Effektiviteten hos antioxidanter som biprodukter från kosten på inducerat uttryck av CYP-gener och histologiska förändringar hos smågrisar, lever och njure som matas med aflatoxin B1 och ochratoxin A
Feb 26, 2022
Abstrakt:Syftet med denna studie var att undersöka potentialen hos en biproduktblandning som härrör från druvfrö- och havtornsoljeindustrin för att mildra de skadliga skador som orsakas av ochratoxin A och aflatoxin B1 på lever- ochnjur-nivå hos smågrisar efter avvänjning. Fyrtio korsade TOPIGS-40 hybridgrisar efter avvänjning tilldelades tre experimentgrupper (E1, E2, E3) och en kontrollgrupp (C), och utfodrades med experimentdieter under 30 dagar. Basalien serverades som en kontroll och innehöll normalt foderblandning för startgrisar utan mykotoxiner. Experimentgrupperna utfodrades enligt följande: E1 - basal diet plus en blandning (1:1) av två biprodukter (druvfrö och havtornsmjöl); E2 – den basala kosten experimentellt förorenad med mykotoxiner (479 ppb OTA och 62 ppb AFB1); och E3 – basal diet som innehåller 5 procent av blandningen (1:1) av druvfrö- och havtornsmjöl och förorenad med blandningen av OTA och AFB1. Efter 4 veckor slaktades djuren och vävnadsprover togs från lever och njure för att utföra genuttryck och histologisk analys. Genuttrycksanalysen visade att när avvanda smågrisar utfodrades med kontaminerad diet, nedreglerades uttrycket av de flesta analyserade gener. Bland CYP450-familjen var CYP1A2 genen med högst nedreglering. Enligt dessa resultat fann vi i levern att mykotoxiner inducerade histomorfologiska förändringar i lever ochnjureoch hade en effekt på uttrycksnivån för CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1 och CYP3A29, men vi upptäckte inte viktiga förändringar i uttrycksnivån för CY4A24, MRP2 och GSTA1 gener.
Nyckelord: smågrisar; antioxidant effekt; fodertillsatser; mykotoxiner; CYPs genuttryck;njure; njur-
Introduktion
Mykotoxiner är sekundära toxiska metaboliter som produceras av vissa stammar av filamentösa svampar. Dessa lågmolekylära föreningar (upp till 500 Da) kan kontaminera en mängd olika råvaror och orsaka en ökad risk för människors och djurs hälsa [1]. Antalet mykotoxiner karakteriserade och med välkända effekter är relativt litet på grund av mängden metaboliter med toxisk potential som genereras av svampar [2-4]. De klassificeras i fem grupper, med specifika kemiska strukturer som förekommer ofta i foder och livsmedel: trichothecener, zearalenon, ochratoxiner, fumonisiner och aflatoxiner. De mykotoxinproducerande svamparna som finns i mat och foder delas in i två grupper: de som invaderar före spannmålsskörd, kallade fältsvampar, och de som växer först efter skörd, kallade lagringssvampar [5]. På europeisk nivå finns det föreskrifter och rekommendationer om den högsta tillåtna halten för sex typer av mykotoxiner som är vanliga i grisfoder: aflatoxiner, fumonisiner, ochratoxiner, deoxynivalenol, T2-toxin och zearalenon [6 – 8]. Bland husdjursarterna är grisar mycket känsliga för mykotoxiner på grund av deras exponering för spannmålsbaserat foder [9]. Svinmetabolism är inte effektivt för att avgifta och utsöndra mykotoxiner, vilket ökar risken för mykotoxikos. Denna känslighet varierar också med ålder, koncentration av mykotoxiner i foder och exponeringens varaktighet. Levern är det organ som påverkas mest av intag av dessa toxiner [10]. Dessutom ökar dessa toxiner permeabiliteten av den intestinala epitelbarriären hos svin och fjäderfä, vilket kan generera predisposition för nekrotisk enterit [11] och minskningen av medfödd immunitet.
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJURFUKTIONEN
Aflatoxiner representerar de vanligaste mykotoxinerna som finns i livsmedel, oljeväxter, spannmål, mjölk, jordar, djur och människor. Alla typer av aflatoxiner härrör från svamparter som tillhör släktet Aspergillus och anses vara bland de mest skadliga mykotoxinerna för djur och människor [4, 10 – 17]. Som nämnts ovan är de huvudsakliga biologiska effekterna av aflatoxiner hos diande smågrisar och växande, färdigbehandlade och avelsgrisar cancerogenicitet, immunsuppression, mutagenicitet, teratogenicitet, minskad utfodring och dålig viktökning, nedsatt lever och förändrade biokemiska parametrar i serum [18]. . Allvarliga effekter hos svin kan leda till akut hepatit, systemiska blödningar, nefros och död [20], samt minskad motståndskraft mot stress [21]. Vissa författare har också visat att svin som utfodrats med låga nivåer av aflatoxiner visade tecken på lungödem, minskad foderkonsumtion och kroppsviktsökning och en minskning av de enzymatiska aktiviteter som är inblandade i oxidativ dekarboxylering, såväl som totalt serumprotein, blodtryck och totalt antal leukocyter [18, 22-24]. I detta sammanhang, enligt EU-kommissionens direktiv 2003/100/EC, är den högsta tillåtna halten aflatoxin B1 (AFB1) för grisar satt till 0,02 mg/kg. Ochratoxiner är sekundära metaboliter som produceras av svamparter som tillhör släktet Aspergillus och Penicillium. Avvikande åsikter om de genotoxiska eller icke-genotoxiska mekanismerna för ochratoxintoxicitet har publicerats [25, 26]. In vitro- och in vivo-studier visade att guanin-OTA-specifika DNA-addukter kvarstod i mer än 16 dagar kl.njur-nivå, medan de i lever och mjälte avlägsnades efter 5 dagar [27]. På grund av detta utövades deras huvudsakliga toxiska och cancerframkallande effekter injure[28].
