Anti-aging potentialen hos neohesperidin och dess synergistiska effekter del 2
May 27, 2022
Kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comFör mer information
2.4 In vitro Antioxidantaktivitet av Neohesperidin var relativt svag
Många metoder finns tillgängliga för att mäta in vitro-antioxidantkapaciteten och de flesta forskare tillämpar en eller flera analyser eftersom varje metod mäter olika antioxidantegenskaper hos föreningen [32]. I denna studie använde vi tre metoder för att bestämma antioxidantkapacitet inklusive DPPH-, ABTS- och FRAP-analyser. Antioxidant potency composite index (APCI) definierades för att beskriva och utvärdera den totala in vitro-antioxidantkapaciteten hos de testade föreningarna och deras kombinationer. De linjära regressionsekvationerna för de tre analyserna listas i tabell 1. Och alla relaterade data presenterades i tabell 2. Under tiden plottades APCI i figur 4B. Från dessa resultat kunde vi se att neohesperidin hade relativt svag in vitro-antioxidantkapacitet; Detta innebar att CLS-förlängningsfunktionen hos neohesperidin inte var beroende av dess in vitro-antioxidantaktivitet. Men med jämförelsevis hög in vitro-antioxidantaktivitet, CD BCDextended CLS av jäst BY4742. Sammantaget kan vi inte förutse en förenings CLS-förlängningskapacitet bara baserat på dess antioxidantaktivitet.
A: naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin, koncentrationen av A, B, Cand Dis luM. APCI=> (varje provvärde/det största provvärdet i den metoden)/antalet metoder. Data uttrycktes som medelvärde ± SEM(n =9) och jämfördes med hjälp av envägs ANOVA:s Sidaks multipeljämförelsetest vid p< 0.05="" by="" graphpad="" prism="" 7.00.="" different="" letters="" (a,="" b,="" c,="" d,="" e,="" f,g,="" h,="" i,="" j,="" k)="" after="" data="" indicate="" values="" in="" the="" same="" column="" with="" significant="">
2.5.Neohesperidin kunde inte bromsa variationen av extracellulär försurning av jäst BY4742
Viktiga parametrar inkluderar tillväxtmediets sammansättning såväl som pH-värdet. Sammansättningen av tillväxtmediet och pH-värdet har visat sig ha stor inverkan på CLS för S.cerevisiae[33]. Effekterna av pH på CLS av spirande jäst undersöktes av tidigare studier, och resultaten pekar på en mekanism för ättiksyratoxicitet relaterad till induktion av tillväxtsignalvägar och oxidativ stress i jäst [34]. För att känna till effekten av de fyra flavonoidföreningarna på variationen av extracellulär försurning av jästkulturer detekterade vi pH-värdena var femte minut med hjälp av en pH-mätare.Cistanche extrakt antistrålningI figur 5,10uM naringin bromsade uppenbarligen variationen av extracellulär försurning av spirande jäst BY4742 vid olika åldrande tillstånd medan de andra tre flavonoidföreningarna inte påverkade det signifikant vid samma koncentration jämfört med kontrollgrupper.
Figur 5. Variation av odlingsmedier efter den spirande jästen BY4742 behandlad av de fyra flavonoidföreningarna vid 10 μM. Experimentet utfördes åtminstone i tre exemplar. ∶ Naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin.
