Eumseong, Korea) och hölls i ett rum med konstanta miljöförhållanden (22±2ºC; 40-70% relativ fuktighet; 12-timmars ljus -mörk cykel; 150-300 lux ljusstyrka). Pelletsfoder och renat vatten var tillgängliga ad libitum. Alla djurexperiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Chungbuk National University (CBNU), Korea, och utfördes enligt Standard Operation Procedures (SOP) från Laboratory Animal Research Center, CBNU.

Mössen (n=8/grupp) behandlades oralt med fucoidan (18 eller 54 mg/kg), CT-extrakt (54 eller 162 mg/kg) eller deras blandning (18+54, {{6 }} eller 90+270 mg/kg) en gång om dagen i 7 dagar. Låga doser av fucoidan (18 mg/kg) och CT-extrakt (54 mg/kg) kom från uppskattade humandoser på 100 mg/kropp (70 kg) och 300 mg/kropp efter ytarea translation av kroppsvikt (Km{{14 }} för människa/Km=3 för mus), respektive. Höga doser av fucoidan och CT-extrakt sattes till 3 gånger, ensamt eller i blandning, och den högsta dosen blandningen fixerades till 5 gånger för att bedöma maximala synergistiska effekter.

På den första dagen av fucoidan- och CT-extraktbehandling injicerades möss subkutant med 10 ml steril luft på baksidan för att bilda en påse [22,23]. Efter 2 och 5 dagar återinjicerades påsen med 5 ml luft. En timme efter den sista behandlingen injicerades 1 ml karragenan (1 % i saltlösning; Sigma) eller dess vehikel (saltlösning) i påsen.

Analyser av exsudat

Luftpåsen tvättades med 1 ml kall koksaltlösning 6 timmar efter karragenaninjektion, och nettovolymen av sköljvätska registrerades. Totalt antal inflammatoriska celler, neutrofiler, monocyter och lymfocyter bestämdes med användning av en billräknare. Koncentrationerna av NO och PGE2 bestämdes med Griess-reagens (Sigma) och enzymimmunoassay (EIA) med användning av ett Correlate-EIA-kit (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR BLOCKERING AV INFLAMMATORISK CELLKEMOTAX PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatologisk undersökning

Påsfodervävnad avlägsnades och fixerades i en neutral formalinlösning. Paraffininbäddade vävnadsobjektglas färgades med hematoxylin-eosin och undersöktes under ett ljusmikroskop med avseende på de inflammatoriska lesionerna.

Statistisk analys

Resultaten presenteras som medelvärde±SE. Experimentella gruppjämförelser gjordes genom envägsanalys av varians följt av en Tukeys testkorrigering. AP-värde<0.05 was considered statistically significant.

Resultat

In vitro ökade RAW 264.7-cellkultur, IFN- och LPS-behandling avsevärt NO-produktionen (Figur 1). Förbehandling med fucoidan (1–320 µg/ml) påverkade inte NO-frisättningen från makrofagcellinjen (Figur 1A). Som jämförelse undertryckte CT-extrakt (32–320 µg/ml) signifikant NO-produktion, vilket tyder på en antiinflammatorisk aktivitet (Figur 1B).

Injektion av karragenan i musluftpåsen ökade markant exsudatvolymen i påsen (Figur 2). Sådan ökad utsöndring dämpades genom behandling med fucoidan (18 mg/kg) och CT-extrakt (54 och 162 mg/kg). Noterbart är att kombinationsbehandlingen av fucoidan och CT-extrakt minskade exsudatvolymen ytterligare jämfört med de individuella effekterna, även om högre doskombinationer (54+162 mg/kg och 90+270 mg/kg) inte uppvisade ytterligare effekt till den lägsta doskombinationen (18+54 mg/kg) (Figur 2A). N-gradig spänning i påsen ökade också drastiskt efter karragenaninjektion (Figur 2B). I jämförelse med den milda effekten av fucoidan, sänkte CT-extrakt markant N-gradskoncentrationen. Kombinationsbehandling av fucoidan och CT-extrakt minskade NO-nivån ytterligare på ett dosberoende sätt. På liknande sätt undertrycktes det ökade PGE2-innehållet synergistiskt av kombinationsterapin av fucoidan och CT-extrakt (Figur 2C).