De flesta metaboliter av ochratoxiner från fas I- och fas II-avgiftning har låg toxicitet. I magen hydrolyseras en del av ochratoxiner till ochratoxin av proteolytiska enzymer. En annan möjlighet för deras hydrolys är öppningen av laktonringen under alkaliska förhållanden i tarmen, vilket resulterar i en förening med hög toxicitet. På grund av den starka bindningen till albumin är elimineringen av ochratoxiner genom glomerulär filtrering försumbar, med utsöndringen huvudsakligen genom tubulär sekretion. Den tubulära resorptionen anses vara delvis ansvarig för den intracellulära ackumuleringen av ochratoxiner [29,30]. I allmänhet, hos husdjur, absorberas ochratoxiner snabbt efter intag genom mag-tarmkanalen (magen och den proximala delen av jejunum) på ett passivt sätt, vilket gynnas av den höga affiniteten för bindning av ochratoxiner till plasmaproteiner, och i en icke-joniserad form. , vilket förklarar deras uthållighet i kroppen. I svinserum binder ochratoxiner mer specifikt till proteiner med en molekylmassa som är mindre än 20 kDa, vilket gör att de kan passera genom det glomerulära basalmembranet och utöva nefrotoxiska effekter. Ochratoxiner ackumuleras också i lever och muskler. I alla fall,njurarär huvudplatsen för lagring av ochratoxiner, med deras reabsorption vid de proximala och distala tubuli som bidrar till kroppens uthållighet och ökad nefrotoxicitet [27,31]. Å andra sidan, när AFB1 väl absorberas på tarmnivå, når den levern där den omvandlas av Fas I-metaboliserande enzymer genom hydroxylering, hydrering, demetylering och epoxidering. De första tre reaktionerna genererar icke-toxiska metaboliter, medan den fjärde producerar AFB1-8,9-epoxid som bildar addukter med DNA vid N7-stället av guanin [32]. Även AFB1 kan konjugeras med reducerat glutation i en reaktion katalyserad av glutation-S-transferaser [33] och glukuronsyra [34]. Utsöndring av AFB1 sker främst genom gallvägarna, följt av urinvägarna [35].
En av de största svårigheterna som man stöter på vid kontroll av mykotoxiner är att mer än en typ av mykotoxin finns i en sats foder eller spannmål samtidigt. Således kan utfodring av smågrisar och grisar med kontaminerat foder med flera typer av mykotoxiner, även om de är i minimikoncentrationer, orsaka många negativa konsekvenser på grund av deras synergistiska effekt [36-40]. I detta sammanhang kan en minskning och eliminering av de negativa effekterna av mykotoxiner som finns i svinfoder minska produktionskostnaderna och förlusten i grisindustrin. Hittills har många strategier utvecklats för att förhindra, minska eller till och med eliminera mykotoxinkontamination från djurfoder genom biologiska, kemiska och fysiska avgiftningsmetoder. Dessa metoder tillåter nedbrytning av mykotoxiner och deras motsvarande metaboliter och bibehåller livsmedlets näringsvärde utan att introducera andra ämnen med toxisk potential i de biologiska systemen [6,14,41]. Biologisk sanering av mykotoxiner med hjälp av kompetitiv hämning av andra svampstammar eller tillsats av antioxidantföreningar i djurfoder för att minska de toxiska effekterna av mykotoxiner och/eller hämma tillväxten av mykotoxinproducerande svamparter är en bra lösning. Den mest använda metoden för att motverka den negativa effekten av mykotoxiner på lantbruksdjur är att tillsätta "mykotoxinbindare" eller "mykotoxinmodifierare", som är aluminosilikater med en porös struktur som kan adsorbera och fånga mykotoxiner [42-44]. De är mycket effektiva mot aflatoxiner och har begränsad aktivitet mot andra typer av mykotoxiner. Men eftersom de är ospecifika binder de också vitaminer och spårämnen, vilket skapar brister [45-47]. Att lägga till några växtbaserade antioxidanter i foder kan vara en bättre lösning [48] för att minska de skadliga effekterna av mykotoxiner på djurhälsan.
P450 cytokrom enzymer, huvudsakligen närvarande i levern, tarmkanalen ochnjure,spelar en viktig roll i fas I-biotransformation av xenobiotika, särskilt de som tillhör familjerna 1 och 3 [49]. Mykotoxiner kan vara substrat, inhibitorer eller inducerare av dessa metaboliserande enzymer. Förändringar i den specifika aktiviteten och inducerbarheten av cytokrom P450 kommer i slutändan att bestämma den relativa förändringen i metabolismen av ett främlingsfientligt medel. Mykotoxiner kan förändra genuttrycket av dessa proteiner, vilket leder till en förändrad absorption och biotransformation av näringsämnen och andra substratläkemedel från foder. På grund av detta var syftet med denna studie att undersöka potentialen hos en biproduktblandning som härrör från oljeindustrin Vitis vinifera (druvfrö) och Hippophae rhamnoides (havtorn) för att mildra de skadliga skador som orsakas av den samtidiga närvaron av ochratoxin A (OTA) och aflatoxin B1 (AFB1) i foder vid levern ochnjur-nivå hos smågrisar efter avvänjning.
Resultat
DietsammansättningDen kemiska sammansättningen av biproduktmjöl visade att havtornsmjöl är rikare på protein (plus 38,4 procent), fett (plus 66,6 procent) och kolhydrater och lägre i aska än vindruvsmjöl (tabell 1).
Den kemiska analysen visade också en annan profil av de två biprodukterna i fettsyror, flavonoider, fenolsyror och mineraler. Havtornsmjölet har alltså ett högre innehåll av mättade fettsyror (palmitinsyra och palmitoleinsyra), omega-9-syror (cis-oljesyra) och omega-3-syror ( -linolensyra) än druvkärnemjölet . Däremot har druvkärnemjölet ett mycket högt innehåll av omega-6 syror (linolsyra) (67,35 procent jämfört med 18,59 procent i havtornsmjöl) (tabell 2).
Båda biprodukterna innehåller flavonoider och fenolsyror, bioaktiva föreningar kända för sina antioxidanta, antiinflammatoriska och immunmodulerande egenskaper [50, 51]. Den totala koncentrationen av polyfenoler var alltså 74,8 procent högre i druvkärnemjöl (133,84 mg GAE/L) än i havtorn (76,57 mg GAE/L). När det gäller de olika klasserna av polyfenoler innehåller vindruvsmjöl högre koncentration av katekin och vaniljsyra än havtorn, medan havtorn är rikare på rutin, quercitrin, luteolin, p-kumarsyra och ferulsyra (tabell 3). När det gäller mineralsammansättningen har havtornsmjöl en högre halt av K, Mg, Fe, Mn och Zn än vindruvsmjöl. Däremot innehöll vindruvsmjöl dubbelt så mycket koppar som havtornsmjöl. Att notera är den höga koncentrationen av järn från havtornsmjöl (tabell 4).