3. Diskussion
Tidigare studier hade rapporterat att neohesperidin uppvisade olika anti-aging associerade funktioner, såsom den neuroprotektiva effekten [15], ROS-rensning och antiinflammatoriska aktiviteter [35], dämpning av minskningen av mitokondriell membranpotential och ökningen av kaspas-3-aktivitet framkallad av H2O2 [16] och cellulär apoptosinducerande aktivitet [21]. Alla dessa funktioner lade en bra grund för resultatet att neohesperidin ökade CLS av spirande jäst BY4742 här. Det är förvånande att neohesperidin förlängde CLS signifikant endast vid den lägsta koncentrationen som testades. Rapporten från Craker, et al. visade också en lägre koncentration av auxin (10-6 IAA) främjar protonsträngsprutning. Protonsträngsprutning under en hög koncentration av auxin (10-4 IAA) hämmas av auxininducerad eten [36].cistanche herbaROS-rensningsaktiviteten hos neohesperidin verifierades i vår forskning. In vitro-antioxidantkapaciteten hos neohesperidin var relativt svag, vilket förklarade varför CLSextensionsfunktionen hos neohesperidin inte berodde på dess in vitro-antioxidantaktivitet. Kombinationerna CD och BCD hade emellertid hög antioxidantaktivitet in vitro och ökade CLS för jäst (figur 3B). Den svaga korrelationen mellan ROS och antioxidantaktivitet kan orsakas av den metod vi använde för att analysera antioxidantaktiviteten. Antioxidantaktivitetsmetoden försökte reagera med en dubbelbindning vid C2-C3 och/eller en hydroxylgrupp vid C3 på C-ringen av flayonoid. I Areias et al. resultaten föreslog starkt att den högre antioxidantaktiviteten hos flavonoiderna inte är korrelerad med närvaron av en dubbelbindning vid C2-C3 och / eller en hydroxylgrupp vid C3 på C-ringen, utan snarare kan bero på förmågan att hämma produktionen av reaktiva syrearter för att interagera hydrofobt med membran [37]. Samtidigt har ett stort antal studier visat att vissa antioxidanter har funktionen att förlänga livslängden, men deras specifika verkningsmekanismer är komplexa. Endast vissa antioxidanter har visat sig uppvisa anti-aging effekter relaterade till direkt fria radikaler och ROS clearance. Men de livsförlängande effekterna av andra antioxidanter på modellorganismer var inte begränsade till direkt antioxidantfunktion, utan inkluderar också reglering av stressrelaterat genuttryck och induktion av toxiska stimulerande effekter [38]. Därför är det omöjligt att förutsäga ett ämnes förmåga att förlänga CLS av jäst baserat på dess antioxidantaktivitet. Även om vi inte testade resultatet i andra stammar, erbjöd det information för andra forskare och forskare att validera resultatet i andra stammar och modellorganismer.
Cistanche kan anti-aging
Många cellulära processer och yttre faktorer påverkar jästens kronologiska livslängd negativt, inklusive medelförsurning och oxidativ stress [39]. En av de tidiga förändringarna som sker i jästceller odlade i medier som innehåller 2% glukos (dextros) är produktionen av ättiksyra och försurning av mediet, vilket har visat sig påverka kronologisk åldrande [38]. Buffring av mediet till pH 6-7 förhindrar försurning och ökar den kronologiska livslängden [10,39-41]. Dessutom kan ättiksyra användas av Saccharomyces cerevisiae för tillväxt och metabolism trots dess potentiella toxicitet [42]. 10 uM neohesperidin, hesperidin och hesperetin upprätthöll variationstrenden för extracellulära pH-värden jämfört med kontroll (figur 5). 10 uM naringin bromsade emellertid tydligt variationen av extracellulär försurning (figur 5). Vid denna koncentration behandlades CLS av jäst BY4742 med neohesperidin, hesperidin och hesperetin var nästan desamma som kontrollgruppen.
Ökad ROS-rensning har markanta effekter på CLS i jäst, men orsaken är fortfarande ett olöst problem [33]. Åldrande och relaterade sjukdomar är konsekvensen av fria radikalmedierade skador på cellulära makromolekyler och deras oförmåga att motverka endogena antioxidantförsvarsmekanismer [43]. Data har dock visat att ROS också kan spela en positiv roll för att inducera stressresponsgener (hormesis) [43-46].
Dessutom tyder nya fynd på att även typen av ROS och den tid de inträffar är viktiga för livslängdsförlängning i S.cerevisiae [47-49], vilket illustrerar ROS: s komplexa roll i jäståldring. [47] rapporterade att neohesperidin minskade ROS-generationen i humana keratinocyter.cistanche penis tillväxtNohara, et al. avslöjade nyligen att nobiletin (en av flavonoiderna i citrus) stärker mitokondriell andning i skelettmuskeln för att främja hälsosamt åldrande mot metaboliska utmaningar. ROS-produktionen undertrycktes signifikant genom nobiletinbehandling på ett dosberoende sätt [50]. Figurerna 3B och 4A visade att D och CD ökade CLS för jäst BY4742 och minskade den intracellulära ROS-halten. Men för ABD och BCD förlängde de CLS samtidigt som de ökade den intracellulära ROS. Detta resultat överensstämde med Wus 51]. Så det fanns inget säkert positivt eller negativt samband mellan ROS-rensningsaktiviteter hos föreningarna och deras effekter på livslängden, och detta var också i linje med ROS: s invecklade roll i jäståldring.