Parallellt med de inflammatoriska mediatorerna i påsen ökade antalet inflammatoriska celler drastiskt genom karragenaninjektion: 37,8, 4,8 och 24,1 gånger av kontrollnivåerna för neutrofiler, monocyter respektive lymfocyter (tabell 1). Fucoidan och CT-extrakt reducerade emellertid signifikant den inflammatoriska cellinfiltrationen, där fucoidan var något överlägsen CT-extrakt. Oväntat uppnåddes ingen synergistisk effekt i den inflammatoriska cellinfiltrationen genom samtidig administrering av fucoidan och CT-extrakt.

Som slutsatsen från den inflammatoriska cellinfiltrationen i exsudaten uppvisade den subkutana vävnaden som omgav luftpåsar allvarliga inflammatoriska lesioner (Figur 3). Enormt många celler i den förtjockade subkutana vävnaden som exponerats för karragenan observerades (Figur 3B), jämfört med de nästan normala egenskaperna hos kontrolldjur (Figur 3A). Sådana inflammatoriska lesioner försvagades anmärkningsvärt genom behandling med fucoidan (figur 3C och 3D) eller CT-extrakt (figur 3E och 3F).

I synnerhet erhölls högre antiinflammatoriska effekter genom kombinationsterapi med fucoidan och CT-extrakt (figur 3G-3I).

Diskussion

Genom att använda en in viv-grad arrageenan-inducerad luftpåseinflammationsmodell inducerar injektion av luft i ryggen på gnagare proliferation av celler som stratifierar på ytan av kaviteten för att bilda en struktur som liknar synovium. I denna modell ökade injektionen av karragenaninducerad inflammatorisk cellinfiltration exsudatet, vilket tyder på vaskulärt läckage. Luftpåsen fungerar som en reservoar av inflammatoriska celler och mediatorer som lätt kan mätas i vätskan som ackumuleras lokalt.

Bland de olika inflammatoriska mediatorerna som kan inducera vaskulär permeabilitet är det välkänt att NO och PGE2 är viktiga faktorer involverade i patogenesen av många inflammatoriska sjukdomar. De är också kända som förmedlare av smärtinduktion och perception. iNOS, som uttrycks och aktiveras i olika celltyper genom stimulering med TNF- och/eller LPS under inflammation, producerar höga, ihållande koncentrationer av NO. NO är en viktig reglerande molekyl i olika fysiologiska funktioner, såsom vasodilatation som leder till vaskulärt läckage. PGE2, som genereras från arakidonsyra via COX, bidrar till utvecklingen av många inflammatoriska sjukdomar, och överproduktion av PGE2 som svar på olika inflammatoriska stimuleringar är associerad med uppreglering av COX-II-nivåer och progression av inflammation. Därför har TNF- - NO- och COX-II-PGE2-vägar betraktats som två huvudströmmar av inflammatoriska processer, som blockeras av hämmare av iNOS (kortikosteroider) respektive COX (NSAID).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR FÖRBJUDANDE AV INFLAMMATORISKA SJUKDOMAR PHGS75% ECH 30% ACT 12%

I den aktuella studien minskade samtidig administrering av fucoidan och CT-extrakt exsudatvolymen i påsen, vilket tyder på att de har undertryckande aktivitet mot vaskulärt läckage (Figur 2A). Jämfört med de individuella effekterna av varje fucoidan- och CT-extrakt ökade kombinationsbehandlingen ytterligare, vilket antyder att tvågraden förstärker verkan synergistiskt. Sådana synergistiska effekter mellan fucoidan och CT-extrakt stöddes av deras aktiviteter på NO- och PGE2-nivåerna i exsudaten (figur 3B och 2C).