Djurprestanda
Exponering av smågrisar från E2-gruppen för ochratoxin plus aflatoxin B1-blandning hade inga negativa effekter på kroppsvikt, viktökning och foderintag, eftersom skillnaderna inte var signifikanta jämfört med kontrollen. Däremot ökade administreringen av dieten som innehöll biproduktblandningen enbart (E1) signifikant kroppsvikten hos smågrisar som fick denna diet jämfört med kontroll (32,14 ± 1,63 mot 27,09 ± 1,31) och till grupp E2, som matades med de kontaminerade diet (32,14 ± 1,63 mot 28,72 ± 1,07). Det bör noteras att gruppen av smågrisar som fick kontaminerat foder och blandningen av biprodukter hade en tendens att gå upp i vikt jämfört med gruppen mykotoxinberusade smågrisar, även om skillnaden inte var signifikant. Biokemiska parametrar analys, som karakteriserar det allmänna tillståndet för djurs hälsa och funktionaliteten hos lever ochnjurar, registrerade normalvärden för ålders- och viktkategorin av avvanda smågrisar. Inga signifikanta skillnader identifierades mellan grupperna för de flesta av dem (tabell 5). Mykotoxinblandningen ökade emellertid ALP- och gamma-GT-aktiviteten jämfört med kontroll och minskade aktiviteten i kontrollnivån i grupp E3 som fick biproduktblandningen.
Histologi av lever och njureLjusmikroskopisk analys av levern från E2-gruppen, matad med en basal diet kontaminerad med en blandning av OTA och AFB1, visade fokala områden av nekros, dilatation av sinusoid och inflammatorisk parenkymal infiltration. Portalområdena avslöjade mononukleär cellulär infiltration och periportal fibros. De fibrotiska perilobulära fibrotiska septa märktes också (Figur 1)
Mykotoxin administrering orsakade strukturella förändringar injurarsom påverkade både cortex och medulla. Atrofi av de glomerulära tofsarna och förändringar av Bowmann-kapseln noterades (Figur 2). Tubuli visade nekros av beklädnad av epitelceller med inflammatoriska celler infiltration däremellan. Fokala aggregat av inflammatoriska celler observerades mellan glomeruli och tubuli i samband med de fokala områdena för trängsel i blodkärlen, särskilt i märgregionen. Uppenbarligen observerades kollagenproliferationen huvudsakligen i områden med tubulär skada. Vidare,njuresektioner från E3-grupperna, gruppen som matades med en basal diet innehållande en blandning av druvfrö- och havtornsmjöl och förorenad med blandningen av OTA och AFB1, avslöjade mindre patomorfologiska förändringar, nästan liknande kontroll.
I levern minskade genuttrycket för CYP1A2 med 18 procent för E2 respektive 44 procent för E3, jämfört med E1-gruppen. CYP2A19-genuttrycket var omodifierat i grupperna E1 och E2, medan det i grupp E3 minskade med nästan 62 procent. En signifikant ökning med 29 procent observerades i CYP2E1-genuttrycket i E1-gruppen som utfodrats med en basaldiet kompletterad med en blandning av druvkärnor och havtornsmjöl jämfört med E2-gruppen. Däremot nedreglerade administrering av basal diet berikad med en blandning av druvfrö- och havtornsmjöl (E1-gruppen) CYP3A29-genuttrycket med 24 procent jämfört med E2-gruppnivån. En annan kontrast observerades i CYP4A24-genuttrycket, med en minskning med 33 procent för E1-gruppen och 24 procents minskning för E3-gruppen, och en signifikant ökning på 41 procent i E2-gruppen som matades med en basaldiet kompletterad med en blandning av AFB1 och OTA, jämfört med kontrollnivån. När det gäller MRP2 liknade genuttrycksmönstret det för CYP4A24-genen, med en obetydlig minskning på 35 procent för E1-gruppen och 24 procents minskning för E3-gruppen, och en signifikant ökning på 28 procent i E2-gruppen, jämfört med till kontrollnivån. På samma sätt som för CYP4A24-genuttrycket visade GSTA1-genuttrycket en signifikant 14-procentig ökning i E2-gruppen, en 9-procentig ökning i E1-gruppen och en 30-procentig minskning för E3-gruppen. Uppenbarligen genererade den samtidiga administreringen av blandningen av druvfrö- och havtornsmjöl och OTA och AFB1 en minskning av alla analyserade genuttryck i levern jämfört med kontroll. När det gäller uttrycksnivån för dessa gener injurar,jämfört med leverprover observerades inga statistiskt signifikanta förändringar (Figur 4). Emellertid kunde förändringar i regleringen av genuttrycksnivå observeras.
Genom att analysera figur 4 kunde det noteras att blandningen av druvkärnor och havtornsmjöl nedreglerade CYP1A2-genuttrycket och uppreglerade CYP2A19-, CYP2E1-, CYP3A29- och CYP4A24-genuttrycket på ett obetydligt sätt, medan MRP2 och GSTA1-genuttrycket förblev omodifierat. . Närvaron av OTA och AFB1 i smågrisar foder nedreglerat CYP1A2 och CYP2A19 genuttryck på ett obetydligt sätt, medan MRP2 och GSTA1 var omodifierade. Samtidig administrering av blandningen av vindruvs- och havtornsmjöl och OTA och AFB1 bestämde återgången av alla genuttrycksnivåer till kontrollnivåer med undantag för GSTA1, som gav en viktig ökning jämfört med E1-gruppen.