I figur 3A minskade inte överlevnaden av jäst BY4742 under behandling av olika föreningar och deras kombinationer från dag 2 till dag 20 gradvis. De presenterar dubbla toppar. Detta finns också i resultatet av Wu et al. Under de första dagarna var överlevnadsgraden relativt hög. Detta kan förklaras av tillräckligt med näringsämnen och lågt överlevnadstryck under denna tid. Med tiden dök dalpunkter upp under en mycket kort tid eftersom näringen blev mindre. Sedan dök toppar upp igen. Detta fenomen kan tillskriva framgången till metabolismen av ett annat näringsämne som lindrade överlevnadstrycket.
[36] rapporterade att antioxidantaktiviteten hos antioxidantblandningen / föreningskombinationen var effektivare än en enda förening. I vårt experiment hade kombinationerna AB, AC, CD, ABC och BCD en starkare antioxidantkapacitet än något enda ämne som motsvarar dem.cistanche salsa fördelarBaserat på våra observationer kan man dra slutsatsen att flavonoiderna som finns i en blandning kan interagera, och deras interaktioner kan påverka den totala antioxidantkapaciteten hos en lösning (Figur 4B). Även om vi visade att de fyra flavonoidinteraktionerna utlöser synergistiska eller antagonistiska effekter för antioxidantkraften, finns det andra flavonoidkombinationer som kräver en mer detaljerad studie för att bättre förstå mekanismerna som är involverade i dessa interaktioner. [52] hade rapporterat växtextrakt som ökade jästens CLS. Och den autofagi som främjas av minskad TORC1-signalering är kritiskt viktig för en lång CLS[10]. Genom att hänvisa till dessa studier kan vi utforska hur föreningarna utför sin effekt i framtida studier.
4. Material och metoder
4.1.Material
Vildtypsstammen S. cerevisiae BY4742(ATCC(8),201389TM)(Mata his3A1 leu2△0 lys2A0 ura3A0) erhölls från American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Odlingen av jästreferensstammen alikvoterades till 10 uL och lagrades vid -80 °C. Alla L-aminosyror, jästkvävebas med aminosyror (YNB), ammoniumsulfat, pepton, agar och jästextrakt, H2DCFDA, 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ),2,2'-och-bis(3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra)(ABTS),1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), dimetylsulfoxid(DMSO), neohesperidin, naringin, hesperidin och hesperetin köptes från Sigma-Aldrich (Shanghai, Kina). YPDBroth, YPD och andra kemikalier var från Solebo Biotech Co., Ltd. (Peking, Kina). 96-brunns polystyrenmikroplattor med platt botten köptes från Corning incorporated (Kennebunk, ME, USA).