Intressant nog bekräftades det dock att fucoidan inte direkt hämmar aktiveringen av makrofager in vitro-analys (Figur 1A). På liknande sätt var den hämmande potentialen för fucoidan på NO- och PGE2-ackumuleringen in vivo-analysen relativt lägre än den för CT-extrakt (figur 2B och 2C). En sådan verkningsmekanism för fucoidan skiljer sig från en direkt inaktivering av cellerna med CT-extrakt (Figur 1B). Som jämförelse utövade fucoidan en hög effektivitet på hämningen av inflammatorisk cellinfiltration i påsarna (tabell 1). Fucoidan var överlägset CT-extrakt när det gällde att blockera migrationen av neutrofiler, monocyter och lymfocyter till de karragenaninducerade vävnadsskadorna. Intressant nog fanns det ingen synergistisk anti-migratorisk effekt, vilket tyder på olika verkningsmekanismer mellan fucoidan och CT-extrakt: dvs fucoidan blockerar infiltration av inflammatoriska celler, medan CT-extrakt hämmar aktivering av cellerna.

Polymorfonukleära celler, särskilt neutrofiler, är de huvudsakliga cellulära komponenterna som rekryteras till akuta inflammatoriska ställen inducerade av karragenan. Dessutom spelar efterföljande inflammatoriska celler som makrofager och lymfocyter också centrala roller i den inflammatoriska processen genom att utsöndra cytokiner. När det förbehandlades med fucoidan eller CT-extrakt undertrycktes antalet vita blodkroppar som migrerade in i de karragenaninjicerade luftpåsarna markant. Detta resultat överensstämde med en effekt som skulle erhållas av kortikosteroider såsom dexametason, men inte av NSAID inklusive indometacin. Därför antas det att fucoidan- och CT-extraktet delvis har en egenskap hos steroider.

Förutom den blockerande verkan på inflammatorisk cellkemotaxi, verkade CT-extrakt undertrycka aktiveringen av makrofager. Detta bekräftades av dess hämmande verkan på NO in vitro och in vivo, som är den huvudsakliga inflammatoriska mediatorn som produceras av makrofager. Således kan effekten av CT-extrakt på makrofager bero på ett undertryckande av mRNA-uttryck och/eller en direkt hämning av iNOS-aktivitet i dessa celler.

PGE2 är också en av de viktigaste inflammatoriska mediatorerna. Den ökar parallellt med vävnadsödem, som undertrycks av NSAID, hämmare av COX. Karragenan kan öka PGE2-produktionen genom att inducera COX-II-mRNA och COX-II-protein i påsens exsudat. I denna modell ökade karragenan signifikant mängden PGE2 och det undertrycktes avsevärt av CT-extrakt. Det är intressant att notera att detta resultat överensstämde med en effekt som skulle erhållas av ett NSAID indometacin. Därför drar man slutsatsen från resultaten att CT-extrakt har ytterligare egenskaper hos NSAID. Sammantaget tror man att CT-extrakt utövade både kortikosteroid- och NSAID-liknande effekter i den karragenaninducerade inflammationsmodellen och att fucoidan förstärkteantiinflammatoriska effekter av CT-extraktgenom att blockera inflammatorisk cellinfiltration.

Även om definitionen av den exakta verkningsmekanismen kräver ytterligare studier, försvagade en blandning av fucoidan och CT-extrakt markant inflammatoriska tecken genom att blockera TNF- –NO- och COX-II-PGE2-vägarna i karragenan-inducerad luftpåseinflammation. Dessa fynd ger bevis för att kombinationsbehandling av fucoidan och CT-extrakt kan vara en lovande kandidat för lindring av olika typer av inflammationer som är känsliga för kortikosteroider eller NSAID.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR FÖRBJUDANDE AV INFLAMMATORISKA SJUKDOMAR PHGS75% ECH 30% ACT 12%