Diskussion
Mykotoxiner som AFB1 och OTA är naturliga toxiner som förorenar ett stort antal växtprodukter. Som en konsekvens finns AFB1, OTA och deras metaboliter i livsmedel och foder, såväl som i produkter av animaliskt ursprung [52]. De flesta av de toxikologiska studierna avseende effekterna av mykotoxiner har beaktat exponeringen för en enskild typ av mykotoxin utan att beakta kombinationen och interaktionen mellan dem respektive de synergistiska eller antagonistiska effekterna som ofta förekommer i naturen. Data om de toxiska effekterna av mykotoxinkombinationer är begränsade, så riskerna för exponering för flera typer av toxiner är fortfarande okända. Förekomsten av mykotoxiner som AFB1, DON, ZEA, OTA, FB1 och FB2 i spannmål, spannmålsprodukter och kompletterings- och helfoder för grisar [16] är relaterad till det geografiska läget och klimatförändringarna, vilket ökar risken förknippade med detta. med mykotoxinkontamination under lagring och bearbetning av foderprodukter för grisar [53]. Samkontaminering av spannmål och andra råvaror förekommer oftare i verkligheten än enstaka mykotoxinkontamination [7]. Till exempel har samtidig förekomst av aflatoxin B1 och ochratoxin A hittats i olika livsmedels- eller foderingredienser, såsom vete [54], korn [55], spannmålsmjöl [56], kryddor [57] etc. Andelen mellan AFB1 och OTA i foder visade sig vara cirka 1 till 6 [37]. Dessutom varierade det globala foderinnehållet i AFB1 och OTA mellan ej bestämt och 100 ppb och ej bestämt respektive 211 ppb [58]. I detta sammanhang, för att efterlikna fältförhållandena, studerade vi effekterna av dessa mykotoxiner tillsammans och för att bedöma biproduktmixens effektivitet för att motverka effekterna av mykotoxiner. De naturliga tillsatserna (biprodukter av druvfrö och havtorn) valdes ut utifrån deras förmåga att lindra mykotoxikos vid kosttillskott [59,60].
I den aktuella studien påverkade inte exponeringen av smågrisar (E2-gruppen) för mykotoxinblandningen djurens prestanda (27,83 ± 1,1 mot 27.09 ± 1,3 för kroppsvikt och 1,48 ± 0 .9 vs. 1,40 ± 0,8 för foderintag) och biokemiska parametrar jämfört med kontroll. På liknande sätt har Balogh et al. [61] rapporterade att smågrisar som utfodrats med cirka 0,4 mg/kg OTA under startperioden (0–28 dagar) och odlarperioden (29–49 dagar) inte registrerade signifikanta förändringar i produktionsegenskaperna och kliniska tecken på toxicitet hos odlaren. fas. Däremot observerades en signifikant minskning av kroppsviktsökningen under startperioden när djuren var mer känsliga. I denna studie hade införandet av enbart biproduktblandningen i kosten en signifikant inverkan på djurens prestanda (grupp E1) och tenderade att öka smågrisarnas vikt när blandningen var associerad med förorenad mat (grupp E3).
Ur toxikologisk synvinkel klassificeras OTA av IARC (International Agency for Research on Cancer) i samma grupp (2B) av cancerframkallande ämnen för människor, med liknande toxicitet som AFB1 [62]. Toxikokinetiska mönster för absorption, distribution och eliminering för dessa mykotoxiner är till största delen helt klarlagda. Däremot, trots de senaste framstegen, är vår kunskap om de toxikokinetiska biotransformationsstegen inte belyst i detalj. Ett antal studier har visat att AFB1 och OTA metaboliseras av levermikrosomer från människor, grisar och råttor till flera epimerer [63]. Förändringar i den specifika aktiviteten och inducerbarheten av cytokrom P450 bestämmer slutligen den relativa förändringen i metabolismen av alla främlingsfientliga medel.
Det har visat sig att exponering för AFB1 och OTA minskade genuttrycket av CYP1A2-, CYP2E1-, CYP3A29- och MRP2-gener i grislever och resulterade i flera förändringar i leverns histologi och ultrastruktur, inklusive fokala områden av nekros, dilatation av sinusoid, inflammatorisk parenkym infiltration och periportal fibros. Angående genuttrycksnivån för CYP450-isoformer i grisarnjure,inga data fanns tillgängliga i den vetenskapliga litteraturen. CYP1A2-, CYP2A19-, CYP2E1-, CYP3A29-, CYP4A24-, MRP2- och GSTA1-generna valdes för denna studie eftersom de kodar för proteiner med enzymatisk aktivitet eller transportörfunktion som är involverade i fas I och fas II av biotransformation och avgiftning av xenobiotika för att bilda elektrofila reaktiva ämnen. metaboliter [64]. Enligt dessa resultat verkar det som om administreringen av biprodukten bestämde en minskning av CYP1A2-genuttryck och en ökning av GSTA1-genuttryck. Liknande resultat noterades i HT-29 humana koloncancerceller behandlade med Salicornia freitagii-extrakt, känt för sin antioxidant och antiinflammatoriska aktivitet. I detta fall, på grund av dess innehåll i bioaktiva fenoler, inträffade en nedreglering av CYP1A2 mRNA och en uppreglering av GSTA1 mRNA [65]. I motsats till våra resultat ökade mRNA och proteinuttryck av CYP1A2 i levern hos grisar som fick cikoria [66]. Dessa olika resultat orsakades troligen av de olika naturliga föreningarna som finns i cikoria jämfört med biprodukterna som används i den föreliggande studien, främst klorogensyra, koffeinsyra och p-kumarsyra [67].
Å andra sidan interagerade förmodligen OTA och AFB1 med och aktiverade den aromatiska kolvätereceptorn, vilket ledde till dess nukleära translokation. Efter heterodimeriseringen interagerade OTA och AFB1 troligen med kolvätereceptorn nukleär translokator, heterodimeren, bunden till xenobiotiska känsliga element och transaktiverade gener som CYP1A1, CYP1A2 och GST [68]. Detta xenobiotiska-responsiva element delas mellan CYP1A1- och CYP1A2-gener [69], och de två enzymer som kodas av dem presenterar överlappande substratspecificitet [70]. I grislever finns endast CYP1A2-aktivitet, och dess relativa mängd av totalt detekterat CYP450 är 4 procent [71]. I den mänskliga levern är AFB1 och OTA inducerare för CYP1A1, 1A2, 2B6, 2C9, 3A4 och 3A5 [72]. AFB1, såväl som OTA-exponering, genererar mitokondriell dysfunktion som kännetecknas av en ökning av ROS-produktion [14] som kan öka TGF- 1-uttryck eller aktivera latent TGF- 1 [73]. Med hänsyn till de tidigare bevisen på att TGF- 1 minskade CYP1-uttryck hos människor och råttor, är det möjligt att samma mekanism [74] inträffade under våra förhållanden. Effekterna av den samtidiga exponeringen för både mykotoxiner och biprodukter från druvkärnor och havtorn var troligen synergistiska och uttrycket av CYP1A2 var lägre i E3 jämfört med E1, E2 och kontrollgruppen. CYP1A2 uttrycks i lägre nivåer i extrahepatiska vävnader [75].
CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSFULLT
Denjureär ett organ som tar emot cirka 25 procent av hjärtproduktionen och renar ämnesomsättningsrester och främlingsfientliga läkemedel från cirkulationssystemet. Under denna urladdningsprocess koncentreras giftiga ämnen injure[76]. I smågrisnjurar, var variationen av CYP1A2-genuttryck liknande med uttrycksnivåerna i levern för El och E2. Intressant nog var uttrycket av denna gen i E3-gruppen på en högre nivå än kontrollgruppen. Detta kan möjligen bero på aktiveringen av icke-kanonisk signalväg för AhR-transkription injureceller [77]. I grislever representerar de relativa mängderna CYP2A19 och CYP2E1 31 procent respektive 13 procent av totala CYP450 [71]. Porcina CYP2A19- och CYP2E1-gener är ansvariga för biotransformationen för endogena föreningar (skatol, könshormoner) såväl som exogena föreningar (födoämnen). Båda typerna av föreningar är mycket uttryckta i levern och mindre injureoch fettvävnad. CYP2A19-transkription styrs av CAR-transkriptionsfaktorn [78]. Dess mänskliga ortolog, CYP2A6, kontrolleras av CAR, PXR, glukokortikoidreceptor (GR), östrogenreceptor, HNF4 och PGC-1 [79]. Det konstitutiva leveruttrycket av CYP2A6 i möss styrs också av ett samspel mellan HNF 4 , CCAAT-box/enhancer-bindande protein (C/EBP , C/EBP ) och oktamertranskriptionsfaktor-1 (okt{{13} }) [80]. Tidigare observerades en positiv korrelation mellan mRNA- och proteinnivåer för CYP2A19-genen [81]. Till skillnad från andra CYP 450-gener spelar CYP2A19 en mindre viktig roll i xenobiotikans metabolism men är involverad i cellers reaktion på stress, Nrf-2, som också är involverad i CYP2A19-transkription [82]. CYP2A19-genen är förmodligen mycket polymorf jämfört med CYP2A6-genen [83], och en omfattande interindividuell variation av dess produkt kan förekomma. Tidigare studier visade att anka P450 ortologer av däggdjuret CYP2A6 och CYP3A4 är involverade i AFB1 bioaktivering till dess epoxidform [84]. Till skillnad från dessa resultat, i den föreliggande studien, noterades inga signifikanta förändringar av CYP2A19-genuttrycket i E1- och E2-grupperna, förmodligen på grund av den höga nivån av uttryck av denna gen i smågrislever. För närvarande är det svårt att förklara varför samtidig exponering av både mykotoxiner och blandningen av vindruvs- och havtornsmjöl minskade uttrycket av CYP2A19. Denna minskning av uttrycket minskade emellertid risken för generering av toxiska metaboliter.
I grisnjure,uttrycket av CYP2A19 är lägre jämfört med det som finns i levern [79]. Förmodligen på grund av detta lägre uttryck genererade djurexponering för blandningen av druvfrö- och havtornsmjöl en uppreglering av Nrf-2-inducerat CYP2A19-genuttryck på grund av innehållet av luteolin [85] och ferulinsyra [86] . Å andra sidan finns det bevis för att endast två transkriptionsfaktorer, dvs. kyckling-ovalbumin uppströms promotortranskriptionsfaktor (COUP-TF1) och hepatocytkärnfaktor (HNF-1), är involverade i regleringen av CYP2E1-transkription hos grisar [87]. CYP2E1, liksom andra främlingsfientliga metaboliserande P450s, är huvudsakligen belägen i membranet av det endoplasmatiska retikulumet (ER) och kan induceras under en mängd olika metaboliska eller näringsmässiga förhållanden. ER-stress kan induceras av metabol stress, som orsakas av överbelastning av protein/lipidbiosyntes, och oxidativ stress, vilket kan utlösa den evolutionärt konserverade komplexa homeostatiska signalvägen känd som det ovikta proteinsvaret (UPR) [88].
Det är troligt att nivån av CYP2E1-mRNA var ungefär densamma i E1- och kontrollgrupperna på grund av de antagonistiska effekterna av palmitinsyra [89], linolsyra och -linolensyror [90] som ökade denna gentranskription och effekterna vanillinsyra och p-kumarsyror som minskade den [65]. Nyligen bevisades det att foder som innehåller OTA förändrade tarmmikrobiotan hos ankor, vilket påverkar mångfalden och sammansättningen av blindtarmens mikrobiota samt tarmbarriären. Som ett resultat kom gramnegativa bakteriehärledda lipopolysackarider in i blodet och levern, vilket orsakade leverinflammation [91]. I fallet med immunmedierad leverskada minskade uttrycket av CYP2E1 [92]. Denna situation kan inträffa i E2-gruppen. Det är troligt att de kumulativa effekterna av de två mykotoxinerna och dietbiprodukterna minskade uttrycket av CYP2E1 i levern från E3-gruppen. I dennjure,fria fettsyror, såsom palmitat, oleat och linoleat, lagras i nefronet [93], och dessa syror ökade troligen uttrycket av CYP2E1-genen injurarav E1-gruppen jämfört med kontrollnivån. Enligt Pfohl-Leszkowicz och Manderville [25] bildar OTA addukt med DNA, vilket genererarnjur-genotoxicitet och karcinogenes. Det är troligt att höga nivåer av OTA stimulerade CYP2E1-genuttryck injurarav E2-gruppen jämfört med kontrollnivån. I E3-gruppen verkar det som om samtidig administrering av de två mykotoxinerna och dietbiprodukterna hade antagonistiska effekter, med uttrycket av CYP2E1-genen som återgick till kontrollnivån. Vidare visade histologisk utvärdering för E3-gruppen att biproduktblandningen som härrörde från druvkärne- och havtornsolja mildrade de skadliga skadorna från aflatoxin B1 och ochratoxin A på lever- ochnjur-nivå hos smågrisar efter avvänjning. CYP2E1, liksom andra xenobiotiska metaboliserande P450s, är huvudsakligen belägen i membranet av ER och kan induceras under en mängd olika metaboliska eller näringsmässiga förhållanden [89]. Regleringen av CYP2E1-genen i E1-gruppen berodde troligen på hydroxyleringen av kumarinhärledda föreningar som katalyserades av CYP2A-enzymer, vilka anses vara specifika indikatorer för närvaron av CYP2-enzymer [94], med p-kumarsyran. syra som finns i druvkärnor och havtornsbiprodukter.