4.2.Livslängd och jästcellsgrozotanalys
Bestämningen av kronologisk livslängd (CLS) för jäst utfördes enligt metoden för Wu et al. I korthet framställdes jästcellerna genom att överföra en streckad stam från frysta bestånd till YPD-agar (0,5% jästextrakt / 1% pepton / 2% dextros / 1,4% agar) plattor. Efter inkubation av cellerna vid 30 ° C i 2 dagar plockades en enda koloni och ympades i ett 1,0 ml YPD-flytande medium (1% jästextrakt / 2% pepton / 2% dextros) i ett 10 ml steriliserat centrifugrör (rund botten) och odlades vid 30 ° C i 2 dagar i en platt inkubator vid 200 pm. Den 2-dagars YPD-kulturen späddes ut med autoklaverat 18 Qm Milli-Q-grade vatten (1:10) och förvarades i kylskåp vid 4 ° C i 2 dagar. Efter 2 dagars inkubation vid 4 °C,5 μL (≈1×10* celler) överfördes den utspädda kulturen till 993 mikroliter syntetiskt definierade (SD) medier (kompletterande tabell S1, [51]) och hölls vid 30 °C, 200 rpm under hela experimentet. Föreningar i DMSO med flera koncentrationer (2,0 μL) tillsattes vid den initiala ympningen (0 timmar). Varje experiment utfördes åtminstone i tre exemplar. Cellkulturer inkuberades vid 30 ° C utan att ersätta åldringsmediet under hela experimentet. Efter 2 dagars odling i ett åldrande medium nådde cellerna den stationära fasen och den första ålderspunkten togs sedan. Efterföljande ålderspoäng togs var 2-4: e dag. För varje ålderspunkt pipetterades 5,0 μL av den blandade kulturen i varje brunn av en 96-brunns platt bottenmikroplatta. Nittiofem mikroliter YPD-medium tillsattes sedan till varje brunn. Cellpopulationen övervakades med en mikroplattläsare (Varioskan Flash; Thermo Scientific, Waltham MA, USA) genom att spela in OD660 var 10: e minut i 24 timmar.
Överlevnadsgraden beräknades enligt följande[25]. Där tOD = 0,3,2 dag är den tid då OD-värdet för dag 2 ålderspunkt når 0,3 i utväxtkurvorna. Den ursprungliga ålderspunkten (dag 2) definieras som 100 % livskraft och den relativa överlevnadsprocenten för varje på varandra följande ålderspunkt kan beräknas enligt följande:
Överlevnadsintegralen (Sl) för varje brunn definieras som arealen under överlevnadskurvan (AUC) och kan uppskattas med formeln:
där dag är ålderspunkten, till exempel dagar2,4,6,8,10,12,14,16,18och20.
4.3 Intracellulära ANALYSER av ROS-rensningsförmåga
För att kvantifiera nivån av intracellulära reaktiva syrearter (ROS) hos jästceller odlade i ett standard SD-medium med/utan de fyra föreningarna hade metoden som beskrivs i Wu et al. Nämligen 2 μL ROS-sond H2DCFDA från en färsk 5-mM stamlösning i DMSO tillsattes till en 1,0 ml jäståldringskultur (vid dag 2) vid 30 ° C i 1 timme. Odlingen tvättades sedan två gånger i sterilt destillerat vatten och suspenderades i 1,0 ml 50 mM Tris/Cl-buffert (pH 7,5). Tjugo mikroliter kloroform och 10 μL 0,1% (w/o)natriumdodecylsulfat (SDS) tillsattes, och cellerna inkuberades vid 200 rpm i 30 minuter för att låta färgämnet diffundera. Kulturen centrifugerades vid 5000 rpm i 5 min, och supernatantens fluorescens mättes med hjälp av en mikroplattläsare med excitation vid 480 nm och emission vid 520 nm.
4.4.Antioxidantaktivitetsanalyser
I denna studie användes DPPH, FRAP och ABTSassays för utvärdering av antioxidantkapacitet in vitro. DPPH-analysen utfördes enligt den metod som beskrivs av Barreca et al.[53]. En alikvot av varje prov (0,5 ml) blandades med 75 uM (3,5 ml) DPPHin-metanol till en slutlig volym på 4,0 ml Efter att ha reagerat i 30 minuter utan ljus detekterades absorptionen av blandningen vid en våglängd av 517 nm. Hämningsprocenten för radikal rensningsaktivitet var DPPH-värdet. FRAP-analysen utfördes enligt Hunger et al. En alikvot på 0,2 ml av provet blandades med 3,8 ml FRAP-reagens (0,3 mol/l acetatbuffert(pH3,6), 10 mmol/L TPTZ-lösning och 20 mmol/l järnklorid (FeCl3) blandades (10:1:1, volymförhållande)). Efter 30 minuter detekterades absorbansen vid en våglängd av 593 nm. Och ABTS-analysen följde metoden för Mnb et al. ABTS-radikalkatjonen (ABTS·+) genererades genom en reaktion av 176 μL kaliumpersulfatlösning (140 mM) och 10 ml vattenhaltig ABTS-lösning (7 mM) under förutsättning att inget ljus under 12-16 timmar. Därefter späddes den med metanol till ett absorptionsvärde av 0,7±0,02 enheter vid 734 nm. 0,1 ml prov tillsattes till ett 4,9 ml ABTS-reagens.cistanche tubulosa dosering redditAbsorbansen mättes vid en våglängd av 734 nm efter 10 minuters reaktion. Alla absorbansvärden bestämdes med hjälp av UV-VIS-spektrofotometern (PerkinElmer Lambda 25 UV/VIS, Waltham, MA, USA)Antioxidantvärdena beräknades med standardkurvmetoden och uttrycktes som Trolox-ekvivalenter (TE mg/g DW).