När det gäller grisar är mycket lite känt om förekomsten av CYP3As-enzymer injurvävnad,och ingenting är känt om deras inducerbarhet [95]. Flera gener har identifierats i CYP3A-underfamiljen av däggdjur (till exempel fem hos råtta och fyra hos människor), men uttrycket av dessa gener injurvävnaderhar undersökts dåligt [96]. När det gäller genuttryck, Ayed-Boussema et al. (2012) [63] och Gonzalez-Arias et al. [97] beskrev en ökning av uttrycksnivåer i alla analyserade cytokromer (CYP3A4, 2B6, 3A5 och 2C9) i en primär human hepatocytkultur. Tidigare studier har rapporterat olika resultat avseende effekterna av AFB1 och OTA i primärodlade humana hepatocyter där ökande koncentrationer av dessa mykotoxiner tydligt inducerade CYP3A4- och CYP2B6-mRNA-nivåer på ett dosberoende sätt [63]. Däremot har det visat sig att i närvaro av OTA och AFB1 i levern (Figur 3, grupp E2), minskade CYP3A29-uttrycksnivån jämfört med kontrollnivån, kanske på grund av aktivering av AhR [98]. Dessa data skiljer sig från de från Zepnik et al. [99], som rapporterade en ökning av OTA-hydrolys av mikrosomala enzymer från råttlever, specifikt för P450 3A1/2 och 3A4, vilket tyder på att detta genuttryck är modulerat på ett artberoende sätt. I vissa fall kan hämningen av P450-enzymer av polyfenoler ha en kemopreventiv effekt på grund av den potentiella aktiveringen av cancerframkallande ämnen av P450-enzymer under deras naturliga metaboliska aktivitet. Hämningen av xenobiotiska metaboliserande fas I-enzymer kan vara ett mål för de kemoförebyggande effekterna av naturligt förekommande polyfenoler. Ökningen av CYP4A24 som observerats i levern kan vara ett fysiologiskt svar i det ovanliga sammanhanget av avvikande lipidackumulering och frånvaro av CYP2E1-aktivitet, på grund av det faktum att CYP2E1 och CYP4A är inducerbara levermikrosomala cytokromer P-450 involverade i hydroxylering av fett. syror, och båda kan initiera den autopropagativa processen för lipidperoxidation. De kan vara komplementära, vilket leder till interaktioner i regleringen av de individuella enzymerna [100]. Det är därför tydligt att CYP4A-proteiner är viktiga mellanhänder i ett adaptivt svar på störning av leverlipidmetabolism [101]. Den minskade CYP4A24-nivån injureleder troligen till de toxiska effekter som genereras i levern på grund av den mykotoxinförorenade kosten, vilket innebär att CYP4A24 reglerar lever ER-stress [102,103].
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÄRSMÄRTA
I den föreliggande studien ökade tillsatsen av en blandning av druvkärnor och havtornsmjöl biprodukter uttrycksnivåerna injure,vilket skulle förväntas gynna elimineringsprocesserna och upprätthållandet av balansen av intracellulära substanser [104]. Dessutom absorberades OTA i tarmen där multiläkemedelsresistensproteinet 2 (MRP2-genen) spelar en viktig roll, och fungerar som en främlingsfientlig utåttransportör för att minska den orala biotillgängligheten och toxinbelastningen till organ och därigenom OTA-toxicitet. När OTA väl når blodomloppet kan det nå andra organ som levern, och MRP2-transportören är återigen en viktig primär aktiv transportör involverad i anjoniskt konjugat och xenobiotisk extrudering in i det extracellulära utrymmet vilket bidrar till gallbildning och den efterföljande elimineringen av toxinet [ 97, 105]. MRP2-transportören finns också i de apikala membranen hos enterocyter,njure-proximala tubuli och andra celler [105]. OTA-toxicitet har tillskrivits dess isokumarindel, och det är välkänt att OTA inaktiveras eller bioaktiveras av cytokrom P450-enzymer [29]. Tidigare var förekomsten av OTA i foder kopplad till utvecklingen av nefrotoxicitet, som hos råttor har associerats mednjur-adenom ochnjuretumörer [97]. I föreliggande studie fann man en minskning av MRP2-uttryck i levern, vilket tyder på en försämring av utsöndringen av mykotoxiner i E2-gruppen.
Hos råttor observerades OTA utsöndras 15 procent mindre i de proximala tubulinjure,medan den proximala tubulära transporten av aminosyror inte var försämrad [97, 106]. Därför kan minskningen av MRP2 i levern som hittades i denna studie vara mekanismen genom vilken mykotoxiner når höga procentandelar av biotillgänglighet in vivo. På detta sätt skulle AFB1- och OTA-exponeringen för smågrisar förstoras, vilket bidrar till levertoxiciteten. Med tanke på den nefrotoxiska potentialen hos OTA och AFB1 kan minskningen av MRP2-genprodukten också ha en stor inverkan på den proximala tubuli, vilket leder till en minskad förmåga att eliminera OTA [97]. Det behövs dock ytterligare studier på AFB1- och OTA-transportmekanismen för att stödja denna hypotes. I fas II av metabolisk avgiftning konjugeras den ursprungliga främlingsfientliga föreningen eller de intermediära metaboliterna som modifierats under fas I för att vara lämpliga för utsöndring. Glutation S-transferaser (GST) och UDP-glyurosyltranferaser (UGTs) bidrar till fas II-bearbetning [107].