4.5 Extracellulär pH-detektion
Odlingsprocessen av jäst i det tidiga skedet var nästan densamma som den metod som beskrivs i delen av"Livslängd och jästcellstillväxtanalys". Den specifika operationen var som följer. Jästcellerna framställdes genom att överföra jäststammen från frysta lager till YPD-agarplattor. Efter inkubation av cellerna vid 30 ° C i 2 dagar plockades en enda koloni och ympades till ett 1,0 ml YPD-flytande medium i ett 10 ml steriliserat centrifugrör och odlades vid 30 ° C i 2 dagar i en platt inkubator klockan 200. Den 2-dagars YPD-kulturen späddes med autoklaverat 18 mΩ Milli-Qgrade-vatten (1∶10) och förvarades i kylskåp vid 4 ° C i 2 dagar. Efter 2 dagars inkubation vid 4 °C,10 μL(~2×104 celler) av den utspädda kulturen överfördes till 1986 μL SD-media och hölls vid 30 °C, 200 rpm i 2/10/20 dagar. Olika föreningar i DMSO (4,0 μL) tillsattes till mediet till en slutlig koncentration av 10 μM vid initial ympning (0 timmar). Därefter tillsattes 1 ml av2/10/20-dagars SD-kultur till 19 ml färskt YPD-flytande medium. PH testades var femte minut med hjälp av en pH-mätare medan jästen odlades vid 30 ° CC i en shaker vid 200 rpm för hela detekteringen. Varje experiment utfördes åtminstone i tre exemplar.
4.6.Analys av data
Rådata från mikroplattläsaren exporterades till Microsoft Excel 2007 (Redmond, WA, USA). Från tillväxtkurvorna kan jästens livskraft erhållas enligt en tidigare rapport [25]. Överlevnadsintegralen [56] för varje åldrande kultur definierades som området under överlevnadskurvorna [25,57]. Data analyserades genom envägsanalys av varians (envägs ANOVA) och uttrycktes som medelvärdena± standardfel för medelvärdet (SEM). Betydelsen av skillnad(* p<><0.01;***><0.001;*><0.0001) was="" determined="" using="" sidak's="" multiple="" comparisons="" test.="" graphpad="" prism="" 7(graphpad="" software,="" inc.,="" la="" jolla,="" ca,="" usa)was="" used="" for="" the="">
5. Slutsatser
Sammanfattningsvis visade neohesperidin, med en relativt hög kapacitet för att avlägsna intracellulär ROS, stor potential i att förlänga CLS för spirande jäst BY4742 individuellt eller synergistiskt med hesperetin. Detta kan leda till nya val för behandling av åldrande problem eftersom det fanns ett begränsat samband mellan CLS-förlängningen av jäst och de testade indexen (t.ex. ROS-rensningsförmåga, in vitro-antioxidantaktivitet och det extracellulära pH).) Ytterligare studier för att upptäcka de molekylära mekanismerna för detta fenomen kommer att vara extremt fördelaktiga för att förhindra åldrande. På grund av detta bör vikten av att välja den bästa kombinationen av flavonoider komma ihåg när man utformar nya kosttillskott eller funktionella livsmedel.
Denna artikel är extraherad från Molekyler 2019, 24, 4093; doi:10.3390/molekyler24224093 www.mdpi.com/journal/molecules