I närvaro av en blandning av biprodukter från vindruvsmjöl och havtornsmjöl i grisfoder, ökas GSTA1-uttrycksnivån i levern signifikant, möjligen av ett antioxidantkänsligt element (ARE) och -NF-känsligt element (-NF-RE), respektive, som i närvaro av fenoliska antioxidanter aktiverar GST-isoformerna utan behov av arylkolväte (Ah)-receptorer [108]. Överraskande nog, i studien av Ghadiri et al. (2019) [109], den AFB1-förmedlade mRNA-nedregleringen av GSTA1 observerades i kons lever i närvaro av en antioxidant. Tidigare studier [110] visade att OTA och AFB1 konkurrerar om samma CYP450-enzymer som representerar bioaktiveringsvägen för AFB1, med mindre AFB1-DNA-addukter som produceras. På grund av denna konkurrens kunde AFB1 förmodligen konjugeras med reducerat glutation i en reaktion katalyserad av GST-enzymer, med deras kodande gener som uppregleras. AFB1 kan vara involverad i andra typer av fas II-reaktioner, dvs glukuronidering och sulfatering, medan OTA huvudsakligen är konjugerat med reducerat glutation [72]. Dessutom, som svar på samtidig administrering till grisarna, ökade fodret med två mykotoxiner (AFB1 och OTA) genereringen av biomarkörerna för oxidativ stress. Därför aktiverades försvarsmekanismer, vilket främjade anpassning och överlevnad som svar på oxidativ stress [111]. Till exempel kan ROS och oxidanter aktivera transkriptionen av GST-isoformer genom ARE [108], som observerats i både levern ochnjurargenom en ökning av expressionsnivån av GSTA1-genen.
Slutsatser
Våra data avslöjade förekomsten av skillnader mellan smågrisarnjureoch lever angående reaktionen mot både mykotoxiner och biprodukter som används i denna studie. Generellt sett minskade biprodukterna med antioxidantverkan uttrycket av det analyserade CYPs mRNA i levern och ökade dem injure. I båda organen genererade samtidigt exponeringen av smågrisar för OTA och AFB1 en ökning eller en minskning av genuttryck beroende på gentypen. Inkluderandet av vindruvs- och havtornsmjöl i kosten för OTA- och AFB-1-berusade grisar minskade CYP P450-genuttrycket, vilket tyder på en minskning av bioaktiveringen av dessa mykotoxiner, vilket troligen resulterar i en minskad toxicitet i båda organen, eftersom histologiska studier har visat. Dessa fynd tyder på att avfall från druvkärnor och havtornsmjöl utgör en lovande källa för att motverka den skadliga effekten av ochratoxin A och aflatoxin B1. Även om ytterligare arbete behövs för att reda ut mekanismerna genom vilka biprodukter från vindruvskärnor och havtorn påverkar AFB1 och OTA biotransformation, och därmed genereringen av toxiska metaboliter, verkar de skyddande effekterna åtminstone delvis förmedlas av förbättringen av antioxidantförsvaret i levern ochnjurenivå.
Material och metoder
Experimentell design och provsamlingFyrtio korsade TOPIGS-40 hybrid (♀ Large White × Hybrid (Large White × Pietrain) ×♂ Talent, främst Duroc) smågrisar efter avvänjning med en genomsnittlig kroppsvikt på 9,11 ± 0.{{16 }}3 kg tilldelades tre experimentgrupper (E1, E2, E3) och en kontrollgrupp (C), inhysta i boxar (två replikat av fem grisar per box per behandling) och utfodrades med experimentdieter för 3{{19} } dagar. Foder och vatten erbjöds ad libitum under experimentet. Basaldieten serverades som en kontroll och innehöll normalt foderblandning för startgrisar utan mykotoxin (majs 68,46 procent, sojamjöl 19 procent, majsgluten 4 procent, mjölkersättning 5 procent, L-lysin 0,3 procent, DL-metionin 0,1 procent, kalksten 1,57 procent, monokalciumfosfat 0,35 procent, salt 0,1 procent, kolinförblandningar 0,1 procent och 1 procent vitamin-mineralförblandningar). Experimentgrupperna utfodrades enligt följande: E1 – basal diet plus en blandning (1:1) av två biprodukter (druvfrö- och havtornsmjöl) i en procentandel av 5 procent genom att ersätta majs- och sojamjöl; E2—den basala kosten som är artificiellt förorenad med mykotoxiner (en blandning av 62 ppb aflatoxin B1- AFB1 och 479 ppb ochratoxin A-OTA); och E3 – basal diet som innehåller 5 procent av blandningen (1:1) av druvfrö- och havtornsmjöl och förorenad med blandningen av AFB1 och OTA. Blandningen av OTA- och AFB1-mykotoxiner tillhandahölls vänligt av Dr. Boudra och Dr. Morgavi från INR A, Center of Clermont Ferrand, och framställdes genom odling av Aspergillus flavus och Aspergillus ochraceous på vete som redan beskrivits av Boudra et al. [112]. Det erhållna kontaminerade materialet införlivades i dieterna för E2- och E3-grupperna, vilket resulterade i en slutlig koncentration av 479 ppb OTA och 62 ppb AFB1. Djur från alla försöksgrupper hade fri tillgång till behandlingsfoder och vatten varje dag under försöksperioden (30 dagar). Druvfrömjölet och havtornsmjölet tillhandahölls av två lokala reklamfilmer, SC OLEOMET-SRL och BIOCATINA, Bukarest, Rumänien. Efter 4 veckor slaktades djuren med godkännande av den etiska kommittén vid National Research-Development Institute for Animal Nutrition and Biology, Balote s , ti, Rumänien (Etisk kommitté nr 118/02.12.2019) och i enlighet med Rumänsk lag 206/2004 och EU:s rådsdirektiv 98/58/EG för hantering och skydd av djur som används för försöksändamål. I slutet av experimentperioden för denna studie mättes de produktiva parametrarna, vikten och foderförbrukningen. Lever ochnjureprover uppsamlades från fyra djur per grupp och perfunderades med iskall saltlösning för att avlägsna blod. Fragment på ~50 mg från höger leverlob ochnjur-cortex (tre från varje) samlades i RNAlater Stabilization Reagent (Qiagen, Germantown, Maryland) och lagrades sedan vid -80 ◦ C fram till RNA-isoleringssteget. På grund av etiska skäl, maximering av användningen av varje djur, minimering av förlusten av djur och statistisk analys, reducerades antalet individer så mycket som det var vetenskapligt möjligt. God vetenskap och bra experimentell design hjälper till att minska antalet djur som används i alla forskningsstudier, vilket gör det möjligt för forskare att samla in data med det minsta antal djur som krävs [113].
FoderkarakteriseringFoderfoder analyserades med avseende på basal kemisk sammansättning (torrsubstans, råprotein, råfett, råfiber och aska) enligt International Standard Organizations metoder (SR ISO 6496/2001, Standardized Bulletin (2010). http://www. asro.ro (tillträde den 13 februari 2021)). Bioaktiva föreningar från biprodukter från måltider, såsom polyfenoler, fleromättade fettsyror (PUFA) och mineraler, bestämdes genom Folin-Ciocalteu-reaktion, HPLC-UV-Vis och gaskromatografi som beskrivs av författarna till [113, 114]. Antioxidantaktivitet bestämdes med DPPH-metoden som beskrivits tidigare av författarna till [115].
Analys av plasmabiomarkörerPå dag 30 samlades blodprover aseptiskt från fastande smågrisar. Markörer som återspeglar funktionaliteten hos lever (aspartattransaminas-AST, alanintransaminas-ALT, gamma-glutamyltransferas-GGT, totalt protein, alkaliskt fosfatas-AKL) och njurar (albumin, kreatinin) bestämdes efter blodcentrifugering med en bänkskiva för klinisk kemi analysator Horiba Medical—ABX Pentra 400, (Irvine, CA, USA).
LjusmikroskopiundersökningLever ochnjurebiopsier fixerades i 4 procent fosfatbuffrad formaldehydlösning, dehydrerades, klargjordes och inkluderades i paraffinblock. Sektionerna på 5 µm bearbetades rutinmässigt för hematoxylin-eosin och Gomori trichrome (Leica Biosystems, 38016SS1, Nussloch, Tyskland) respektive färgning enligt Leicas protokoll. Mikroskopiska snitt analyserades med ett Olympus BX43-mikroskop utrustat med en digitalkamera Olympus XC30. De histopatologiska förändringarna av lever ochnjuregraderades efter svårighetsgraden av lesioner som tillhörande grad 1–4, som tidigare beskrivits [116]. För lever, grad 1: Normal aspekt; grad 2: Normala hepatocyter, lätt vidgade sinusoider och trängsel; grad 3: Vakuolerade hepatocyter, dilaterade sinusoider och överbelastning; måttlig kollagenproliferation; grad 4: Nekros, inflammatoriska infiltrat, kollagenproliferation. För njure, grad 1: Normal aspekt; grad 2: Lätt tubulära/glomerulära skador, inflammation och kollagenproliferation; grad 3: Milda tubulära/glomerulära skador, inflammation och kollagenproliferation; grad 4: Markerade tubulära/glomerulära skador, inflammation och kollagenproliferation. Ett "mean assessment value" (MAV) beräknades som ett medelvärde av alla data per experimentgrupp.
RNA-isoleringIsoleringen av totalt RNA utfördes från 10 mg vävnad med användning av RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) enligt tillverkarens protokoll. Dessutom inkluderade det DNase-spjälkningssteget på kolumnen. Efter RNA-isolering gjordes alikvoter för att förhindra nedbrytning inducerad av frys-upptiningscykler. Koncentrationen och renheten av totalt RNA bestämdes med användning av NanoDrop 8000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
RNA Integrity Number (RIN)RIN-värdena för RNA-proverna bestämdes med hjälp av Agilent RNA 6000 NanoKit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) och Agilent 2100 Bioanalyzer med hjälp av tillverkarens protokoll. Prover med RIN-värden mindre än 8 inkluderades inte i ytterligare analys, och isoleringsstegen upprepades.
Omvänd transkriptionFör cDNA-syntes utsattes 1000 ng totalt RNA för omvänd transkription med användning av iScript cDNA-syntesskit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). En 4 µL reaktionsblandning och 1 µL omvänt transkriptas blandades med 1 µL RNA-prover och kompletterades med RNas-fritt vatten till en total volym av 20 µL. Den slutliga koncentrationen av RNA var 1000 ng per reaktion. Reaktionen utfördes med användning av en Veriti 96-Well termisk cykler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med följande program: En cykel på 25◦ C i 5 min, en cykel på 42◦ C i 30 min och en cykel på 85 ◦ C under 5 min. Koncentrationen och renheten av cDNA-proverna bestämdes med användning av NanoDrop 8000 spektrofotometer (Thermo Scientific).
Primer designPå grund av bristen på data angående gener involverade i hepatonefrotoxiciteten i mykotoxinexponeringen av avvanda grisar, designades primersekvenser (tabell 7) i silico med Primer3Plus [59] och verifierades av BLAST-programmet [117]. De med den högsta specificiteten för målsekvensen valdes ut för att amplifiera generna CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 och GSTA1 och tre referensgener som kodar för TATA-box-bindande protein, ribosomalt protein L4 och beta{ {19}}mikroglobulin i Sus scrofa. Glödgningstemperaturerna för primrarna bestämdes genom temperaturgradient-PCR.
Realtids PCRRealtids-PCR-reaktionen utfördes på iCycler iQ Real-Time PCR-detektionssystem (Bio-Rad) med användning av iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad). I en 96-brunnsplatta, 1 µL av 1{{10}}0 ng/µL cDNA, 12,5 µL iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad), 0,5 µL 20 pmol/µL framåtriktad primer, 0,5 µL 20 pmol/µL omvänd primer och 10,5 µL MilliQ-vatten tillsattes. Den totala volymen var 25 µL. Amplifieringsprogrammet bestod av 1 cykel på 95 ◦ C i 5 minuter, 45 cykler på 95 ◦ C i 30 s 55/56 ◦ C i 30 s, 72 ◦ C i 45 s, och 85 cykler på 55 ◦ C, med en ökning av börtemperaturen med 0,5 ◦ C per cykel under 10 s. Proverna kördes och tröskelcykelvärdena (Ct) registrerades. Smältkurvor utfördes också.
DataanalysCt-värdena bearbetades enligt "MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments" [ 118 ] med OpenOffice Calc enligt 2- ∆∆ Ct-metoden som beskrivs av Livak och Schmittgen (2001) ) [119]. Referensgenerna (TBP, RPL4 och B2M) valdes för att stabilt uttryckas över olika vävnadstyper och behandlingar på svinprover [120, 121]. Det relativa uttrycksvärdet (2 − ∆∆Ct ) erhölls genom normalisering, subtrahering av det aritmetiska medelvärdet för referensgenerna från varje gen av intresse. Medelvärdet för tekniska replikat beräknades före statistisk analys. Data illustreras som medelvärden för grupperna (n=4) ± standardfelavvikelse för medelvärdet (STDEV). Alla data analyserades statistiskt med en enkelriktad ANOVA-metod utförd med GraphPad Prism 3.03-programvaran (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Post-hoc-jämförelser mellan alla grupper kördes med Bonferroni-testet. Den statistiska signifikansen (p-värde) presenterades för alla grupper i motsats till kontrollgruppen (C).